Основной причиной смерти как в России, так и во всем мире остаются сердечно-сосудистые заболевания, среди которых ведущее место занимают заболевания атеросклеротического генеза [1]. Одним из ключевых факторов риска развития атеросклероза является гиперлипидемия. Уровень циркулирующих липидов зависит от образа жизни, сопутствующих заболеваний и генетических факторов [2].

Выявлению независимых ассоциаций между вариантами нуклеотидной последовательности (ВНП) и уровнями циркулирующих липидов служит такой метод исследований, как полногеномный поиск ассоциаций (GWAS). Результаты GWAS используются для создания шкал генетического риска комплексных заболеваний, представляющих собой оценку полигенного вклада в развитие признака или заболевания [3]. Полигенные шкалы риска имеют высокий потенциал применения в клинической практике для доклинической стратификации риска [4].

При проведении GWAS на выборке из 1,65 млн человек (чел.) разного происхождения идентифицирован 941 ВНП, ассоциированный с уровнями общего холестерина (ХС), ХС липопротеинов низкой плотности (ЛНП), ХС липопротеинов высокой плотности (ЛВП) и триглицеридов (ТГ) [5]. В другом исследовании, включившем 312571 участников, авторы подтвердили 188 уже известных ассоциаций с уровнями липидов, а также показали 118 новых ассоциаций [6]. У представителей российской популяции ранее был проведен только один GWAS на выборках, состоящих из лиц, проживающих в Санкт-Петербурге, Самарской и Оренбургской областях [7]. В этом исследовании были идентифицированы 30 ВНП, значимо ассоциированных с липидными показателями [7]. Подобные исследования нуждаются в репликации результатов на независимых выборках для подтверждения найденных ассоциаций [8], что в исходной статье не было сделано.

Цель настоящей работы — провести поиск ассоциаций для четырех показателей липидного профиля (общий ХС, ХС ЛНП, ХС ЛВП, ТГ и) на популяционных выборках из двух регионов Российской Федерации (Вологодской и Ивановской областей) для поиска возможных новых ассоциаций и репликационный анализ ранее опубликованного GWAS [7], полученного на выборке из жителей Санкт-Петербурга, Самарской и Оренбургской областей.

Выборки. В исследование вошли 2364 человека в возрасте 21-67 лет из эпидемиологического исследования ЭССЕ-РФ (Эпидемиология сердечно-сосудистых заболеваний в регионах России): 689 чел. из Вологодской области (участники ЭССЕ-Вологда) [9] и 1675 чел. из Ивановской области (участники ЭССЕ-Иваново) [10]. Включение участников исследования проводилось случайным образом согласно методу Киша. В анализ были включены демографические (пол, возраст) и клинические (прием статинов) данные участников исследования, полученные во время анкетирования в рамках ЭССЕ-Иваново и ЭССЕ-Вологда.

Сбор и хранение биообразцов выполняли согласно регламенту биобанкирования в Биобанке ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России (г. Москва) [11][12]. У всех участников определяли уровни общего ХС, ХС ЛНП, ХС ЛВП и ТГ в сертифицированной лаборатории с помощью автоматического биохимического анализатора крови ARCHITECT c8000 и диагностических наборов (Abbott, США).

Исследование одобрено Независимым Этическим Комитетом ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России (номер протокола 07-03/12 от 03.07.2012). Все участники дали письменное информированное согласие.

Генетический анализ. Для выделения ДНК из цельной крови использовали набор QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Германия). Оценку качества и определение концентрации выделенной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) проводили с помощью приборов NanoDrop OneC (Thermo Fisher Scientific, США) и Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, США). Подготовка библиотек для секвенирования была проведена с помощью набора SeqCap EZ Prime Choice Library (Roche, Швейцария).

Для каждого участника исследования было проведено секвенирование нового поколения с использованием одной из двух таргетных панелей вариантов, разработанных и используемых нами для диагностики и определения предрасположенности к сердечно-сосудистым и прочим мультифакторным заболеваниям. Панель, использованная для участников выборки ЭССЕ-Вологда, включала 217 генов и дополнительно 18489 ВНП. Панель, использованная для участников выборки ЭССЕ-Иваново, включала 242 гена и 2042 ВНП [11]. Секвенирование было проведено на приборе NextSeq 550 (Illumina, США) с получением парноконцевых прочтений длиной 75 или 150 п.н. Все этапы секвенирования были проведены в соответствии с протоколами производителей.

Биоинформатический анализ. Парноконцевые прочтения в формате fastq были выровнены на референсный геном GRCh38. Обработка данных и оценка контроля качества выполнялись с помощью специально разработанного пайплайна [10] на базе GATK 3.8 [13]. Аннотацию однонуклеотидных ВНП и коротких инсерций и делеций осуществляли с помощью ENSEMBL Variant Effect Predictor (v. 100) [14] и базы данных dbSNP [15].

Результаты GWAS Usoltsev D, et al. (2023) [7], репликация которого представлена в этой работе, были скачаны в виде сводных статистик с координатами, соответствующими сборке генома GRCh37. Для дальнейшей работы координаты ВНП были переведены в соответствие со сборкой генома GRCh38 с помощью программы LiftOver [16]. В качестве ВНП, значимо ассоциированных с исследуемыми фенотипами, рассматривали варианты, для которых p-значение <5×10-8.

Статистический анализ. Статистический анализ проводили с использованием библиотек hail v. 0.2.105-acd89e80c3451 и scipy v. 1.2.1 [17] языка программирования Python v. 3.7.42. Значения ТГ были логарифмированы (logТГ), т.к. изначальное распределение было асимметрично. Непрерывные данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (Me [Q25; Q75]). Для сравнения качественных параметров использовали критерий χ2 с поправкой Йейтса. Сравнение распределений количественных параметров в независимых выборках проводили с использованием критерия Манна-Уитни. Для расчета корреляций использовался коэффициент корреляции Спирмена.

Для поиска ассоциаций и репликации результатов GWAS [7] были отобраны ВНП, генотипы которых определены у >90% исследуемых в каждой выборке, с количеством аллельных копий не <10 и находящиеся в равновесии Харди-Вайнберга (p-значение >10-4). Модель линейной регрессии с учетом пола, возраста и приема статинов была использована для оценки ассоциаций ВНП с общим ХС, ХС ЛНП, ХС ЛВП и logТГ. Порог значимости ассоциаций выбирали с учетом поправки Бонферрони на множественную проверку гипотез: 0,05/k, где k — количество вариантов в соответствующей выборке. ВНП считали номинально реплицированными, если в исходном исследовании p-значение не превышало 5×10-8, а в репликационном анализе для этого же ВНП получено p-значение не >0,05 [18], и реплицированными, если в исходном исследовании p-значение <5×10-8, а в репликационном анализе для этого же ВНП получено p-значение <0,05/k, где k — количество значимых в исходном исследовании ВНП для соответствующих липидных показателей (общий ХС, ХС ЛНП, ХС ЛВП, logТГ), найденных в выборке (ЭССЕ-Вологда или ЭССЕ-Иваново). Подробная схема исследования представлена на рисунке 1.

Клиническая характеристика участников исследования представлена в таблице 1. Участники ЭССЕ-Вологда отличались достоверно более высоким уровнем ХС ЛНП и более низкими уровнями ХС ЛВП и ТГ по сравнению с лицами из ЭССЕ-Иваново.

Поиск ассоциаций

В выборке ЭССЕ-Иваново было выявлено 25124 ВНП, прошедших контроль качества, а в выборке ЭССЕ-Вологда — 95656 ВНП. Варианты считали значимо ассоциированными, если р-значение не превышало 5,23×10-7 в случае выборки ЭССЕ-Вологда (0,05/95656 вариантов) и 1,99×10-6 в случае выборки ЭССЕ-Иваново (0,05/25124 вариантов).

Результаты поиска ассоциаций с общим ХС, ХС ЛНП, ХС ЛВП и logТГ представлены на рисунках 2-7 и в таблицах 2-6. В случае ХС ЛНП 3 ВНП — rs7412, rs445925, rs72654473 — показали значимые ассоциации в обеих выборках (таблица 2, рисунки 2 и 6). При поиске ассоциаций с ХС ЛВП было выявлено 16 ВНП, ассоциированных с признаком, при исследовании выборки ЭССЕ-Иваново и 5 ВНП — выборки ЭССЕ-Вологда (таблицы 3-4, рисунки 3 и 7). При поиске ассоциаций с logТГ и общим ХС на выборке ЭССЕ-Вологда значимых ассоциаций выявлено не было. При исследовании выборки ЭССЕ-Иваново выявлен один ВНП, значимо ассоциированный с общим ХС (rs7412, таблица 6, рисунок 4), и 7 ВНП — с logТГ (таблица 5, рисунок 5).

Репликация результатов GWAS

В сводных статистиках в работе Usoltsev D, et al. (2023) [7] для 4 исследуемых липидных показателей суммарно были представлены данные по 7552009 ВНП. Чтобы убедиться в отсутствии значимых генетических различий между анализируемыми выборками, были сопоставлены частоты ВНП, идентифицированные в исследуемых когортах ЭССЕ (14542 ВНП в когорте ЭССЕ-Иваново и 68245 ВНП в ЭССЕ-Вологда) и когорте Usoltsev D, et al. (2023) [7]. Корреляции между частотами ВНП, найденных в выборках ЭССЕ-Вологда и ЭССЕ-Иваново, и частотами в работе Usoltsev D, et al. (2023) [7] составили 99,5 и 99,8%, соответственно.

В исследовании Usoltsev D, et al. (2023) [7] было обнаружено 30 ВНП, статистически значимо ассоциированных с ХС ЛНП, 25 ВНП — с ХС ЛВП, 1 ВНП — с logТГ и 22 ВНП — с общим ХС.

Из них в выборках ЭССЕ-Вологда и ЭССЕ-Иваново было выявлено соответственно 53 и 43% ВНП, ассоциированных с уровнем ХС ЛНП, 60% и 36% — с ХС ЛВП, 18 и 13% — с общим ХС. Единственный ВНП, ассоциированный с уровнем ТГ, был выявлен в обеих выборках (таблица 7). После применения поправки пороговые уровни p-значений для репликации составили 1,25×10-2 для общего ХС, 3,13×10-3 для ХС ЛНП, 3,33×10-3 для ХС ЛВП и 0,05 для logТГ в случае выборки ЭССЕ-Вологда и 1,66×10-2 для общего ХС, 3,84×10-3 для ХС ЛНП, 5,55×10-3 для ХС ЛВП и 0,05 для logТГ, в случае выборки ЭССЕ-Иваново.

Результаты репликации представлены в таблицах 8-11. В случае ХС ЛНП в выборке ЭССЕ-Вологда были номинально реплицированы все ВНП, кроме rs4970836, и все ВНП в выборке ЭССЕ-Иваново, кроме rs4970834. При применении поправки на количество ВНП реплицированными в случае ЭССЕ-Вологда оказались 7 ВНП (rs7412, rs1160983, rs72654473, rs445925, rs429358, rs56131196, rs4420638), в случае ЭССЕ-Иваново — 6 ВНП (rs7412, rrs72654473, rs445925, rs429358, rs56131196, rs4420638). Для ХС ЛВП и logТГ были реплицированы все идентифицированные в выборках ВНП. Для уровня общего ХС в выборке ЭССЕ-Вологда был реплицирован только один ВНП — rs7412, в выборке ЭССЕ-Иваново — rs7412 и rs1367117. Общая доля реплицированных ВНП составила 89% для выборки ЭССЕ-Вологда и 92% для ЭССЕ-Иваново.

Все β-оценки реплицированных ВНП совпадали по направлению эффекта ВНП с заявленным в работе Usoltsev D, et al. (2023) [7].

Проведенные на выборках ЭССЕ-Вологда и ЭССЕ-Иваново поиски ассоциаций позволили идентифицировать ВНП, статистически значимая ассоциация с липидными показателями для которых уже продемонстрирована в работе Usoltsev D, et al. (2023) [7]. Относительно небольшое количество выявленных ВНП, ассоциированных с липидными показателями, в сравнении с другими работами [19][20], вероятно, объясняется небольшими размерами выборок и ограниченным числом доступных для включения в анализ ВНП.

Полногеномные ассоциативные исследования нуждаются в репликации результатов на независимых выборках для подтверждения обнаруженных ассоциаций [7]. В данной работе была проведена репликация результатов GWAS для показателей липидного профиля Usoltsev D, el al. (2023) [7], проведенного на выборке из представителей российской популяции (из Санкт-Петербурга, Самарской и Оренбургской областей). Было показано, что 89 и 92% значимых ВНП реплицируются в выборках ЭССЕ-Вологда и ЭССЕ-Иваново номинально (см. пояснения в разделе Методы), в т.ч. не <66% с поправкой на количество ВНП. Полученные результаты хорошо согласуются с утверждением, что показатели реплицируемости GWAS достаточно высоки [7]. Более того, доля реплицированных ВНП в случае выборки ЭССЕ-Иваново больше, чем в случае выборки ЭССЕ-Вологда, что может быть объяснено бóльшим размером выборки ЭССЕ-Иваново и указывать на роль размера выборки при репликации результатов GWAS. Тем не менее, реплицированные ВНП с большой надежностью могут быть включены в шкалы генетического риска гиперлипидемий, разрабатываемые для представителей российской популяции.

Обращает на себя внимание, что в данном исследовании удалось подтвердить отмеченную Usoltsev D, et al. (2023) [7] ассоциацию ХС ЛНП с ВНП rs7412 гена APOE. Данный ВНП является известным несинонимичным ВНП, ассоциированным с ХС ЛНП, в частности, в европейской выборке Willer CJ, et al. (2013) [20], а также в российской выборке из центральной России [21]. Для другого ВНП (rs4970834 гена CELSR2) с сильной ассоциацией с ХС ЛНП, заявленной Usoltsev D, et al. (2023) [7], при исследовании выборки ЭССЕ-Иваново ассоциацию подтвердить не удалось. Причиной может служить относительно небольшой размер этой выборки, т.к. в других источниках данный ВНП был отмечен как значимый [22].

Стоит отметить, что все значимые ВНП Usoltsev D, et al. (2023) [7], найденные в выборках ЭССЕ-Вологда и ЭССЕ-Иваново для ХС ЛВП, находятся в гене CETP, и прошли репликацию. Известно, что ген CETP регулирует содержание ХС ЛВП в крови [23]. В частности, была подтверждена ассоциация ВНП rs708272 с уровнем ХС ЛВП. Известно, что данный вариант ассоциирован с более высоким уровнем ХС ЛВП у жителей Западной Сибири европеоидного происхождения [24] Ассоциации ХС ЛВП с вариантами rs34145065 и rs34620476 ранее были описаны в литературе [25], для представителей российской популяции впервые были показаны в данной работе. Единственный значимый ВНП для logТГ из исследования Usoltsev D, et al. (2023) [7] rs964184, который находится в 3`-нетранслируемом участке гена ZPR1, был идентифицирован и реплицирован в обеих выборках. Считается, что rs964184 ассоциирован с уровнем logТГ, т.к. находится около кластера генов APOA5-A4-C3-A1 [26].

Для общего ХС только один ВНП был реплицирован в обеих выборках — rs7412 в гене APOE. Остальные найденные в обеих выборках ВНП (rs1160983, rs4970834, rs1367117), для которых ранее была показана ассоциация с общим ХС [20][22][27], не были реплицированы как минимум в одной из исследуемых выборок. Такой результат, вероятнее всего, объясним относительно небольшим размером выборок ЭССЕ-Вологда и ЭССЕ-Иваново.

Ограничения исследования. Данное исследование имеет ряд ограничений. В первую очередь, это относительно небольшие размеры исследуемых выборок как в случае исходного GWAS (4145 участников), так и для выборок ЭССЕ-Иваново (1675 участников) и ЭССЕ-Вологда (689 участников). Второе важное ограничение данного исследования — ограниченность участков секвенирования выборок ЭССЕ-Вологда и ЭССЕ-Иваново. Панель, использованная для участников выборки ЭССЕ-Вологда, включала 217 генов и дополнительно 18489 ВНП. В случае выборки ЭССЕ-Иваново, панель для секвенирования включала 242 гена и 2042 ВНП.

Было также показано, что показатели липидов статистически значимо различаются в выборках ЭССЕ-Вологда и ЭССЕ-Иваново, что может быть объяснено различиями в половозрастной структуре исследуемых выборок.

Поиск ассоциаций позволил идентифицировать ВНП, статистически значимая ассоциация с липидными показателями для которых ранее уже продемонстрирована на выборке лиц, проживающих на территории России. Несмотря на ограниченный объем репликационной выборки, при репликации результатов ранее проведенного GWAS обнаружена высокая степень совпадения как статистической значимости, так и силы эффекта (β-оценки) ВНП, значимо ассоциированных с липидными показателями. Таким образом, полученные на различных выборках представителей российской популяции результаты GWAS для липидных показателей согласуются между собой.

Отношения и деятельность. Работа была поддержана государственным заданием № 121021700364-1 "Разработка интегрированных систем прогнозирования в персонализированной медицине".

1. Hail Team. Hail 0.2.105-acd89e80c345. https://github.com/hail-is/hail/commit/acd89e80c345.2. https://www.python.org/.