Несмотря на огромное количество научных исследований, посвященных изучению роли цитокинов, хемокинов и факторов роста в норме и при различных заболеваниях, долгое время диагностическая ценность определения системных уровней большинства этих маркеров не была очевидна. Сложность комплексной оценки цитокинового статуса заключается в том, что изменения концентраций тех или иных аналитов не являются специфичными для отдельных заболеваний и состояний [1]. Кроме того, описана широкая вариабельность спонтанной и индуцированной продукции цитокинов, связанная с генетическими полиморфизмами кодирующих их генов [2]. В клинической практике преимущественно применяют результаты количественных тестов на основные провоспалительные цитокины: фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-α) и интерлейкины (ИЛ) 6 и 8 (ИЛ-6 и ИЛ8). В последнее время в связи с распространением новой коронавирусной инфекции COVID-19 (COrona VIrus Disease 2019) широкое распространение получило определение уровня ИЛ6, отражающего наличие и тяжесть основного летального осложнения COVID-19 — цитокинового шторма.

Из-за отсутствия практики массового определения большинства цитокинов, хемокинов и факторов роста, тест-системы, одобренные для клинического применения, малочисленны. Соответственно, не установлены и интервалы нормальных значений. Определение референтных интервалов требует наличия большой выборки условно-здоровых доноров [3]. Биобанки могут являться удобным и надежным источником биоматериала для данного типа исследований. Практика получения охарактеризованного материала из репозиториев может значительно уменьшать количество временных, человеческих и материальных ресурсов, необходимых при формировании выборок.

Цель настоящей работы — определение референтных интервалов концентраций 38 цитокинов, хемокинов и факторов роста, а также измерение содержания исследуемых аналитов у пациентов с нейродегенеративными и сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) с использованием биоматериала из репозитория биобанка.

Для определения концентраций цитокинов, хемокинов и факторов роста использовали замороженную сыворотку и плазму крови из коллекции биобанка Санкт-Петербургского государственного бюджетного учреждения здравоохранения (СПб ГБУЗ) "Городская больница № 40". Документы в рамках научно-исследовательского проекта "Биобанкирование и биомедицинские исследования образцов тканей и жидкостей человека" были одобрены Экспертным советом по этике СПб ГБУЗ "Городская больница № 40" на заседании № 119 от 09 февраля 2017г. У всех участников исследования было получено письменное информированное добровольное согласие на помещение их биоматериала в биобанк с последующим использованием в научных целях.

Пациенты были разделены на три группы согласно основному диагнозу: группа пациентов с нейродегенеративными заболеваниями (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз), группа пациентов с ССЗ и условно-здоровые испытуемые доноры. Каждая группа далее была разделена на подгруппы по возрастному критерию: (1) молодые пациенты 18-35 лет, (2) взрослые пациенты 36-64 лет, (3) пациенты старшего возраста от 65 лет. Подробно половозрастная структура выборок представлена в таблице 1.

Определение концентрации аналитов в биообразцах осуществляли с использованием панелей реагентов для одновременного определения 38 человеческих цитокинов, хемокинов и факторов роста Human Cytokine/ Chemokine Magnetic Bead Panel 1 (Merck, Millipore) согласно инструкции производителя. Для детекции результата использовали оборудование для мультиплексного анализа MAGPIX (Luminex). Полный список определяемых аналитов представлен в таблице 2.

Для проверки гипотезы о нормальном распределении данных использовался тест Шапиро-Уилка; показано, что характер распределения исследуемых данных не соответствовал нормальному распределению.

Для выявления межгруппового различия (как между возрастными группами, так и между группами заболеваний) в уровнях концентрации исследуемых аналитов использовался однофакторный дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса, в качестве post hoc анализа использовался тест Данна с поправкой Бонферрони для множественных сравнений.

Для группы условно-здоровых испытуемых был вычислен непараметрический 95% референтный интервал с 90% доверительным интервалом. Для исключения выбросов использовалось расстояние Кука, для вычисления референтного интервала использовался бутстреппинг.

Результаты представлены в виде медианы и интерквартильного размаха [Me (Q25-Q75)]. Статистический анализ и графическая презентация данных осуществлены при помощи языка программирования R версии 4.0.3 (https://www.R-project.org/).

Во всех образцах, полученных от включенных в исследование пациентов, были определены концентрации 38 цитокинов, хемокинов и факторов роста (таблица 3). Для большинства определяемых аналитов различий в зависимости от пола и возраста выявлено не было. У практически здоровых доноров >65 лет концентрация макрофагального воспалительного белка 1 альфа (Macrophage inflammatory protein-1-α, MIP-1α) была ниже (p<0,05), а уровни ИЛ-8 (p<0,05) и хемокина 10 (Interferon-inducible protein 10, IP-10) выше (p<0,05 и p<0,01, соответственно), чем в остальных возрастных группах. У доноров молодого возраста (18-35 лет) наблюдался более низкий в сравнении с прочими возрастными группами уровень ФНО-α (p=7,6×10-4).

На базе измеренных концентраций в группе условно-здоровых доноров были рассчитаны непараметрические 95% референтные интервалы с 90% доверительным интервалом (таблица 4). В группах пациентов с нейродегенеративными заболеваниями и ССЗ обнаружены множественные отклонения от вычисленных референтных значений. Наиболее значимые отличия наблюдаются для некоторых ИЛ и хемокинов. Например, в группе пациентов с нейродегенеративными заболеваниями уровень ИЛ-12 оказался выше, чем у условно-здоровых доноров и пациентов с ССЗ (p<0,0001). У условно-здоровых доноров обнаружены более высокие концентрации ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5 (p<0,0001 для всех случаев) и ИЛ-7 (p=0,0043). У пациентов с ССЗ в сравнении с условно-здоровыми лицами определяются более низкие (p<0,0001) концентрации макрофагального воспалительного белка 1-бета (MIP-1β). В старшей возрастной группе пациентов с ССЗ в сравнении с пациентами с нейродегенеративными заболеваниями и условно-здоровыми донорами наблюдаются более низкие (p<0,0001) уровни моноцитарного хемотаксического белка 1 (Monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1).

Среди всех способов определения концентраций цитокинов мультиплексное обнаружение привлекательно своей высокой пропускной способностью, а также возможностью комплексно оценивать изменения в сложной сети цитокинов [4]. Важно отметить, что данные, полученные с применением разных тест-систем, могут в значительной степени различаться. Например, значительные различия в концентрациях некоторых аналитов можно найти при сравнении полученных в настоящем исследовании референтных интервалов и концентраций 17 цитокинов и хемокинов, определенных тем же методом, но с использованием реагентов и оборудования другого производителя [5]. Крупное исследование по сопоставимости данных концентраций 18 цитокинов и хемокинов, проведенное с использованием мультиплексных панелей от 4 различных производителей, также показало, что получаемые данные значительно разнятся при использовании материалов разных производителей. При этом межлабораторная воспроизводимость остается высокой, а дисперсия при использовании разных серий реагентов — минимальной [6]. Сравнение результатов определения концентраций ФНО-? и интерферона гамма (IFN-γ), измеренных с использованием разных методик, также продемонстрировало, что в зависимости от применяемой технологии получаемые значения могут значительно различаться [7].

Обнаруженные возрастные особенности концентраций MIP-1α, ИЛ-8, IP-10 и ФНО-α в рамках обследованной выборки не противоречат другим исследованиям. В работе ученых из Корейской Республики концентрация цитокинов у различных групп (65+ и 40-) имеет возраст-зависимый характер [8]; в другом исследовании выявляют линейный рост концентрации ИЛ-6 и ФНО-α с возрастом испытуемых [9]. Существуют доказательства того, что у детей разного возраста также отмечаются изменения уровня концентрации провоспалительных цитокинов [10][11]. В целом секреция многих из исследуемых аналитов зависима от возраста здорового организма; результаты настоящего исследования помогут определить, проявляется ли возрастная зависимость в патологических состояниях.

Наличие большого количества отклонений от референтных значений концентраций аналитов в группах пациентов с нейродегенеративными и ССЗ, а также высокая дисперсия значений внутри этих групп полностью соответствует современным представлениям о неспецифической роли цитокинов в патогенезе множества состояний, в т.ч. при болезни Альцгеймера [12], рассеянном склерозе [13], атеросклерозе, инфаркте миокарда, ишемической болезни сердца [14].

Интересно, что еще относительно недавно считалось, что в норме большинство цитокинов в крови здоровых доноров отсутствуют. В настоящее же время присутствие практически всех этих соединений можно обнаружить, хоть и в небольших концентрациях. Это объясняется не только повышением чувствительности современных методик, но и повышением требований к преаналитическому этапу [7]. Именно на преаналитическом этапе из-за нарушений техники и временных рамок забора, транспортировки, процессинга и хранения биоматериала может происходить как стимуляция клеток крови, индуцирующая выброс цитокинов, хемокинов и ростовых факторов, так и распад белковых молекул под действием протеаз. Использование замороженного биоматериала из биобанков позволяет избежать сложностей, связанных с организацией преаналитического этапа, поскольку весь материал в коллекции соответствует единым требованиям. Все отклонения от стандартных протоколов документируются и могут быть учтены при формировании экспериментальных выборок. Составление выборки для подобного исследования требует как сбора подробного анамнеза пациентов для исключения сочетанных и сопутствующих заболеваний, так и формирования достаточно большой группы исследуемых пациентов. На настоящий момент общемировой практикой является привлечение биобанков для сбора биоматериала и выбора необходимой группы испытуемых. Будущее развитие биобанкирования позволит проводить исследования, масштаб которых был невозможен ранее.

Определенные референтные интервалы могут быть использованы при измерении уровней цитокинов, хемокинов и факторов роста в сыворотке и плазме крови с помощью панели реагентов Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel 1 (Merck, Millipore) на приборе MAGPIX и не подразумевают прямого трансфера на иные аналитические методики.

Благодаря наличию полной информации о состоянии здоровья доноров и истории транспортировки, процессинга и хранения образцов, биобанки являются надежным источником биоматериала для определения референтных интервалов в тех случаях, когда тест-система позволяет использовать замороженный биоматериал.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.