Малые некодирующие молекулы рибонуклеиновой кислоты (микроРНК) — короткие одноцепочечные некодирующие рибонуклеиновые кислоты (РНК), длиной ~18-25 нуклеотидов. МикроРНК участвуют в посттранскрипционной регуляции, которая может приводить к деградации матричной РНК или ингибированию трансляции [1]. Внеклеточные микроРНК избегают деградации в плазме и сыворотке крови, поскольку они либо заключены в экзосомы и микровезикулы, либо связаны с белковыми комплексами [2][3].

На сегодняшний день значительное количество исследований направлено на изучение возможности использования микроРНК в качестве биомаркеров различных заболеваний [4-6]. Накоплен большой массив данных, свидетельствующих о значительном влиянии преаналитических и аналитических факторов на спектр и уровни циркулирующих микроРНК [7-10]. Результаты, полученные при исследовании микроРНК, не всегда воспроизводимы, что объясняется в т.ч. использованием различных биологических образцов, различных методов и отсутствием стандартизированных подходов [4][5][11][12].

Исследования стабильности циркулирующих микроРНК плазмы крови при долгосрочном хранении немногочисленны [1][10][13][14] и в большинстве из них для оценки уровня микроРНК использовался метод количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (кПЦР), который позволяет оценить только ограниченное число микроРНК.

Цель настоящего исследования — оценить влияние длительного хранения биобанкированных образцов плазмы крови на профиль циркулирующих микроРНК.

Выборка. В исследование были включены образцы плазмы крови 10 пациентов, полученные в период с декабря 2019г по июль 2020г [15]. Возраст пациентов в момент взятия крови составлял 67,5 лет [ 63,5; 74,25], доля мужчин — 70%. Образцы плазмы были получены и хранились в коллекции биобанка ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России (далее Биобанк) [16]. Исследование одобрено Независимым этическим комитетом ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России (протоколы № 05-05/15 от 09.06.2015, № 02-02/22 от 17.03.2022). Все участники дали письменное информированное согласие.

Получение плазмы крови. Для взятия крови использовались пробирки с солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), а именно K2ЭДТА, в качестве антикоагулянта, которые хранили при комнатной температуре не >1 ч до выделения плазмы. В Биобанке кровь центрифугировали 15 мин при 1200 g при +4 оС (5702 R, Eppendorf, Германия), после чего отбирали плазму, которую хранили при -70 оС (DF 590, Nuve, Турция) без циклов замораживания-оттаивания. В исследовании было использовано две аликвоты каждого образца плазмы. Одна аликвота каждого образца через год была использована для выделения РНК, которая далее хранилась в Биобанке при температуре -70 оС (контрольная группа, n=10). Из второй аликвоты плазмы РНК была выделена через 5 лет (группа с длительным хранением плазмы, n=10).

Выделение РНК. Перед выделением РНК биообразцы плазмы размораживали и центрифугировали при 16000 g в течение 15 мин при +4 оС. Супернатант отбирали и переносили в чистые пробирки, свободные от нуклеаз; образцы сразу использовались для выделения тотальной РНК, включая микроРНК, с помощью miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (Qiagen, Германия). Сразу после выделения каждый образец РНК разделяли на аликвоты для хранения при -70 оС в Биобанке до дальнейшего анализа, во избежание циклов размораживания-оттаивания. Концентрацию выделенной микроРНК определяли с использованием флуориметра Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, США) и набора Qubit microRNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Ни в одном образце из включенных в исследование, не был детектирован гемолиз [15].

Секвенирование следующего поколения (NGS — next generation sequencing). Библиотеки для NGS были приготовлены с помощью набора QIAseq miRNA UDI Library Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с версией протокола производителя для сыворотки/плазмы ("Serum/Plasma") с использованием уникальных молекулярных идентификаторов (unique molecular identifiers, UMI). Концентрацию приготовленных библиотек определяли с помощью флуориметра Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, США) с использованием набора Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, США). При анализе с помощью Bioanalyzer 2100 (Agilent, США) средняя высота соответствующего димерам адаптеров пика (178 п.н.) составляла ~50% высоты пика, соответствующего микроРНК (200 п.н.), дополнительная очистка от димеров с использованием электрофореза в полиакриламидном геле не проводилась. NGS было проведено на платформе NextSeq 550 (Illumina, США) по протоколу High Output 1×75 п.н.

Биоинформатический анализ. Для обработки UMI были использованы возможности пакета UMI-tools [17]. С помощью программы cutadapt [18] были оставлены чтения длиной не <14 нуклеотидов. Одноконцевые чтения в формате fastq были выровнены на референсный геном GRCh38 с помощью программы STAR [19]. Файлы с выравниванием чтений на референсный геном были отсортированы и проиндексированы с помощью программы Samtools [20]. Аннотация генов была реализована средствами программы featureCounts [21] с учетом цепь-специфичности со следующими параметрами: -О--largestOverlap -s 1 -t gene -g gene_id. Версия генной аннотации ENCODE v47 [22]. Для визуализации полученных результатов был использован пакет для языка R ggplot2 [23].

Статистический анализ. Статистический анализ проведен в среде R 4.2. Непрерывные параметры представлены в виде медианы и интерквартильного размаха — Me [Q25; Q75]; дискретные — в виде абсолютных значений и относительных частот.

Вычисление главных компонент (PCA, principal component analysis) проводилось для центрированных и нормированных данных с помощью пакета factoextra [24]. Различия между двумя зависимыми выборками для уровней экспрессии оценивали при помощи стандартных тестов пакета DESeq2 (1.42.1) [25], для остальных непрерывных параметров — критерием Вилкоксона. Поправка на множественные сравнения проводилась на геномном уровне при помощи пакета DESeq2 (1.42.1) [25].

Следует отметить, что критерии и методы коррекции, предусмотренные пакетом DESeq2 по умолчанию разработаны для непарных данных геномного уровня, что может приводить к снижению мощности анализа в данном исследовании. Тем не менее их применение обосновано широкой распространенностью в данной области исследований и высокой воспроизводимостью результатов. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Для образцов обеих групп сравнения (контрольная группа и группа с длительным хранением плазмы) было проведено секвенирование в одном запуске в 2025г. Сравнительная характеристика обеих групп приведена в таблице 1.

Метод PCA был использован для определения однородности полученных данных и на основании данных об уровне экспрессии генов микроРНК человека показал разнородность двух групп (рисунок 1).

На основании данных NGS был проведен анализ дифференциальной экспрессии генов микроРНК человека. В группе с длительным хранением плазмы по сравнению с контролем обнаружено 116 микроРНК со статистически значимым повышением уровня экспрессии (рисунок 2, желтые, зеленые и красные точки), из которых у 86 наблюдалось более чем 2-кратное изменение (рисунок 2, зеленые и красные точки). Поскольку среднее количество чтений на образец составило 1,5 млн (при ожидаемых 5 млн согласно протоколу), для дальнейшего анализа установили пороговое значение среднего количества нормированных чтений (≥50 на выборку). После фильтрации число дифференциально экспрессируемых микроРНК составило 31 (рисунок 2, красные точки).

Влияние долгосрочного (от 1 года) хранения плазмы крови при различных температурах на уровни циркулирующих микроРНК исследовалось ранее преимущественно с использованием кПЦР [1][13][14]. В двух из них количество проанализированных микроРНК было <10 [1, 14]. Наибольшее число микроРНК (n=384) было проанализировано в исследовании Page K, et al. (2013): при анализе микроРНК в 10 образцах плазмы больных раком, хранившихся в течение 12 лет, было детектировано меньшее число микроРНК по сравнению со свежими образцами плазмы (177 и 202, соответственно), при этом значения CT и ΔCT значимо не различались [13].

В отличие от кПЦР метод NGS позволяет охватить весь спектр микроРНК в образце [12]. Проведенный поиск литературы выявил только одну работу с использованием NGS [10]. Дизайн этого исследования совпадал с нашим по следующим параметрам: использовался тот же набор для приготовления библиотек, NGS было проведено на таком же секвенаторе с одноконцевыми прочтениями длиной 75 п.н. [10]. В то же время, протокол приготовления плазмы (однократное центрифугирование при (1200 g при +4 оC в течение 10 мин), набор для выделения РНК и размер выборки (n=18) различались.

Кроме того, в этой работе не приведено технических данных, касающихся секвенирования образцов эксперимента по хранению, но приводятся данные для других экспериментов: в среднем, было получено 7 млн ридов на образец, из них 3 млн было картировано и 2 млн были с UMI [10].

В уже упомянутой работе [10] было выполнено сравнение образцов плазмы крови, хранившихся 3 года, с образцами, хранившимися 4 и 5 лет. Однако из описания не ясно, выполнялось ли секвенирование сразу по истечении исследуемых сроков хранения (т.е. через 3, 4 и 5 лет после получения плазмы) или же одномоментно по завершении максимального срока хранения плазмы с различными сроками хранения выделенной микроРНК. В нашем исследовании максимальный срок хранения плазмы (5 лет, группа с длительным сроком хранения плазмы) совпадал с работой [10]. Однако срок хранения плазмы в контрольной группе был меньше (1,5 года), а выделенная РНК хранилась 3,5 года до приготовления библиотек и секвенирования.

Полученные нами результаты показали значимое снижение концентрации библиотек, что согласуется с результатами работы [10], где также было показано значимое снижение концентрации библиотек при сравнении плазмы, хранившейся 3 года и 5 лет. При этом более чем 2-кратное увеличение уровня было установлено лишь для одной микроРНК, тогда как в нашем исследовании — для 31 микроРНК.

Приготовление плазмы в настоящем исследовании и в исследовании Suzuki K, et al. (2022) проводилось по схожим протоколам, включавшим однократное центрифугирование при 1200 g, что соответствует стандартным протоколам биобанкирования [10]. Согласно данным литературы, однократное центрифугирование не обеспечивает полного удаления тромбоцитов, а цикл замораживания/оттаивания плазмы резко увеличивает количество тромбоцитарных микрочастиц и существенно влияет на уровни детектируемых микроРНК [26]. Введение в пробоподготовку этапа дополнительного центрифугирования после разморозки плазмы перед выделением РНК способствует снижению количества остаточных тромбоцитов, но не позволяет полностью устранить контаминацию тромбоцитарными микроРНК [27]. Важно отметить, что в обеих сравниваемых группах настоящего исследования использовалась идентичная пробоподготовка плазмы крови и выделение РНК, что исключает возможность влияния различий в контаминации тромбоцитарными микроРНК на полученные результаты.

Ранее стабильность выделенной микроРНК при хранении после выделения была продемонстрирована только в одном исследовании с помощью оценки уровня spike-in микроРНК (cel-miR-39) в течение 12 мес. при -70 оC [2]. Полученные нами данные могут свидетельствовать о более высокой стабильности микроРНК при хранении в плазме (в составе экзосом и белковых комплексов) по сравнению с водными растворами, не содержащими нуклеаз.

Ограничением настоящего исследования был небольшой размер выборки и разная продолжительность сроков хранения библиотек до секвенирования в группах сравнения. Кроме того, количество чтений на образец, полученных в результате секвенирования, могло повлиять на глубину последующего анализа.

Результаты исследования продемонстрировали статистически значимые различия между группами: в образцах с длительным хранением плазмы наблюдалось снижение концентрации и размера библиотек по сравнению с контролем, а также выявлено 31 микроРНК с уровнем экспрессии, превышающим контрольные значения более чем в 2 раза. Сравнительный анализ показал более высокую стабильность циркулирующих микроРНК при хранении в плазме относительно водного раствора. Эти данные указывают на необходимость учета продолжительности хранения биологических образцов как важнейшего преаналитического фактора, что имеет принципиальное значение для обеспечения воспроизводимости результатов исследований микроРНК.