Биобанкирование играет важнейшую роль в обеспечении широкого спектра биомедицинских исследований. Биобанки являются центральным звеном в большинстве современных исследований в области генетики человека, включая медицинскую генетику и репродуктивную медицину [1][2]. Одним из важных аспектов использования биобанков в медицинской генетике является создание открытых баз данных и иных ресурсов, агрегирующих генетические данные большого количества пациентов [3]. Такие ресурсы могут быть условно разделены на два типа: 1) популяционно-генетические базы данных, содержащие информацию о частоте носительства генетических вариантов в популяции (например, база данных RUSeq [4]; 2) каталоги, содержащие информацию о результатах сравнительного анализа групп образцов, в частности с помощью методики полногеномного анализа ассоциаций (например, Биобанк России [5]).

Помимо исследований истории популяции и анализа различных фундаментальных аспектов эволюции генома человека, такие базы данных играют центральную роль как в диагностике наследственных болезней [6], так и в оценке риска наследственных патологий у пар, планирующих беременность. Например, в последние годы был опубликован ряд исследований, направленных на оценку частоты основных мутаций в гене CFTR, связанных с риском мужского бесплодия [7][8].

Невынашивание беременности является одной из важнейших проблем современной репродуктивной медицины. Наиболее распространенной формой репродуктивных потерь является самопроизвольный аборт (выкидыш) — гибель плода на сроке до 20 нед. беременности. Частота выкидышей в Российской Федерации (РФ) на 2022г составила 2,3/1 тыс. женщин репродуктивного возраста [9]. Потери на более поздних сроках описываются термином "мертворождение". От 1 до 5% всех пар сталкиваются с привычным невынашиванием (привычным выкидышем, ПВ) — состоянием, при котором наблюдаются ≥3 последовательных выкидышей до 22 нед. беременности или потерю плода весом <500 г (определение Всемирной организации здравоохранения), в РФ принято считать ПВ потерю ≥2 беременностей [10].

К генетическим причинам прерывания беременности относятся аномалии кариотипа или метилирования дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), фрагментация ДНК сперматозоидов, гетероморфизм хромосом и др. [11]. Около 70-80% спонтанных выкидышей вызваны аномалиями в кариотипе эмбриона [12], но причина значительной доли выкидышей все еще остается неизвестной. В случае привычного выкидыша, причина остается неизвестной чаще (у >50% пар).

Значительная доля случаев единичного или привычного выкидыша неустановленной природы может быть обусловлена наличием точечных мутаций, приводящих к серьезным дефектам раннего эмбрионального развития. В последние годы было описано большое количество таких точечных мутаций (например, в работе Byrne AB, et al. (2023) [13]). Многие из них зачастую являются причиной серьезных наследственных заболеваний различных органов и систем, таких как, например, сердечно-сосудистая (мутации в генах RYR2, SCN5A).

Технологии высокопроизводительного секвенирования генома или экзома произвели настоящую революцию в области диагностики наследственных патологий человека [14] и активно применяются для идентификации причин невынашивания беременности. Однако эффективность применения данных технологий в значительной степени зависит от наличия ресурсов, содержащих информацию о генетических маркерах риска репродуктивных потерь, а также от наличия данных о частоте данных маркеров в популяции.

Ранее была собрана информация о 270 генетических вариантах, которые описаны в литературе как потенциальная причина выкидышей, включая случаи ПВ [15]. В этой работе использовали открытую базу данных RUSeq [4] для оценки частоты этих вариантов у жителей РФ, а также выявили новые мутации, затрагивающие один из 18 ключевых генов, вовлеченных в патогенез выкидышей и привычного невынашивания. Наши результаты подтверждают ценность масштабных коллекций образцов, подобных RUSeq, для оценки частоты носительства патогенных и вероятно патогенных генетических вариантов, связанных с различными наследственными патологиями.

Использованные базы данных. В качестве исходных данных для настоящего исследования была использована публично доступная база данных RUSeq, содержащая информацию о частоте генетических вариантов в российской популяции [4]. Данный ресурс содержит информацию о генетических вариантах, обнаруженных у >7 тыс. пациентов (7452), из которых 1696 человек не имеют наследственных патологий. Для анализа частоты вариантов были использованы VCF-файлы, содержащие обобщенную информацию об их частоте. Дополнительный отбор доноров по полу или иным характеристикам не проводился. Каждый вариант был дополнительно проаннотирован информацией о его частоте в мировых популяциях (по данным Genome Aggregation Database (gnomAD) v2 [16]), а также о клинической классификации варианта в базе данных NCBI ClinVar [17].

Отбор генетических вариантов, связанных с риском невынашивания беременности. Для поиска и оценки частоты связанных с невынашиванием беременности генетических вариантов в российской популяции были использованы данные о 270 генетических вариантах, описанных в литературе [15]. Для поиска вариантов из данного списка в базе RUSeq были использованы положения и тип аминокислотной замены в последовательности белка (поиск соответствий проводился с использованием аннотированного описания эффекта варианта на кодируемый геном белок).

Помимо поиска известных вариантов, описанных как причина выкидышей или привычного невынашивания, нами был проведен дополнительный отбор потенциально клинически значимых вариантов в основных генах, мутации в которых приводят к выкидышам или прерыванию беременности. Данный список генов был составлен на основе литературных данных, обобщенных в предыдущих исследованиях. В качестве генов-кандидатов рассматривали 18 генов, мутации в которых были обнаружены в ≥2 независимых исследованиях (таблица 1 из исходной публикации [15]) (DYNC2H1, RYR2, OXP3, PADI6, PIEZO1, SCN5A, NEB, STIL, COL2A1, FRAS1, FGFR3, GREB1L, RYR1, LZTR1, FGFR2, PTPN11, PIK3R2, GBE1). Помимо невынашивания, все эти гены (за исключением PADI6) связаны с серьезными наследственными патологиями, включая сердечно-сосудистые заболевания (желудочковая аритмия (OMIM: 115000, ген RYR2); синдром Бругада (OMIM: 601144, ген SCN5A)), нервно-мышечные патологии (NEB), скелетные дисплазии (COL2A1, DYNC2H1, FGFR2, FGFR3, FRAS1, RYR1), болезни крови и иммунитета (FOXP3, PIEZO1), и иные мультисистемные синдромы.

Для сужения пространства поиска в качестве возможных причинных вариантов в данных генах рассматривались варианты, потенциально приводящие к полной потере функции белкового продукта гена (нонсенс-мутации, замены в канонических сайтах сплайсинга, вставки или выпадения нуклеотидов, приводящие к сдвигу рамки считывания). Кроме того, в анализ были включены варианты, отмеченные как патогенные или вероятно патогенные в базе данных ClinVar, без учета их типа. Список обнаруженных вариантов проходил дальнейшую проверку для исключения заведомо доброкачественных вариантов (с частотой >1% или соответствующей пометкой в ClinVar).

Во всех случаях отбор вариантов проводился с использованием языка программирования Python версии 3.10.

Поисковая тема государственного задания ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д. О. Отта" № 1022040700839-2-3.2.2 "Разработка и апробация алгоритма профилактики наследственных болезней для внедрения массового преконцепционного генетического скрининга в Северо-Западном регионе РФ".

Частота носительства известных патогенных вариантов

На первом этапе работы была проанализирована частота носительства генетических вариантов, обнаруженных в опубликованных исследованиях генетических основ невынашивания беременности. В общей сложности в анализ были включены 270 генетических вариантов в 18 генах. Из этого набора, в базе RUSeq были обнаружены 28 (10,3%) вариантов, из которых 10 встречались в здоровой популяции (2 варианта были обнаружены исключительно в здоровой популяции). Из них 2 варианта были аннотированы как доброкачественные в базе данных NCBI ClinVar, а еще один был отмечен как вариант с противоречащими интерпретациями патогенности. Таким образом, всего 7 из обнаруженных вариантов, встречающихся в здоровой российской популяции, могут быть рассмотрены как потенциальные аллели риска репродуктивных потерь. Из этих вариантов 3 были классифицированы как патогенные или вероятно патогенные в NCBI ClinVar, и еще 1 вариант был отмечен как вариант неопределенного значения.

Информация о наиболее частых вариантах представлена в таблице 1. Наиболее часто встречались варианты в генах NEB и ATP7B (0,0059 и 0,0054, соответственно). Оба варианта являются известными патогенными вариантами, связанными с немалиновой миопатией и болезнью Вильсона-Коновалова, соответственно, а частота их носительства в РФ значимо превышает частоту в европейской популяции (по данным gnomAD). Наименьшей частотой характеризовались варианты в генах EPAS1, PLXNB2 и GBE1 (все эти варианты наблюдались однократно).

Совокупная частота повреждающих вариантовв ключевых генах

На следующем этапе работы была проанализирована совокупная частота функционально значимых генетических вариантов в ключевых генах, связанных с риском невынашивания. Для этого мы сосредоточились на вариантах, вероятно приводящих к потере функции белка (появлению преждевременных стоп-кодонов или сдвигу рамки считывания, нарушению сплайсинга). Для сужения пространства поиска были использованы только те гены, варианты в которых были обнаружены более, чем в одном исследовании генетических причин репродуктивных потерь.

В результате поиска вариантов, подходящих под критерии поиска, в базе данных RUSeq, было обнаружено 154 повреждающих или известных патогенных варианта в использованном наборе из 18 генов. Из них, 46 вариантов в 10 генах встречались у представителей здоровой популяции. Обобщенная информация об этих вариантах представлена в таблице 2. Наибольшее число вариантов было обнаружено в гене DYNC2H1, что, скорее всего, связано с большой длиной кодируемого данным геном полипептида. Примечательно, что мутации в DYNC2H1 встречались лишь у 11 человек, в то время как мутации в гене NEB наблюдались у 30 человек, несмотря на меньшее количество обнаруженных повреждающих мутаций в этом гене (7 шт.) Данное наблюдение, без сомнения, объясняется наличием частой нонсенс-мутации в NEB, описанной в предыдущем разделе. Интересно, что у 4 человек были обнаружены мутации в гене STIL. В отличие от других генов, которые также связаны с наследственными патологиями в постнатальный период, варианты в гене STIL являются специфическим маркером риска привычного невынашивания.

Информация о частоте носительства генетических вариантов в популяции имеет ключевое значение как в ходе молекулярной диагностики наследственных патологий [6, 14], так и для эпидемиологической оценки риска генетических заболеваний. База данных RUSeq является единственным на сегодняшний день открытым ресурсом, содержащим такую информацию о российской популяции, и была многократно использована в целом ряде медико-генетических исследований (например, Glotov AS, et al. (2024) [8]). В настоящем исследовании продемонстрирована ценность данных RUSeq для оценки риска репродуктивных патологий у жителей РФ на примере невынашивания беременности.

Выкидыши и привычное невынашивание являются важной проблемой репродуктивного здоровья человека, и даже один выкидыш способен оказывать значительное психологическое влияние на женщину. Для успешного предсказания риска невынашивания, необходимо как полноценное понимание патогенетических механизмов, лежащих в основе данной патологии, так и информация о частоте в популяции генетических вариаций, связанных с риском невынашивания беременности. Наличие этой информации позволяет проводить направленное преконцепционное генетическое тестирование пар на этапе планирования беременности для оценки риска репродуктивных потерь и разработки успешной стратегии предупреждения патологии.

Настоящая работа является первым в России исследованием частоты точечных мутаций, связанных с риском выкидыша и привычного невынашивания. В ходе работы, было обнаружено 7 известных вариантов, встречающихся у жителей РФ и связанных с риском самопроизвольного аборта, а также 46 известных и потенциально патогенных вариантов в основных генах, вовлеченных в патогенез невынашивания беременности.

Важно заметить, что далеко не все варианты, обнаруженные в настоящем исследовании, служат специфическими маркерами риска выкидыша. Так, наиболее частыми вариантами из числа обнаруженных нами являются мутации в генах NEB и ATP7B. Вариант rs76151636 в гене ATP7B, связанный с болезнью Вильсона-Коновалова, известен как один из наиболее часто встречающихся патогенных вариантов в этом гене у российских пациентов [18]. Повышенная частота носительства вариантов в гене NEB также была отмечена в целом ряде исследований российской популяции с использованием высокопроизводительных методов анализа [4][19]. Известно, что некоторые патогенные вариации в гене NEB являются специфическими для российской популяции, что хорошо согласуется со значимо увеличенной частотой варианта rs549794342 в гене NEB в данных RUSeq относительно данных gnomAD. Частота варианта rs76151636 в гене ATP7B также значимо различается между российской и европейской популяцией [4]. Стоит заметить, однако, что статистическое сравнение частоты носительства других вариантов, обнаруженных в настоящем исследовании, между российской и европейской популяциями затруднено ввиду их низкой общей частоты.

Наконец, важно подчеркнуть, что имеющихся в нашем распоряжении данных недостаточно для того, чтобы уверенно предсказать, будут ли обнаруженные в исследовании варианты приводить к выкидышу у каждой отдельно взятой пары. Тем не менее, их следует принимать во внимание как потенциальные факторы риска при планировании беременности.

Биобанки играют важнейшую роль как в изучении генетических основ наследственных болезней, так и в их диагностике и профилактике. Полученные в настоящем исследовании результаты подчеркивают важность накопления информации о частоте генетических вариантов в российской популяции для идентификации потенциальных маркеров риска репродуктивных проблем, включая невынашивание беременности. Обнаружение потенциально значимых часто встречающихся вариантов указывает на необходимость принятия этих вариантов во внимание при проведении медико-генетического консультирования при планировании беременности для оценки риска невынашивания беременности. В то же время, данная работа подчеркивает необходимость дальнейшего изучения патогенетических процессов, лежащих в основе невынашивания беременности, для более комплексной оценки риска у пар.

Отношения и деятельность. Исследование выполнено в рамках реализации поисковой темы государственного задания ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д. О. Отта" № 1022040700839-2-3.2.2 "Разработка и апробация алгоритма профилактики наследственных болезней для внедрения массового преконцепционного генетического скрининга в Северо-Западном регионе РФ".