cardiovascularКардиоваскулярная терапия и профилактикаCardiovascular Therapy and Prevention1728-88002619-0125«SILICEA-POLIGRAF» LLC10.15829/1728-8800-2025-4557DVGAAKcardiovascular-4557Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLEОптимизация протокола приготовления библиотек для секвенирования циркулирующих микроРНК плазмы и сывороткиOptimization of a library preparation protocol for sequencing circulating plasma and serum microRNAshttps://orcid.org/0000-0003-4765-8021КиселеваА. В.KiselevaA. V.

к.б.н., руководитель лаборатории молекулярной генетики Института персонализированной терапии и профилактики, в.н.с.

Петроверигский пер., д. 10, стр. 3, Москва, 101990

Petroverigsky Lane, 10, bld. 3, Moscow, 101990

sanyutabe@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-8395-4146СотниковаЕ. А.SotnikovaE. A.

с.н.с. лаборатории молекулярной генетики Института персонализированной терапии и профилактики.

Петроверигский пер., д. 10, стр. 3, Москва, 101990

Petroverigsky Lane, 10, bld. 3, Moscow, 101990

sotnikova.evgeniya@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-0723-0493ЖариковаА. А.ZharikovaA. A.

к.б.н., в.н.с. лаборатории молекулярной генетики Института персонализированной терапии и профилактики, старший преподаватель факультета биоинженерии и биоинформатики

. Петроверигский пер., д. 10, стр. 3, Москва, 101990; Ленинские горы, д. 1, Москва, 119991

Petroverigsky Lane, 10, bld. 3, Moscow, 101990; Leninskiye Gory, 1, Moscow, 119234

azharikova89@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-9844-3122КуценкоВ. А.KutsenkoV. A.

к.ф.- м.н., с.н.с. лаборатории биостатистики отдела эпидемиологии хронических неинфекционных заболеваний.

Петроверигский пер., д. 10, стр. 3, Москва, 101990

Petroverigsky Lane, 10, bld. 3, Moscow, 101990

vlakutsenko@ya.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4020-6647БорисоваА. Л.BorisovaA. L.

Руководитель лаборатории "Банк биологического материала" Института персонализированной терапии и профилактики.

Петроверигский пер., д. 10, стр. 3, Москва, 101990

Petroverigsky Lane, 10, bld. 3, Moscow, 101990

aborisova@gnicpm.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2087-6483ШальноваС. А.ShalnovaS. A.

.м.н., профессор, руководитель отдела эпидемиологии хронических неинфекционных заболеваний.

Петроверигский пер., д. 10, стр. 3, Москва, 101990

Petroverigsky Lane, 10, bld. 3, Moscow, 101990

SShalnova@gnicpm.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7989-0760ЕршоваА. И.ErshovaA. I.

д.м.н., зам. директора по фундаментальной науке, руководитель лаборатории клиномики.

Петроверигский пер., д. 10, стр. 3, Москва, 101990

Petroverigsky Lane, 10, bld. 3, Moscow, 101990

AErshova@gnicpm.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5989-6233МешковА. Н.MeshkovA. N.

д.м.н., руководитель Института персонализированной терапии и профилактики.

Петроверигский пер., д. 10, стр. 3, Москва, 101990

Petroverigsky Lane, 10, bld. 3, Moscow, 101990

ameshkov@gnicpm.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4453-8430ДрапкинаО. М.DrapkinaO. M.

д.м.н., профессор, академик РАН, директор.

Петроверигский пер., д. 10, стр. 3, Москва, 101990

Petroverigsky Lane, 10, bld. 3, Moscow, 101990

ODrapkina@gnicpm.ruФГБУ "Национальный медицинский исследовательский центр терапии и профилактической медицины" Минздрава РоссииNational Medical Research Center for Therapy and Preventive MedicineФГБУ "Национальный медицинский исследовательский центр терапии и профилактической медицины" Минздрава России; ФГБОУ ВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова"National Medical Research Center for Therapy and Preventive Medicine; Lomonosov Moscow State University202523012026241145574557Copyright © Киселева А.В., Сотникова Е.А., Жарикова А.А., Куценко В.А., Борисова А.Л., Шальнова С.А., Ершова А.И., Мешков А.Н., Драпкина О.М., 20262026Киселева А.В., Сотникова Е.А., Жарикова А.А., Куценко В.А., Борисова А.Л., Шальнова С.А., Ершова А.И., Мешков А.Н., Драпкина О.М.Kiseleva A.V., Sotnikova E.A., Zharikova A.A., Kutsenko V.A., Borisova A.L., Shalnova S.A., Ershova A.I., Meshkov A.N., Drapkina O.M.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://cardiovascular.elpub.ru/jour/article/view/4557Цель

Цель. Оптимизировать протокол приготовления библиотек для секвенирования микроРНК (малые некодирующие молекулы рибонуклеиновой кислоты) на основе коммерческого набора QIAseq miRNA UDI Library Kit для повышения качества получаемых данных.

Материал и методы

Материал и методы. Образцы плазмы и сыворотки крови четырех участников исследования были отобраны из коллекции биобанка ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России. Выделение рибонуклеиновой кислоты (РНК) проводилось для каждого образца параллельно из 200 и 300 мкл. Из каждого образца РНК с помощью набора QIAseq miRNA UDI Library Kit были приготовлены две библиотеки для секвенирования по двум вариантам протокола производителя: для 1 нг РНК с уменьшенным числом циклов амплификации и для 10 нг РНК. Секвенирование проводилось на NextSeq 550.

Результаты

Результаты. При сравнении групп образцов, приготовленных с использованием разных версий протокола, статистически значимо различались показатели тегов на млн прочтений (TPM, tags per million reads) на образец по генам человека (версия ENCODE v47) и по генам микроРНК (p<0,001).

Заключение

Заключение. Показано, что при использовании биообразцов плазмы и сыворотки крови основным параметром, влияющим на более высокие показатели секвенирования микроРНК, является уменьшение количества циклов полимеразной цепной реакции при приготовлении библиотек.

Aim

Aim. To optimize a library preparation protocol for sequencing small non-coding ribonucleic acids (microRNAs) based on the commercial QIAseq miRNA UDI Library Kit to improve the quality of the obtained data.

Material and methods

Material and methods. Plasma and serum samples from four study participants were collected from the biobank collection of the National Medical Research Center for Therapeutic and Preventive Medicine. Ribonucleic acid (RNA) was isolated for each sample in parallel, using 200 and 300 µl aliquots. Two sequencing libraries were prepared from each RNA sample using the QIAseq miRNA UDI Library Kit by two manufacturer's protocol versions as follows: one for 1 ng of RNA with a reduced number of amplification cycles and one for 10 ng of RNA. Sequencing was performed on a NextSeq 550.

Results

Results. When comparing groups of samples prepared using different protocol versions, there was a significant difference in the tags per million reads (TPM) per sample for human (ENCODE v47) and microRNA genes (p<0,001).

Conclusion

Conclusion. We showed that when using plasma and serum biosamp­les, the main parameter influencing higher microRNA sequencing rates is a reduction in the number of polymerase chain reaction cycles during library preparation.

микроРНКмалые некодирующие РНКплазмасывороткасеквенирование следующего поколенияоптимизацияmicroRNAsmall non-coding RNAplasmaserumnext-ge­ne­ration sequencingoptimizationГосударственное задание "Сво­бод­но циркулирующие микроРНК плазмы крови как диагностические и прогностические биомаркеры ИБС"State assignment "Circulating Micro­RNAs in Plasma as Diagnostic and Prognostic Biomarkers of CAD"ReferencesMatias-­Garcia PR, Wilson R, Mussack V, et al. Impact of long-term storage and freeze-­thawing on eight circulating microRNAs in plasma samples. PLoS One. 2020;15:e0227648. doi:10.1371/journal.pone.0227648.Matias-­Garcia PR, Wilson R, Mussack V, et al. Impact of long-term storage and freeze-­thawing on eight circulating microRNAs in plasma samples. PLoS One. 2020;15:e0227648. doi:10.1371/journal.pone.0227648.O’Brien J, Hayder H, Zayed Y, et al. Overview of MicroRNA bioge­ne­sis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 2018;9:402. doi:10.3389/fendo.2018.00402.O’Brien J, Hayder H, Zayed Y, et al. Overview of MicroRNA bioge­ne­sis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 2018;9:402. doi:10.3389/fendo.2018.00402.Ми­хай­лина В. И., Мешков А. Н., Киселева А. В. и др. Микро­РНК как био­маркеры ишемической болезни сердца для использования в клинической практике. Cardiovascular Therapy and Pre­ven­tion. 2024;23(12):4225. doi:10.15829/1728-8800-2024-4225.Mikhailina VI, Meshkov AN, Kiseleva AN, et al. MicroRNA as bio­mar­kers of coronary artery disease in real-world practice. Car­dio­vas­cular Therapy and Prevention. 2024;23(12):4225. (In Russ.) doi:10.15829/1728-8800-2024-4225.Киселева А. В., Сотникова Е. А., Куценко В. А. и др. Циркулирующие микроРНК и развитие коллатерального кровообращения при хронической окклюзии коронарной артерии. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2024;23(10):4190. doi:10.15829/1728-8800-2024-4190.Kiseleva AV, Sotnikova EA, Kutsenko VA, et al. Circulating micro­RNAs and collateral circulation in coronary chronic total occlusion. Cardiovascular Therapy and Prevention. 2024;23(10): 4190. (In Russ.) doi:10.15829/1728-8800-2024-4190.Wang J, Chen J, Sen S. MicroRNA as biomarkers and diagnostics. J Cell Physiol. 2016;231:25-30. doi:10.1002/jcp.25056.Wang J, Chen J, Sen S. MicroRNA as biomarkers and diagnostics. J Cell Physiol. 2016;231:25-30. doi:10.1002/jcp.25056.Chan S-F, Cheng H, Goh KK-R, et al. Preanalytic Methodological Considerations and Sample Quality Control of Circulating miRNAs. J Mol Diagn. 2023;25:438-53. doi:10.1016/j.jmoldx.2023.03.005.Chan S-F, Cheng H, Goh KK-R, et al. Preanalytic Methodological Considerations and Sample Quality Control of Circulating miRNAs. J Mol Diagn. 2023;25:438-53. doi:10.1016/j.jmoldx.2023.03.005.Сотникова Е. А., Киселева А. В., Мешков А. Н. Влияние условий хранения плазмы и сыворотки на уровни циркулирующих микроРНК. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2024;23(11):4180. doi:10.15829/1728-8800-2024-4180.Sotnikova EA, Kiseleva AV, Meshkov AN. Effect of plasma and serum storage conditions on circulating microRNA levels. Car­dio­vascular Therapy and Prevention. 2024;23(11):4180. (In Russ.) doi:10.15829/1728-8800-2024-4180.Сотникова Е. А., Киселева А. В., Мешков А. Н. Факторы преаналитического этапа, влияющие на уровни циркулирующих микроРНК плазмы и сыворотки крови. Кардиовас­кулярная терапия и профилактика. 2024;23(11):4179. doi:10.15829/1728-8800-2024-4179.Sotnikova EA, Kiseleva AV, Meshkov AN. Preanalytical factors affecting the plasma and serum levels of circulating microRNAs. Cardiovascular Therapy and Prevention. 2024;23(11):4179. (In Russ.) doi:10.15829/1728-8800-2024-4179.Suzuki K, Yamaguchi T, Kohda M, et al. Establishment of pre­ana­lytical conditions for microRNA profile analysis of clinical plasma sam­ples. PLoS One. 2022;17:e0278927. doi:10.1371/journal.pone.0278927.Suzuki K, Yamaguchi T, Kohda M, et al. Establishment of pre­ana­lytical conditions for microRNA profile analysis of clinical plasma sam­ples. PLoS One. 2022;17:e0278927. doi:10.1371/journal.pone.0278927.Androvic P, Benesova S, Rohlova E, et al. Small RNA-sequencing for analysis of circulating miRNAs: benchmark study. J Mol Diagn. 2022;24:386-94. doi:10.1016/j.jmoldx.2021.12.006.Androvic P, Benesova S, Rohlova E, et al. Small RNA-sequencing for analysis of circulating miRNAs: benchmark study. J Mol Diagn. 2022;24:386-94. doi:10.1016/j.jmoldx.2021.12.006.Coenen-­Stass AML, Magen I, Brooks T, et al. Evaluation of me­thodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biol. 2018;15:1133-45. doi:10.1080/15476286.2018.1514236.Coenen-­Stass AML, Magen I, Brooks T, et al. Evaluation of me­thodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biol. 2018;15:1133-45. doi:10.1080/15476286.2018.1514236.Hasby F, Bachmann J, Wang C, et al. Adapter dilution and input optimization for Qiagen QIAseq miRNA Library kit. bioRxiv. 2025. doi:10.1101/2025.04.30.651388.Hasby F, Bachmann J, Wang C, et al. Adapter dilution and input optimization for Qiagen QIAseq miRNA Library kit. bioRxiv. 2025. doi:10.1101/2025.04.30.651388.Benesova S, Kubista M, Valihrach L. Small RNA-sequencing: Ap­pro­aches and considerations for miRNA analysis. Diagnostics (Basel). 2021;11:964. doi:10.3390/diagnostics11060964.Benesova S, Kubista M, Valihrach L. Small RNA-sequencing: Ap­pro­aches and considerations for miRNA analysis. Diagnostics (Basel). 2021;11:964. doi:10.3390/diagnostics11060964.Barberán-­Soler S, Vo JM, Hogans RE, et al. Decreasing miRNA se­quencing bias using a single adapter and circularization ap­proach. Genome Biol. 2018;19:105. doi:10.1186/s13059-018-1488-z.Barberán-­Soler S, Vo JM, Hogans RE, et al. Decreasing miRNA se­quencing bias using a single adapter and circularization ap­proach. Genome Biol. 2018;19:105. doi:10.1186/s13059-018-1488-z.Herbert ZT, Thimmapuram J, Xie S, et al. Multisite evaluation of next-generation methods for small RNA quantification. J Biomol Tech. 2020;31:47-56. doi:10.7171/jbt.20-3102-001.Herbert ZT, Thimmapuram J, Xie S, et al. Multisite evaluation of next-generation methods for small RNA quantification. J Biomol Tech. 2020;31:47-56. doi:10.7171/jbt.20-3102-001.Wong RKY, MacMahon M, Woodside JV, et al. A comparison of RNA extraction and sequencing protocols for detection of small RNAs in plasma. BMC Genomics. 2019;20:446. doi:10.1186/s12864-019-5826-7.Wong RKY, MacMahon M, Woodside JV, et al. A comparison of RNA extraction and sequencing protocols for detection of small RNAs in plasma. BMC Genomics. 2019;20:446. doi:10.1186/s12864-019-5826-7.Heinicke F, Zhong X, Zucknick M, et al. Systematic assessment of commercially available low-input miRNA library preparation kits. RNA Biol. 2020;17:75-86. doi:10.1080/15476286.2019.1667741.Heinicke F, Zhong X, Zucknick M, et al. Systematic assessment of commercially available low-input miRNA library preparation kits. RNA Biol. 2020;17:75-86. doi:10.1080/15476286.2019.1667741.Rodgers O, Watson CJ, Waterfield T. MiRNA library preparation op­timisation for low-concentration and low-volume paediatric plasma samples. Noncoding RNA. 2025;11. doi:10.3390/ncrna11010011.Rodgers O, Watson CJ, Waterfield T. MiRNA library preparation op­timisation for low-concentration and low-volume paediatric plasma samples. Noncoding RNA. 2025;11. doi:10.3390/ncrna11010011.Копылова О. В., Ершова А. И., Покровская М. С. и др. Попу­ля­ционно-нозологический исследовательский биобанк "НМИЦ ТПМ": анализ коллекций биообразцов, принципы сбора и хранения информации. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2022;20(8):3119. doi:10.15829/1728-8800-2021-3119.Kopylova OV, Ershova AI, Pokrovskaya MS, et al. Population-­nosological research biobank of the National Medical Research Center for Therapy and Preventive Medicine: analysis of bio­samp­les, principles of collecting and storing information. Car­dio­vas­cular Therapy and Prevention. 2022;20(8):3119. (In Russ.) doi:10.15829/1728-8800-2021-3119.Smith T, Heger A, Sudbery I. UMI-tools: modeling sequencing errors in Unique Molecular Identifiers to improve quantification accuracy. Genome Res. 2017;27:491-9. doi:10.1101/gr.209601.116.Smith T, Heger A, Sudbery I. UMI-tools: modeling sequencing errors in Unique Molecular Identifiers to improve quantification accuracy. Genome Res. 2017;27:491-9. doi:10.1101/gr.209601.116.Martin M. Cutadapt removes adapter sequences from high-through­put sequencing reads. EMBnet J. 2011;17:10. doi:10.14806/ej.17.1.200.Martin M. Cutadapt removes adapter sequences from high-through­put sequencing reads. EMBnet J. 2011;17:10. doi:10.14806/ej.17.1.200.Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 2013;29:15-21. doi:10.1093/bioinformatics/bts635.Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 2013;29:15-21. doi:10.1093/bioinformatics/bts635.Danecek P, Bonfield JK, Liddle J, et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. GigaScience. 2021;10:giab008. doi:10.1093/gigascience/giab008.Danecek P, Bonfield JK, Liddle J, et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. GigaScience. 2021;10:giab008. doi:10.1093/gigascience/giab008.Liao Y, Smyth GK, Shi W. featureCounts: an efficient general pur­pose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 2014;30:923-30. doi:10.1093/bioinformatics/btt656.Liao Y, Smyth GK, Shi W. featureCounts: an efficient general pur­pose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 2014;30:923-30. doi:10.1093/bioinformatics/btt656.ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 2012;489:57-74. doi:10.1038/nature11247.ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 2012;489:57-74. doi:10.1038/nature11247.Wickham H. Ggplot2: Elegant graphics for data analysis. New York, NY: Springer; 2009. ISBN: 978-0-387-98141-3.Wickham H. Ggplot2: Elegant graphics for data analysis. New York, NY: Springer; 2009. ISBN: 978-0-387-98141-3.Grieco GE, Sebastiani G, Fignani D, et al. Protocol to analyze circulating small non-coding RNAs by high-throughput RNA se­quencing from human plasma samples. STAR Protoc. 2021;2: 100606. doi:10.1016/j.xpro.2021.100606.Grieco GE, Sebastiani G, Fignani D, et al. Protocol to analyze circulating small non-coding RNAs by high-throughput RNA se­quencing from human plasma samples. STAR Protoc. 2021;2: 100606. doi:10.1016/j.xpro.2021.100606.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.