В настоящее время ишемическая болезнь сердца (ИБС) продолжает оставаться основной причиной смерти в Российской Федерации. Выявление лиц с высоким риском развития ИБС и раннее назначение им гиполипидемической терапии является эффективной стратегией профилактики заболевания [1]. Однако ключевым моментом в реализации данной стратегии является точность оценки сердечно-сосудистого риска. Шкалы SCORE (Systematic Coronary Risk Evaluation) и SCORE2 (Systematic Coronary Risk Evaluation2, обновленная шкала "Систематическая оценка коронарного риска") показали свою эффективность в оценке сердечно-сосудистого риска, однако они не лишены недостатков [2]. Поэтому поиск дополнительных биомаркеров риска ИБС и других сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) остается актуальной задачей.

Ранее нами была показана связь вариантов нуклеотидной последовательности (ВНП) гена ADIPOQ с уровнем адипонектина крови и риском ИБС на выборке пациентов, госпитализированных в ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России для проведения коронарографии (n=447) [3]. Ген ADIPOQ кодирует адипонектин — белок массой 28 кДа, который играет важную роль в физиологии сосудов, контролирует метаболизм глюкозы и жирных кислот, модулирует чувствительность тканей к инсулину, подавляет пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов и оказывает общее противовоспалительное действие [3]. В мировой практике ряд исследований показывает значимую ассоциацию различных ВНП в гене ADIPOQ с риском ИБС [4][5].

Целью настоящего исследования является валидация ранее полученных данных и подтверждение ассоциации ВНП rs266729 и rs182052 гена ADIPOQ с риском ИБС на независимой выборке.

Выборка

В исследование была включена подвыборка участников (n=874) исследования ЭССЕ-РФ (Эпидемиология сердечно-сосудистых заболеваний в регионах Российской Федерации) из Вологодской и Омской областей и Красноярского и Приморского краев [6]) и выборка пациентов (n=258) из коллекции биобанка ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России (г. Москва) [7]. Общая выборка включала 1132 участника, из них n=518 (59,3%) мужчины. Для всех участников при анализе учитывались следующие данные, полученные в рамках проведения исследования ЭССЕ-РФ или клинического обследования в стационаре: пол, возраст, индекс массы тела, соотношение окружностей талии и бедер, факт ожирения, уровень триглицеридов и холестерина (ХС) липопротеинов низкой плотности (ЛНП), наличие сахарного диабета 2 типа (СД2) и ИБС, артериальной гипертензии (АГ) и факт курения. Факт наличия ИБС у участников исследования был установлен на основании анализа записей в их амбулаторных медицинских картах. Исследование одобрено независимым этическим комитетом ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России (протокол № 07-03/12 от 03.07.2012; № 01-09/16 от 18.02.2016). Все участники дали письменное информированное согласие.

Генетическая диагностика

Геномную дезоксирибонуклеиновую кислоту выделяли из образцов цельной крови с использованием набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Германия). Для определения ее концентрации использовали флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, США) или спектрофотометр NanoDrop OneC (Thermo Fisher Scientific, США). Всем участникам исследования было выполнено секвенирование следующего поколения с использованием таргетной панели, включающей ген адипонектина ADIPOQ. Библиотеки для панели были приготовлены с использованием набора SeqCap EZ Prime Choice Library (Roche, Швейцария) с последующим секвенированием на приборе NextSeq 550 (Illumina, США). Все этапы секвенирования были выполнены в соответствии с протоколами производителей.

Биоинформатический анализ

Чтения с парными концами в формате fastq были выровнены на референсный геном GRCh38. Обработка данных и оценка контроля качества выполнялись с помощью специально разработанного пайплайна [8] на базе GATK 3.8. Для определения гаплотипов использовались варианты rs266729 и rs182052 в гене ADIPOQ. Вариант rs266729 представляет собой замену C на G, rs182052 — G на А. Фазирование вариантов генома проводилось с использованием Beagle v. 5.5 [9] на основе данных проекта 1000 геномов [10]. Гаплотипы определялись на основе результатов фазирования вариантов генома пользовательским скриптом, разработанным на языке Python v. 3.7.4. На основе данных вариантов rs266729 и rs182052 были получены гаплотипы GG, GA, CG и CA.

Статистический анализ. Для статистического анализа были использованы инструменты языка R v. 4.2.1. Непрерывные показатели сравнивали тестом Манна-Уитни, категориальные — тестом χ². Для поиска ассоциаций с исследуемыми показателями использовали многофакторную логистическую регрессию. В качестве ковариат использовали пол, возраст, логарифм уровня триглицеридов (логТГ), уровень ХС ЛНП и наличие АГ. Для подтверждения выявленных ассоциаций использовали тест Фишера. Уровень значимости был выбран p<0,05.

Клиническая характеристика валидационной выборки (n=1132) представлена в таблице 1. Мужчины и женщины значимо различались по индексу массы тела и соотношению окружностей талии и бедер, а также по частоте ИБС и СД2, но не различались по частоте ожирения.

Был проведен поиск ассоциаций вариантов rs266729 и rs182052 с ИБС с использованием логистической регрессии в аддитивной, доминантной и рецессивной моделях, а также с помощью теста Фишера. Результаты представлены в таблице 2. Среди носителей варианты rs266729 и rs182052 имели высокую частоту, достаточную для обнаружения в выборке носителей гомозигот альтернативного аллеля. Для этих вариантов был проведен поиск ассоциаций с рецессивной моделью наследования. Была показана значимая ассоциация ВНП rs266729 в рецессивной однофакторной модели с повышенным риском ИБС — отношение шансов (odds ratio, OR)=2,008, р=0,014), которая была подтверждена тестом Фишера (р=0,016). Для остальных ассоциаций статистическая значимость отсутствовала.

На основе ВНП rs266729 и rs182052 было выделено 4 гаплотипа: GG, GA, CG и CA. Гаплотип CG был выбран в качестве референсного гаплотипа, как самый частый (его частота составила 48,2%). Для гаплотипа GG поиск ассоциаций не проводился, т.к. он практически не был представлен в выборке (6 носителей, частота гаплотипа — 0,3%). Результаты поиска ассоциаций с ИБС и частыми гаплотипами представлены в таблице 3. Показана ассоциация гаплотипа GA с ИБС в рецессивной однофакторной модели (OR=2,024, р=0,013), в рецессивной многофакторной модели (включающей пол, возраст, логТГ, уровень ХС ЛНП и наличие АГ в качестве ковариат) (OR=2,086, р=0,010) и тестом Фишера (р=0,014). Для гаплотипа CA показана ассоциация с ИБС в однофакторной рецессивной модели (OR=3,809, р=0,043) и рецессивной многофакторной модели (включающей пол, возраст, логТГ, уровень ХС ЛНП и наличие АГ в качестве ковариат) (OR=4,16, р=0,032).

Адипонектин — это цитокин, вырабатываемый адипоцитами, известный своим кардиопротективным действием, что было показано как в доклинических, так и клинических исследованиях [11-13]. Он оказывает противовоспалительное, инсулин-сенсибилизирующее и антиатерогенное действие и неразрывно связан с ССЗ. Тем не менее, в последнее время появляются данные, свидетельствующие об отсутствии связи уровня адипонектина с частотой развития ИБС [14]. Однако в других работах при повышении уровня адипонектина отмечалось увеличение частоты ряда ССЗ, таких как мерцательная аритмия и аортальный стеноз, а также уровня сердечно-сосудистой и общей смертности [14][15]. Впервые же увеличение смертности было выявлено среди лиц с хронической сердечной недостаточностью (СН) и особенно у пациентов с систолической СН [14]. Было высказано предположение, что схожие свойства с адипонектином проявляют и натрийуретические пептиды (НУП). НУП стимулируют повышенную секрецию адипонектина [14][15].

В других работах показано, что уровень адипонектина повышался из-за резистентности к нему у пациентов с метаболическим синдромом или СН [16][17]. У пациентов с СН со сниженной фракцией выброса растянутые кардиомиоциты (stretched cardiomyocytes) секретируют НУП, которые дополнительно стимулируют высвобождение адипонектина из жировой ткани, приводя к резистентности к адипонектину. Возникающее воспаление и жесткость миокарда препятствуют растяжению миокарда и последующему высвобождению НУП, что в свою очередь влияет и на уровни адипонектина [14]. Тем не менее, единой теории, которая могла бы чётко объяснить связь повышенных уровней адипонектина с увеличением частоты ряда ССЗ не существует.

Еще одним объяснением связи адипонектина с ССЗ могут быть генетические различия пациентов. Определенные ВНП гена ADIPOQ могут изменять уровень экспрессии адипонектина, а также могут влиять на индивидуальную предрасположенность к ИБС. Так, в метаанализе Zhang X, et al. (2019), который включал 45 исследований, было показано, что два ВНП гена ADIPOQ в значительной степени связаны с предрасположенностью к ИБС в определенных группах населения [18]. В данной работе под ССЗ понималось наличие у пациентов ИБС, стенокардии напряжения или острого коронарного синдрома или инфаркта миокарда. Значимая связь с предрасположенностью к ИБС была выявлена для ВНП rs2241766 (доминантная модель: p=0,001, OR=0,82, 95% доверительный интервал (ДИ): 0,73-0,92; рецессивная модель: p=0,04, OR=1,29, 95% ДИ: 1,02-1,64) у участников из Европы, Восточной Азии и Южной Азии, а ВНП rs1501299 был достоверно связан с предрасположенностью к ИБС у участников только из Восточной Азии [18]. Таким образом, ВНП гена ADIPOQ могут быть использованы для выявления лиц, в большей степени предрасположенных к ИБС независимо от уровня адипонектина.

В предыдущей работе нами был сделан первый шаг в изучении ассоциации ряда ВНП гена ADIPOQ на выборке пациентов из России с концентрацией адипонектина в сыворотке крови, а также с наличием ССЗ [3]. Согласно результатам, полученным с помощью регрессионного анализа, выявлено увеличение частоты встречаемости нестабильной стенокардии в 2,55 раза (p=0,018) и ИБС в 1,55 раза (p=0,021) на А-аллель rs182052. Регрессионный анализ rs266729 показал, что частота встречаемости нестабильной стенокардии была увеличена в 3,59 раза (p=0,045) у участников с генотипом GG, а распространенность ИБС была в 1,48 раза увеличена (p=0,045) на копию аллеля-G. Анализ гаплотипа показал, что участники с гаплотипом GCATT имеют более низкие уровни адипонектина (p=0,042) и в 3,60 раза более высокую распространенность нестабильной стенокардии (p=0,007) по сравнению с носителями референсного гаплотипа [3].

Ассоциация ВНП rs266729 гена ADIPOQ с наличием ИБС ранее была показана и в метаанализе 51 исследования, включавшем 19779 человек (OR=1,11; 95% ДИ: 1,01-1,22, p=0,03) [19]. Для ВНП rs182052 гена ADIPOQ также была показана ассоциация с ИБС и выраженностью коронарного атеросклероза на выборке 1110 китайских пациентов с СД2 [20].

В настоящей работе исследование проведено на независимой валидационной выборке с увеличенным количеством пациентов, у которых в многофакторной модели показана ассоциация гаплотипов GA и CA ВНП rs266729 и rs182052 гена ADIPOQ с риском наличия ИБС. Таким образом, получены убедительные данные об ассоциации ВНП rs182052 и rs266729 гена ADIPOQ с ИБС, которые подтверждают результаты, полученные нами ранее [3].

В рамках проведенной нами валидации получено подтверждение наличия ассоциации гаплотипов GA и CA ВНП rs266729 и rs182052 гена ADIPOQ с риском наличия ИБС. Это свидетельствует о возможности рассмотрения ВНП rs266729 и rs182052 гена ADIPOQ в качестве потенциальных биомаркеров риска ИБС для жителей России.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.