Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) представляют собой мультипотентные стволовые клетки, которые могут дифференцироваться в лимфоидные и миелоидные клетки-предшественники, давая начало лейкоцитам, эритроцитам и тромбоцитам. Трансплантация ГСК является одним из наиболее широко используемых методов клеточной иммунотерапии. Используют ее для лечения онкологических, а также гематологических и аутоиммунных заболеваний.

Выделяют две основные формы трансплантации ГСК:

Множественная миелома и лимфома являются основными показаниями для аутотрансплантации, острый миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, миелодисплатический синдром и миелопролиферативные новообразования — для аллотрансплантации [3]. Проведение трансплантации ГСК также может быть использовано для лечения некоторых сóлидных опухолей, таких как герминогенные опухоли, нейробластомы [4], саркома Юинга [5] и медуллобластома [6].

Трансплантация ГСК представляет собой многоэтапную процедуру, включающую сбор ГСК периферической крови, проведение химиолучевого лечения с последующей инфузией ГСК с целью восстановления ростка кроветворения. Аутотрансплантация ГСК позволяет реципиенту оправиться от аплазии костного мозга, которая неизбежно следует за высокодозной терапией, поэтому аутотрансплантацию следует рассматривать как форму спасательной терапии таких пациентов.

ГСК, используемые в трансплантации, могут быть получены из костного мозга, пуповинной или периферической крови [7]. Трансплантаты пуповинной крови содержат меньшее количество ГСК, чем трансплантаты, полученные из костного мозга или периферической крови, поэтому восстановление иммунитета при их применении, как правило, медленное. Кроме того, использование пуповинной крови ассоциировано с более высоким риском развития инфекционных осложнений и смерти в раннем посттрансплантационном периоде [8][9].

Костный мозг, изъятый из гребня подвздошной кости, был первым источником ГСК. Материал получали в операционной под местной анестезией. Развитие эффективных и безопасных методов мобилизации ГСК сдвинуло приоритет в сторону использования ГСК, выделенных из периферической крови [10]. Периферическая кровь — предпочтительный источник ГСК, используемых для трансплантации, поскольку позволяет регулярно собирать материал для трансплантации, избегая общей анестезии и распространенных осложнений, которые наблюдаются при взятии костного мозга. Использование трансплантатов, полученных из периферической крови, ассоциировано с меньшим количеством рецидивов, но с более высоким риском развития реакции "трансплантат против хозяина" у пациентов, перенесших аллогенную трансплантацию [11]. С последним фактом, вероятно, связано снижение общей выживаемости пациентов после использования ГСК из периферической крови, в сравнении с ГСК, изъятыми из костного мозга [12].

Восстановление иммунитета влияет на клиническое течение опухолевой болезни, вероятность развития рецидива и общую выживаемость онкологических больных. Поэтому справедливо считать, что скорость восстановления иммунитета играет ключевую роль в успехе трансплантации ГСК. В работе Sugiyanto M, et al. (2023), посвященной анализу способности ГСК, выделенных из различных источников, к восстановлению иммунитета, было показано, что среди трех ранее перечисленных источников ГСК, именно использование ГСК периферической крови ассоциируется с более высокой скоростью восстановления нейтрофилов [13].

Без криоконсервации ГСК обычно хранятся при температуре 2-6º C не >72 ч и в основном используются для аллотрансплантаций или аутотрансплантаций у пациентов с множественной миеломой или лимфомой. В случаях возникновения у реципиента осложнений, трансплантация ГСК может задерживаться на >72 ч, в связи с чем необходимо проведение процедуры криоконсервации образцов [14]. Криоконсервация ГСК значительно продлевает срок их хранения и позволяет проводить более строгий контроль качества и тестирования образцов на различные маркеры, что сопровождается повышением безопасности трансплантации. Кроме того, долгосрочное хранение обеспечивает решение различных логистических задач, таких как соблюдение временнóго интервала между сбором ГСК, высокодозной терапией и последующей инфузией продукта пациенту.

Цель настоящего обзора — анализ литературы, посвященной изучению влияния различных способов криоконсервации ГСК периферической крови человека на сохранение жизнеспособности клеток после размораживания, а также развитие нежелательных явлений у пациентов.

Представлен несистематический обзор зарубежных и отечественных публикаций, находящихся в базах PubMed, Science Direct, Google Scholar и eLibrary с использованием ключевых слов: криоконсервация, cryopreservation, криопротектор, cryoprotectant, диметилсульфоксид, ДМСО, Dimethyl Sulfoxide, DMSO, аутологичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, autologous hematopoietic stem cell transplantation, аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, allogeneic stem cell transplantation, а также их комбинаций. Глубина поиска составила 20 лет. Также в данный обзор было включено несколько источников старше 20 лет, имеющих фундаментальное значение. Была проанализирована информация, представленная в оригинальных исследованиях и обзорах литературы, всего 58 источников.

В настоящее время периферическая кровь является наиболее часто используемым источником ГСК для проведения как аутотрансплантаций, так и аллотрансплантаций. Аферез используется для сбора мобилизованных ГСК из периферической крови после введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора отдельно либо в сочетании с препаратами, способствующими пролиферации и миграции таких клеток из костного мозга в периферическую кровь. В сравнении с трансплантатом ГСК, полученным из костного мозга, трансплантат с использованием ГСК периферической крови обладает преимуществами более быстрого восстановления лейкоцитов у реципиента и более низкой частоты отторжения трансплантата.

Процедуру трансплантации ГСК условно можно разделить на следующие этапы:

Криоконсервация ГСК сопряжена с рядом проблем, в первую очередь, со снижением жизнеспособности клеток после оттаивания и побочными реакциями у пациентов из-за используемых криопротекторов. Процедура криоконсервации включает в себя несколько этапов. На первом этапе проводят расчет необходимого количества раствора криопротектора, который впоследствии будет добавлен к ГСК. После чего ГСК с криопротектором переносят в контейнер для криоконсервации, тщательно удаляют пузыри воздуха. Далее следует процесс заморозки и хранения биоматериала в емкости с парами жидкого азота.

Важный параметр, который необходимо учитывать при трансплантации ГСК периферической крови — количество введенных CD34+ клеток. Принято считать, что количество CD34+ клеток, превышающее 2,0×10⁶ клеток/кг массы тела реципиента на момент сбора ГСК, является надежным предиктором успешного приживления нейтрофилов и тромбоцитов. Традиционно подсчет количества CD34+ клеток происходит перед криоконсервацией, следовательно, количество клеток после оттаивания не учитывается. В работе D’Rozario J, et al. (2014) оценивали количество CD34+ клеток во время сбора ГСК и после оттаивания, а также анализировали приживление нейтрофилов и тромбоцитов после проведения процедуры трансплантации ГСК. Было показано, что средняя потеря количества жизнеспособных CD34+ клеток при обработке и криоконсервации составляет ~33% от исходного количества. Однако низкое количество жизнеспособных CD34+ клеток, введенное после оттаивания, по-прежнему приводит к приживлению нейтрофилов, но может влиять на скорость приживления тромбоцитов [16].

Несмотря на то, что предиктором успешного приживления принято считать количество введенных CD34+ клеток, значительная потеря CD3+ клеток также может быть клинически значимой, поскольку инфузия недостаточного количества CD3+ клеток при аллотрансплантации может ухудшить предполагаемый эффект "трансплантат против лейкемии" [17]. В работе Araujo AB, et al. (2021) проведена оценка влияния концентрации клеток, а также процессов криоконсервации и оттаивания на жизнеспособность и функциональность ГСК. Было показано, что продолжительность хранения, а также концентрация ядросодержащих клеток оказывали негативное влияние на жизнеспособность CD45+ и CD34+ клеток, а также их функциональную активность [18].

Помимо клеточного состава трансплантата при проведении процедуры криоконсервации важно учитывать условия пробоподготовки. Поскольку при добавлении диметилсульфоксида (ДМСО) к ГСК происходит экзотермическая реакция, существует опасение, что высвобождение энергии может спровоцировать повреждение клеток. Dijkstra-Tiekstra MJ, et al. (2014) провели исследование с использованием предварительно охлажденного ДМСО, а также с использованием предварительно охлажденного лейкоконцентрата. Было показано, что предварительное охлаждение оказывает минимальное влияние на скорость восстановления лейкоцитов [19].

После криоконсервации наблюдаются высокие уровни апоптотических клеток CD34+ (до 30%), что коррелирует со сниженной способностью к приживлению, замедленным восстановлением нейтрофилов после аутотрансплантации ГСК [20]. Точные механизмы криоповреждения, приводящие к потере жизнеспособности криоконсервированных клеток остаются малоизученными. Существуют два механизма негативного воздействия замораживания/оттаивания на клетки: (1) механическое повреждение клеточных мембран кристаллами льда при замораживании; (2) осмотическое повреждение клеток вследствие резкого увеличения концентрации растворенных веществ в оставшейся жидкой фазе при оттаивании. Принято считать, что значительное влияние на жизнеспособность клеток оказывают две переменные: скорость охлаждения трансплантата и концентрация криопротектора. При быстром замораживании клетки замерзают до того, как произойдет выравнивание осмотического давления. Это связано с ограниченной пропускной способностью клеточных мембран, что приводит к образованию внутриклеточного льда, вызывающего механическое повреждение клеток. Поэтому существует некоторая выживаемость клеток при оптимальной скорости охлаждения, которая обеспечит сохранность ГСК [21]. Замораживание с контролируемой скоростью является наиболее распространенным методом криоконсервации. Однако данный способ является сложной, длительной и финансово затратной процедурой. Поэтому активно растет интерес к процессу замораживания с неконтролируемой скоростью с использованием стандартных морозильных камер, который можно легко адаптировать в условиях ограниченных ресурсов. Тем более, что консервация с неконтролируемой скоростью не приводит к существенному снижению эффективности трансплантации ГСК периферической крови [22]. С целью изучения и проверки более простых и экономичных способов заморозки ГСК, Calvet L, et al. (2012) провели клиническое исследование 342 аутотрансплантантов после хранения в течение 3, 6 и 12 мес. при температуре -80º С. У наблюдаемых пациентов отмечалось успешное приживление трансплантантов и восстановление кроветворения [23]. В работе Detry G, et al. (2014) также было установлено, что на восстановление кроветворения длительное (>1 года) хранение трансплантата при температуре -80º С негативного влияния не оказывало [24].

К повреждению ГСК приводит не только слишком быстрая заморозка, но и слишком медленное оттаивание, что связывают с расстеклованием и рекристаллизацией воды с последующим механическим повреждением мембран клеток. Однако это только гипотеза, поскольку почти ничего неизвестно о возможной роли биомолекул в механизмах повреждения клеток, появляющихся в процессе оттаивания [25].

Негативное влияние на жизнеспособность и состав ГСК способны оказывать и криопротекторы, поэтому актуальным остается вопрос поиска новых криопротекторов с минимальными побочными эффектами. Наиболее часто используемым криопротектором является ДМСО. Помимо ДМСО криопротекторными свойствами обладают глицерин, этиленгликоль, пропиленгликоль, поливинилпирролидон, полиэтиленоксид, гидроксиэтиленкрахмал. Однако, в силу различных причин, эти вещества не нашли активного применения в рутинной практике [26].

Процедура криоконсервации ГСК характеризуется высокой неоднородностью между различными учреждениями. Отличия касаются многих факторов, которые способны повлиять на качество ГСК после оттаивания. Особенно пристальное внимание уделяется конечной концентрации ДМСО. Предполагается, что состав разбавителя ДМСО может потенциально оказывать влияние на качество трансплантата, однако, в отношении ГСК периферической крови, данный вопрос широко не исследовался. Сильно могут различаться и используемые в процедуре криоконсервации растворы криопротекторов.

ДМСО представляет собой небольшую амфифильную молекулу с гидрофильной сульфоксидной группой и двумя гидрофобными метильными группами, обладающую сродством как к полярным, так и к неполярным растворителям. Амфифильная природа ДМСО является, по-видимому, важной определяющей характеристикой его действия на мембраны. Ключевой аспект механизма действия ДМСО — способность вызывать образование пор в мембранах клеток, чем объясняется значительное повышение их проницаемости для гидрофильных молекул. Поскольку ДМСО легко проникает через мембраны, его активно используют в качестве криопротектора. В исследовании Gurtovenko AA и Anwar J (2007) было показано, что выбор концентрации ДМСО имеет решающее значение. Авторами было рассмотрено 14 различных молярных концентраций ДМСО от 0 до 100%. Было показано, что ДМСО оказывает различное действие на клеточные мембраны в зависимости от его концентрации. При концентрации <10% ДМСО приводит к значительному латеральному расширению мембраны с одновременным уменьшением ее толщины. При концентрации ДМСО в диапазоне 10-20% наблюдается образование пор в дополнение к прогрессирующему истончению мембраны. Дальнейшее увеличение концентрации ДМСО приводит к десорбции отдельных молекул липидов с поверхности мембраны с последующим разрушением ее бислойной липидной структуры [27]. Кроме того, нарастание количества молекул ДМСО в растворе снижает температуру его замерзания [28].

Как правило, конечная концентрация ДМСО при криоконсервации ГСК составляет 10%. Однако несмотря на то, что протоколы использования данного криопротектора в биологии и медицине уже давно разработаны и активно внедрены в практику, определение оптимальной концентрации ДМСО во многом обусловлено эмпирическим подходом.

Непосредственно перед трансплантацией клеточный продукт размораживают на водяной бане при температуре 37º C. Трансплантация размороженных ГСК часто сопровождается развитием у пациентов побочных реакций. Общие побочные реакции, вызываемые ДМСО, включают тошноту, рвоту, боли в животе. Они имеют место у 50% пациентов. Реже сообщается о побочных эффектах со стороны сердечно-сосудистой системы в виде гипертонии и аритмии, а также со стороны дыхательной системы с остановкой дыхания и диффузным альвеолярным кровотечением [29]. Эти эффекты могут быть обусловлены не только непосредственным действием ДМСО, но и высвобождением гистамина, индуцированным ДМСО; при этом механизмы некоторых сердечно-сосудистых побочных эффектов могут быть многофакторными [30].

Побочные реакции со стороны центральной нервной системы, такие как эпилептические припадки, инсульт, временная лейкоэнцефалопатия, бывают еще реже [31][32]. Предполагается, что в основе патофизиологии подобных процессов лежит острая вазоконстрикция или прямое проникновение ДМСО через гематоэнцефалический барьер и прямое токсическое воздействие на мозг [33].

Несмотря на то, что токсическая доза ДМСО для человека не определена, считается, что тяжесть оказываемого токсического влияния на мозг и другие органы связана с количеством ДМСО, присутствующим в трансплантате, а также со скоростью его введения. Принято считать, что максимальная рекомендуемая доза ДМСО для введения за один сеанс составляет 1 г/кг массы тела пациента или 10 мл/кг 10% раствора ДМСО. Когда объем для инфузии превышает данный предел, следует разделять трансплантат на две или три части с интервалом между введениями в несколько часов или дней с целью уменьшения токсического действия ДМСО [34]. В работе González-López T, et al. (2011) описывается случай развития ишемического инсульта во время инфузии аутотрансплантата ГСК, криоконсервированного с использованием ДМСО, несмотря на то что максимальная рекомендуемая доза вводимого ДМСО не была достигнута. Предполагается, что токсичность ДМСО может быть идиосинкразической [35].

Помимо дробления дозы на несколько частей, еще одним способом уменьшения побочных реакций на введение трансплантата с ДМСО является использование более низких концентраций криопротектора. В работе Mitrus I, et al. (2013) исследовали влияние концентрации ДМСО (10, 7,5 и 5%) на приживление трансплантата и частоту побочных явлений у пациентов. Установлено, что самая низкая частота побочных реакций наблюдалась в группе пациентов, получавших трансплантат с 5% ДМСО [36]. Концентрация ДМСО 7,5% благоприятно сказывалась на скорости восстановления лейкоцитов [37], тогда как при концентрации ДМСО 10% восстановление ядерных клеток и клоногенного потенциала клеток снижалось [38].

Одним из способов уменьшения общего объема, переливаемого ДМСО с целью снижения риска нежелательных явлений, является промывание трансплантата после оттаивания физиологическим раствором с последующим добавлением антикоагулянта, в качестве которого выступает цитрат декстрозы. Однако такой подход трудозатратен и связан со значительной потерей жизнеспособных клеток CD34+, что приводит к увеличению времени восстановления тромбоцитов после трансплантации [39][40]. Таким образом, несмотря на то что предварительное удаление ДМСО из трансплантата может снизить частоту возникновения побочных реакций у пациентов, данная процедура создает риск повреждения трансплантата. Кроме того, вследствие увеличения количества манипуляций с трансплантатом увеличивается риск его контаминации.

Некоторые учреждения используют ДМСО, разведенный 5% сывороточным альбумином человека в 0,9% растворе хлорида натрия (NaCl). Данная процедура позволяет предотвратить осмотический шок клеток, а также снизить количество выделяемого тепла при смешивании клеток трансплантата с неразбавленным раствором ДМСО. В то же время, поскольку современная практика работы с коммерческими препаратами сывороточного альбумина человека по-прежнему связана с высоким риском контаминации, в качестве альтернативной замены Smagur A, et al. (2015) [41] предлагают использовать аутологичную плазму, получаемую в ходе процедуры лейкафереза. Данная процедура позволяет проводить приготовление криозащитной среды "в закрытой системе". При этом важно учитывать, что в случае использования аутологичной плазмы, содержание белка в криоконсервирующем растворе может быть вариабельным из-за различной концентрации альбумина и других белков плазмы. В своей работе авторы поставили цель оценить качество трансплантата и скорость его приживления при использовании криозащитного раствора с аутологичной плазмой. Результаты исследования показали, что медиана восстановления ядерных клеток и колониеобразующих единиц (КОЕ) не различались между криозащитными смесями с аутоплазмой и сывороточным альбумином человека. По клинической оценке, среднее время восстановления лейкоцитов, тромбоцитов и нейтрофилов было сопоставимо в обеих группах [41].

Наиболее важным фактором, связанным с восстановлением гемопоэза, считается количество введенных CD34+ клеток [42][43]. Ряд переменных в процессе криоконсервации может влиять на качество и количество жизнеспособных CD34+ клеток в трансплантате, в частности, общее количество ядерных клеток, количество лейкоцитов, криопротектор, условия процессов замораживания/оттаивания, продолжительность хранения [44]. Имеется ряд исследований, посвященных оценке влияния ДМСО на жизнеспособность ядерных клеток, восстановление CD34+ клеток, количество жизнеспособных CD34+ клеток, клеток, находящихся в состоянии апоптоза после оттаивания, а также клоногенный потенциал ГСК. Veeraputhiran M, et al. (2010) в результате анализа 262 образцов ГСК, замороженных с использованием 5 и 10% ДМСО, методом проточной цитометрии показали, что статистически значимая разница в жизнеспособности CD34+ клеток между группами отсутствует, как не было различий и в жизнеспособности в зависимости от периода криохранения, а также времени приживления лейкоцитов и тромбоцитов [45]. В работе Abrahamsen JF, et al. (2002) оценивали изменения жизнеспособности, апоптоза, а также некроза CD34+ клеток, криоконсервированных в 5 и 10% растворах ДМСО. Образцы подвергали криоконсервации с контролируемой скоростью с последующим хранением в жидком азоте на протяжении от 3 до 22 мес. Оценку количества жизнеспособных клеток CD34+, а также доли апоптотических и некротических клеток в образцах после оттаивания проводили с использованием метода проточной цитометрии. Результаты данного исследования показали, что по количеству жизнеспособных клеток образцы, криоконсервированные с 5 и 10% ДМСО, не различались, однако доля апоптотических и некротических CD34+ клеток была значительно ниже в образцах, замороженных с использованием 5% раствора ДМСО [46].

Считается, что общая жизнеспособность ядерных клеток трансплантата не является подходящим методом оценки состояния ГСК, поскольку CD34+ клетки демонстрируют более высокую устойчивость к повреждениям, связанным с криоконсервацией, по сравнению с другими лейкоцитами. Поэтому более ценным предиктором приживления ГСК служит оценка жизнеспособных CD34+ клеток после оттаивания трансплантата с использованием метода проточной цитофлуориметрии. Однако некоторые авторы ставят под сомнение клиническую полезность этого метода, отдавая предпочтение оценке способности CD34-экспрессирующих клеток формировать колонии клеток in vitro, т.к. показатель колониеобразующей способности клеток позволяет оценить количество не просто живых клеток, но клеток, способных к восстановлению гемопоэза [47].

Несмотря на то, что ДМСО используется в качестве криопротектора уже >50 лет, его краткосрочное и долгосрочное воздействия на функциональный потенциал, а также клеточный состав трансплантата ГСК периферической крови остаются малоизученными. Имеются исследования, показывающие, что использование ДМСО снижает экспрессию факторов транскрипции, таких как Oct-4, Sox-2, Nanog и Rex-1, специфичных для эмбриональных стволовых клеток человека [48][49], а также влияние на эпигенетическое состояние клеток [50]. Предполагается, что добавление новых криопротекторов позволит улучшить жизнеспособность клеток после оттаивания и повысит успешность трансплантации [51].

В настоящее время существует значительный интерес к разработке новых криопротекторных растворов, которые по своей эффективности не уступали бы ДМСО, но при этом оказывали менее токсичное воздействие на организм человека. Одним из перспективных классов криопротекторов являются низкомолекулярные углеводы. Так, в работе Wu LK, et al. (2011) сообщается о том, что добавление в раствор криопротектора моно- и дисахаридов, обладающих способностью ингибировать рекристаллизацию льда, защищает CD34+ клетки от криоповреждения. Было показано, что трегалоза и сахароза при добавлении к ДМСО способны сохранять ГСК также эффективно, как и 10% ДМСО [52]. Эффективность оценивалась с точки зрения сохранения клоногенного потенциала клеток, их жизнеспособности и количества CD45+/34+, а использование 0,3 М сахарозы с 5% ДМСО приводило к улучшению функциональной способности ГСК [53]. Трегалоза, являясь внеклеточным криопротектором, может посредством липосом транспортироваться внутрь клетки, увеличивая, тем самым, количество сохраняемых клеток при криоконсервации трансплантата. В исследовании Motta JPR, et al. (2014) оценивали жизнеспособность ГСК пуповинной крови после оттаивания с использованием красителя 7-аминоактиномицина D (7-AAD), количественным определением CD45+/CD34+, MTT-теста, а также анализом КОЕ. Была показана эффективность раствора, содержащего внутри- и внеклеточную трегалозу, используемого для криоконсервации клеток пуповинной крови, эквивалентную текущему стандарту 10% ДМСО [54]. Svalgaard JD, et al. (2016) провели сравнительную оценку восстановления жизнеспособных клеток CD34+, а также анализ колониеобразующих клеток образцов ГСК периферической крови in vitro. В качестве криопротекторов использовался 10% ДМСО или 16% раствор низкомолекулярного углевода пентаизомальтозы (pentaisomaltose, PIM). Было показано, что эффективность PIM в качестве криопротектора ГСК периферической крови эквивалентна таковой для ДМСО. Также не было обнаружено различий ни в отношении восстановления CD34+ клеток, ни в потенциале КОЕ [55]. Предполагается, что PIM может заменить ДМСО в качестве безопасного и эффективного криопротектора. Использование PIM может устранить необходимость инфузии охлажденного клеточного продукта, которая необходима, если используется ДМСО. Кроме того, PIM быстро выводится посредством клубочковой фильтрации и при деградации не образует вредных метаболитов в организме человека. Важным преимуществом данного криопротектора является его неспособность проникать через клеточную мембрану [56].

Помимо углеводов внимание исследователей привлекает новый класс криопротекторов на основе N-акрил-d-альдонамидов. В работе Briard JG, et al. (2016) сообщается о способности молекул этого класса ингибировать рекристаллизацию льда. При добавлении к обычному раствору криопротекторов эти малые нетоксичные молекулы позволяли сохранять колониеобразующую способность CD34+ клеток [57].

Клеточная мембрана является наиболее уязвимым компонентом клетки, поскольку при криоконсервации вещества, проникающие внутрь клетки, способны изменять и даже разрушать ее структуру. ДМСО, проникая через клеточную мембрану, способен вызывать ее ослабление, а также образовывать в ней поры. Следовательно, для обеспечения жизнеспособности клеток и сохранения их функциональной активности клеточная мембрана должна быть защищена от повреждений во время процедуры замораживания/оттаивания. Белки-антифризы, полимеры-антифризы, а также гликопептиды привлекают внимание как эффективные вещества, подавляющие образование кристаллов льда и способные стабилизировать мембранные фосфолипиды. Электростатические взаимодействия, гидрофобные взаимодействия и водородные связи являются основополагающими во влиянии белков-антифризов и сахаров на клеточную мембрану. Кроме того, внимание исследователей привлекают жирные кислоты, такие как стеарат, а также холестерин, поскольку они используются в качестве скаффолдов для доставки на поверхность клеточной мембраны физиологически активных веществ, удерживаемых на мембране с помощью липидного якоря. Встраивание липидного якоря в клеточную мембрану может обеспечить ее защиту в процессе криоконсервации. С целью поиска новых соединений, обладающих криопротекторными свойствами, Yoshida K, et al. (2021) синтезировали вещество, являющееся производным трегалозы, олеил-трегалозу, в котором олеильная группа и трегалоза представляют собой гидрофобную и гидрофильную части, соответственно [58]. Олеиновая кислота в составе полученного соединения служит липидным якорем. Выбор этой кислоты обусловлен тем, что только якорь с ненасыщенной липидной цепью может быть прикреплен к клеточной мембране, не оказывая при этом негативного влияния на липидные рафты (особые мембранные домены) и клеточные сигналы. Для обеспечения вставки липидного якоря в клеточную мембрану необходимо, чтобы вещество обладало и гидрофильными свойствами. С этой целью использовали трегалозу, как вещество с уже известными криопротекторными свойствами. Трегалоза ингибирует образование кристаллов льда и стабилизирует клеточную мембрану посредством образования водородных связей с водой и фосфолипидами клеточных мембран. Полученное вещество, благодаря своим свойствам, не способно проникать через клеточную мембрану, поэтому авторы рекомендуют рассматривать его использование в сочетании с криопротектором, способным проникать внутрь мембраны. Исследователи продемонстрировали криопротекторные свойства олеил-трегалозы на гепатоцитах, показав, что ее применение в сочетании с ДМСО привело к увеличению количества жизнеспособных и функционально активных клеток в сравнении с применением только 10% ДМСО без олеил-трегалозы.

Криоконсервация ГСК требует учета нескольких факторов, включая состав раствора криопротектора, концентрацию клеток, а также скорость замораживания/оттаивания образца и температуру хранения. Бóльшая часть исследований, посвященных криоконсервации ГСК, сосредоточена на оптимизации протоколов криоконсервации, которые бы сводили к минимуму изменения в трансплантате после оттаивания. Растворы для криоконсервации, содержащие 10% ДМСО, до сих пор широко используются на практике, однако появляется все больше информации о повреждающем влиянии данного криопротектора на ГСК и его токсическом действии на организм человека.

Разработка эффективных методов криоконсервации без использования ДМСО или с уменьшенным его содержанием, обеспечивающих высокую жизнеспособность трансплантата после оттаивания — ключевой момент, играющий существенную роль в повышении безопасности процедуры трансплантации ГСК и увеличении ее эффективности.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.