Апоптоз — это запрограммированная и регулируемая гибель клетки, в ходе которой клетка распадается на фрагменты, ограниченные мембраной, или апоптотические тельца. В норме эти фрагменты быстро поглощаются соседними клетками или макрофагами, не вызывая воспаления. Обычно весь процесс занимает от 1 до 3 ч. Его основная функция — удаление повреждённых, инфицированных или мутировавших клеток [1][2]. В сложных организмах апоптоз играет важную роль в развитии и формировании органов, поддержании постоянства внутренней среды и работе иммунной системы. Этот процесс характерен для всех эукариот — от простейших до высших форм жизни. Гибель клетки в результате апоптоза сопровождается сморщиванием и фрагментацией как самих клеток, так и их ядер, потерей микроворсинок и обширной деградацией хромосомной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) [3]. Характерным признаком апоптоза является распад ядерной ДНК на нуклеосомы [4], который происходит на заключительной стадии апоптоза. За процесс распада ядерной ДНК отвечает фермент — каспазо-­активируемая дезоксирибонуклеаза (ДНКаза) (Caspase-­activated DNase, CAD,) или β-субъединица фактора фрагментации ДНК (DNA fragmentation factor 40, DFF40). Его активность регулируется ингибитором — белком ICAD (Inhibitor of Caspase-­activated DNase) или DFF45. При активации каспазо-­активируемой ДНКазы — CAD, происходит расщепление комплекса субъединиц CAD/ICAD (DFF40 и DFF45), каспазами (ферментами апоптоза). Освобождение CAD, или DFF40, от ингибитора ICAD, или DFF45, позволяет этой субъединице фрагментировать ядерную ДНК [5][6]. Комплекс ICAD/CAD играет важную роль в апоптозе, регулируя баланс между развитием, дифференцировкой и гибелью клетки.

Кардиомиоциты подвергаются апоптозу при ин­фаркте миокарда, при ишемии/реперфузии и при сердечной недостаточности (СН) [7]. Место апоп­тоза в патогенезе других сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), в частности, атеросклероза, пока малоизучено. При этом, за период с 1990 по 2019гг число зарегистрированных случаев атеросклероза возросло практически вдвое, а ССЗ являются основной причиной смерти в мире (32% всех ежегодных случаев смерти в Восточной Европе, Центральной Азии и Центральной Европе) [8]. С учетом того, что взаимосвязь между ICAD и выраженным стенозом коронарных артерий у пациентов с ишемической болезнью сердца впервые была показана ранее [9], цель обзорной статьи заключалась в определении места апоптоза в патогенезе атеросклероза с акцентом на роль комплекса CAD/ICAD.

С целью анализа современных данных о роли комплекса CAD/ICAD в патогенезе атеросклероза, вклада апоптоза и воспаления в этот процесс, и определения перспективных направлений для дальнейших исследований в этой области, было проведено исследование баз данных PubMed, eLibrary (Science Index), по ключевым словам: апоптоз, ингибитор каспазо-­активируемой дезоксирибонуклеазы, CAD, ICAD, атеросклероз, воспаление, стерильное воспаление, макрофаги, каспазы, провоспалительные каспазы, онкология, apoptosis, inhibitor of caspase-­activated DNase, CAD, ICAD, athe­ro­sclerosis, inflammation, sterile inflammation, mac­ro­phages, caspases, pro-inflammatory caspases, on­co­logy с глубиной поискового запроса с 1980 по 2024гг. В итоге, в обзор было включено 45 источников литературы.

Атеросклероз, хроническое воспалительное заболевание артерий, является ведущей причиной ССЗ в развитых странах, в результате которого формируется субстрат таких заболеваний как ишемическая болезнь сердца, ишемический инсульт, тромбоз — атеросклеротические бляшки (АСБ) [10].

Холестериновая теория развития атеросклероза, разработанная Н. Н. Аничковым и С. С. Халатовым, остается основополагающей в современном понимании атеросклероза. Согласно этой теории, нарушение липидного обмена [10][11] приводит к формированию АСБ в сосудистой стенке. Согласно современным данным, наряду с генетической предрасположенностью, к патологии сердечно-­сосудистой системы [12] приводят дисфункция эндотелия [13] и окислительный стресс, характеризующийся избыточным образованием активных форм кислорода (АФК) и свободных радикалов. Эти соединения инициируют перекисное окисление липидов [14], вызывают повреждение клеточных структур, включая ДНК и белки. Роль дислипидемии, свободно-­радикального окисления и воспаления как ключевых факторов развития атеросклероза была продемонстрирована в ряде исследований [15][16], проспективные исследования выявили надежную взаимосвязь между воспалением и риском возникновения сердечно-­сосудистых событий (рисунок 1) [17].

Эндотелиальная дисфункция и вызывающие ее ме­ханизмы

Патогенетический каскад атеросклероза запускается с момента механического нарушения целостности сосудистого эндотелия, происходящего вследствие турбулентного течения крови в местах разветвления артерий, особенно, при повышенном артериальном давлении. Прямое действие повреждающего фактора вызывает выброс цитокинов: интерлейкинов (ИЛ) — ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8 и фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α), матриксных металлопротеиназ, прокоагулянтного тканевого фактора роста, которые инициируют хемотаксис иммунных клеток в очаг повреждения. Циркулирующие моноциты прилипают к поврежденному участку артериальной стенки и проникают внутрь, дифференцируются в макрофаги, которые активно участвуют в поглощении липидов посредством фагоцитоза и дают начало пенистым клеткам, которые в большом количестве присутствуют в АСБ. Согласно этой концепции, повреждение эндотелия приводит к агрегации тромбоцитов и высвобождению тромбоцитарных факторов, которые вызывали пролиферацию гладкомышечных клеток в интиме артерий. Затем эти клетки генерируют внеклеточный матрикс, который удерживает липопротеины, образуя очаг АСБ. Помимо гладкомышечных клеток, в атеромах были выявлены иммунные клетки, что подтверждает участие воспалительного процесса в развитии этого заболевания.

Сосудистый эндотелий контролирует тонус сосудистой стенки, секретируя вазоактивные агенты — вазодилататоры (оксид азота, NO), простациклин) и вазоконстрикторы (эндотелин-1, ангиотензин II), которые регулируют сосудистый рост, процессы тромбообразования, воспаления и окислительные реакции. Ключевым звеном развития эндотелиальной дисфункции становится окислительный стресс, при котором снижение биодоступности NO сочетается с повышенной генерацией АФК. АФК, основным источником которых является восстановленный ни­ко­тин­амидадениндинуклеотидфосфат (НАДФН)-ок­си­даза типа NOX2, угнетают активность эндотелиальной NO-синтазы, основного фермента, синтезирующего NO в сосудистом эндотелии [18].

Стерильное воспаление и воспаление, индуцированное патогеном

Стерильное воспаление — это воспалительная реакция, ассоциированная с повреждением АТФ или ДНК и др. высвобождаемыми компонентами, вследствие нарушения целостности клетки, при отсутствии патогенов. Стерильное воспаление возникает после повреждения тканей, например, ишемии, травмы или воздействия токсинов с целью удаления обломков клеток и инициации реакций восстановления тканей [19].

Воспаление, индуцированное патогеном (или инфекционное), ассоциировано с патогенами, такими как эндотоксин и другие липополисахариды бактерий, вирусная рибонуклеиновая кислота (РНК) и др., характеризуется иммунным ответом на инфекцию, направленным на устранение вторгшихся микроорганизмов и зараженных клеток. Оба типа воспаления часто характеризуются схожей сигнальной регуляцией, связанной, например, с активацией инфламмасом и каспазы-1, что приводит к созреванию провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1β [20].

Роль макрофагов и аутофагии в атеросклерозе

Макрофаги играют центральную роль в патофизиологии атеросклероза и их функции тесно связаны с клеточным процессом аутофагии. Ауто­фагия представляет собой защитный механизм, обеспечивающий переработку и утилизацию поврежденных клеточных компонентов. Исследования показывают, что нарушение регуляции ауто­фагии в макрофагах способствует развитию ате­ро­склероза за счет следующих механизмов: во-первых, аутофагия регулирует процессы апоптоза и некроптоза макрофагов в АСБ, влияя на стабильность ее фиброзной покрышки. Во-вторых, аутофагия модулирует воспалительную активность макрофагов, контролируя секрецию провоспалительных цитокинов. В-третьих, аутофагия участвует в метаболизме холестерина и формировании пенистых клеток — ключевого элемента атеросклеротических поражений. Дисфункция аутофагических процессов в макрофагах приводит к накоплению апоптотических клеток, усилению воспаления и нестабильности АСБ, что повышает риск ее разрыва и развития сердечно-сосудистых осложнений [21].

Показано, что атеросклероз тесно связан с различными формами запрограммированной клеточной гибели помимо апоптоза: пироптозом и аутофагией. Пироптоз — это форма запрограммированной клеточной гибели, опосредованная инфламмасомами, которая усугубляет местные воспалительные реакции, высвобождая провоспалительные факторы (например, ИЛ-18 и ИЛ-1β) и способствуя нестабильности бляшек и тромбозу. Аутофагия — это процесс, который помогает поддерживать здо­ровье клеток, разрушая поврежденные клеточные структуры и аномальные белки. Митофагия, специализированная форма аутофагии, имеет важное значение для окислительно-­восстановительного гомеостаза и регуляции воспаления. Нарушение регуляции аутофагии может оказывать негативное воздействие на клеточный гомеостаз, что, в свою очередь, ускоряет прогрессирование атеросклероза. В экспериментах показано, что при ингибировании NOD-подобного рецепторного белка 3 (NLRP3) одноименной инфламмасомы под воздействием полидатина — противовоспалительного средства, производного ресвератрола — наблюдается активация аутофагии и снижение пироптоза, оказывающее антиатеросклеротическое действие [22]. В свою очередь, воспалительные медиаторы, высвобождающиеся во время пироптоза, могут вызывать нарушение аутофагии, что усугубляет гибель клеток и воспалительную реакцию. ­Нарушение ауто­фагии также способствует возникновению и прогрессированию пироптоза. Оба ­процесса играют важную роль в развитии атеросклероза (рисунок 2) [22]. Апоптоз далеко не единственный механизм программируемой гибели клеток при сердечно-сосу­дистой патологии (рисунок 2).

В последние 20 лет интерес научных исследований простирается далеко за пределы взаимосвязи уровня холестерина с атерогенезом и фокусируется на изучении деталей воспалительного ­процесса, апоптоза в патогенезе различных заболеваний, в т.ч. аутофагии в развитии атеросклероза [21]. Тем не менее, роль апоптоза в патогенезе атеросклероза остается малоизученной.

Уже известно о множестве разных механизмов клеточный гибели и их роли в процессе смерти кардиомиоцитов, которые представлены на рисунке 2, однако в данном обзоре в основном речь пойдет об апоптозе.

Апоптоз играет ключевую роль в эмбриогенезе, поддержании тканевого гомеостаза и устранении поврежденных клеток. В отличие от некроза, апоптоз протекает без развития воспалительной реакции и характеризуется специфическими морфологическими изменениями. Маргинализация хроматина, конденсация и фрагментация ядра — одни из самых характерных визуальных морфологических маркеров апоптоза — основа его гистологического определения [23]. Фрагментация ДНК настолько специ­фична для апоптоза, что легла в основу широко используемого гистохимического метода TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling), позволяющего выявлять апоптотические клетки in situ по наличию свободных 3'-OH концов фрагментированной ДНК [24]. Независимо от происхождения апоптотического стимула, апоптоз активируется семейством каспаз, присутствующих в развивающихся клетках в виде неактивных предшественников [25]. В исследовании Liu X, et al. предполагается, что протеолиз ключевого регулятора апоптотического пути — гетеродимерного комплекса CAD/ICAD может быть одним из фундаментальных событий в запуске апоптоза, ведущего к формированию АСБ [6]. Активация каспаз запускает протеолитический каскад, который необратимо разрушает ключевые клеточные структуры [26].

Апоптоз инициируется двумя основными путями: внешним и внутренним (рисунок 3). Внешний путь активируется сигналами, которые опосредуют рецепторы, стимулирующие гибель клетки, или так называемые рецепторы смерти (Death Receptors, DR), располагающиеся на клеточной поверхности и запускающие каскад реакций, инициирующим звеном которого служит каспаза-8. Классическим примером стимулятора внешнего пути апоптоза служит член суперсемейства рецепторов ФНО-6 (TNFRSF6) — Fas-рецептор (FasR), также известный как апоптозный антиген 1 (APO-1 или APT), кластер дифференцировки 95 (CD95) [27-29]. Лигандом рецептора Fas (FasL) может быть белок семейства ФНО. Экспрессия FasR строго регулируется и повышается в активированных T-лимфоцитах, NK (Natural killer-­клетках) (цитотоксических лимфоцитах), а также в клетках иммунопривилегированных тканей, таких как глаза и семенники, где этот рецептор участвует в поддержании иммунной толерантности [24][30].

Важную роль в интеграции различных апоптотических сигналов играют митохондрии. Внутренний (митохондриальный) путь (рисунок 3) активируется в ответ на повреждение ДНК, окислительный стресс или недостаточность факторов роста, что приводит к увеличению проницаемости митохондриальной мембраны, высвобождению цитохрома С и формированию апоптосомы, активирующей каспазу-9 [31].

Оба пути активируют эффекторные каспазы-3 и -7, что приводит к фрагментации ядра и белков цитоскелета, а также деградации сотни других клеточных белков, включая ламины. Этот процесс имеет характерные морфологические признаки, свой­ственные апоптозу [26][32].

Каспазы представляют собой семейство цистеиновых протеаз, которые осуществляют специфичный гидролиз пептидных связей по цистеину.

На основании места в сигнальных каскадах и функций и каспазы делятся на три группы. Инициаторные каспазы (например, каспаза-8, -9) содержат длинные N-концевые эффекторные домены (DED (death-­effector domain) или CARD (caspase activation and recruitment domain) — "домен активации и рекрутирования каспазы"), которые участвуют в образовании крупных комплексов, таких как апоптосома или DISC (death-­inducing signaling complex), что приводит к их самоактивации [33].

Эффекторные каспазы (например, каспаза-3, -7), активируясь под действием инициаторных каспаз, осуществляют расщепление клеточных структур и ферментов репарации ДНК [34]. Критическая роль в апоптотической фрагментации ДНК отводится эффекторной каспазе-3, которая является основным активатором CAD за счет расщепления его ингибитора ICAD [35][36]. Воспалительные каспазы (например, каспаза-1, -4, -5) регулируют не апоптоз, а процесс пироптоза, представляющего собой воспалительную литическую форму гибели клетки, преимущественно за счет активации цитокинов [37][38]. Такие каспазы, как каспаза-1, ответственны за процессинг и активацию провоспалительных цитокинов ИЛ-1β и ИЛ-18, что является важным звеном врожденного иммунного ответа [39].

Структурно неактивные предшественники кас­паз, прокаспазы, состоят из трех доменов: N-кон­це­во­го пропептида, большой (p20) и малой (p10) субъединиц. Их активация происходит путем протеолитического расщепления консервативных участков, располагающихся между этими доменами. В результате формируется активный фермент, представляющий собой тетрамер, состоящий из двух димеров p20/p10, в активном центре которого находится остаток цистеина [40].

Существует две основных изоформы ICAD: длинная (полноразмерная) (ICAD-L, long, DFF45) и короткая (ICAD-S, short, DFF35). Полноразмерная форма ICAD-L представляет собой белок с молекулярной массой 45 кДа, состоящий из 331 аминокислотного остатка. Короткая форма ICAD-S синтезируется путем альтернативного сплайсинга ICAD-L, в результате которого последовательность из первых 256 аминокислотных остатков одинакова для обеих форм [5]. ICAD-L состоит из 3 структурных доменов: N-концевой внутренний домен (NID), ингибиторный домен и С-концевой внутренний домен (CID). NID необходим для правильного фолдинга и димеризации с CAD. CID, встроенный в активный центр CAD, стерически блокирует его ДНКазную активность [41][42]. Молекула ICAD конформационно вытянута, что позволяет ей обволакивать CAD, удерживая эту субъединицу в неактивном состоянии до момента активации путем протеолиза каспазами [42]. Подобное строение ICAD-L обеспечивает правильный фолдинг CAD в процессе синтеза этой субъединицы [6][38]. Гетеродимерный комплекс в ядре клетки, состоящий из CAD (DFF40) и ICAD (DFF45), не проявляет активности вне апоптотического каскада. Однако на завершающей стадии апоптотического каскада ICAD подвергается расщеплению, что приводит к высвобождению CAD из гетеродимерного комплекса CAD/ICAD (рисунок 4) [5]. В результате диссоциации комплекса CAD/ICAD, CAD приступает к расщеплению ДНК хромосом [5].

Примечания: на схеме представлена модель CAD-опосредованной фрагментации ДНК во время апоптоза. Белок CAD синтезируется на рибосоме. ICAD-L (long), связываясь с формирующейся полипептидной цепью CAD, способствует её правильному сворачиванию (фолдингу). По завершении синтеза CAD, ICAD остается в составе комплекса с CAD (CAD/ICAD или DFF). Когда апоптотические стимулы активируют каспазы, каспаза-3, расщепляет ICAD. Высвобожденный белок CAD фрагментирует хромосомную ДНК. (Адаптирован из [40]).

мРНК — матричная РНК (рибонуклеиновая кислота), ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, ICAD (long) — ингибитор каспазо-активируемой ДНКазы, CAD — каспазо-активируемая ДНКаза.

Основным механизмом, лежащим в основе лучевой и химиотерапии онкологических заболеваний, является целенаправленное повреждение ДНК, включающее двунитевые разрывы, алкилирование оснований и сшивки. Накопление таких повреждений распознается клеткой как критический проапоптотический сигнал, активирующий внутренний (митохондриальный) апоптотический путь, кульминацией которого является протеолитическая активация эффекторных каспаз. При этом, каспазы-3 и -7 катализируют расщепление субъединиц CAD/ICAD [43], что является необходимым звеном в активации CAD и фрагментации ДНК [5][44].

Установлено, что в клетках, лишенных нормального гена ICAD, например, в клетках, экспрессирующих мутантный ICAD, устойчивый к действию каспаз, фрагментации ДНК во время апоптоза не происходит, хотя и наблюдаются некоторые другие признаки апоптоза [31]. Это указывает на то, что регуляция CAD/ICAD является доминирующей в фрагментации ДНК вследствие апоптоза. Важность системы регуляции CAD/ICAD была отмечена при изучении острого миелоидного лейкоза — распространенного злокачественного заболевания, для которого на практике регистрировались случаи первичной химиорезистентности и высокие показатели рецидивов заболевания [43]. Было обнаружено, что индукция апоптоза многими химио­терапевтическими агентами напрямую зависит от каспазо-­зависимого расщепления ICAD с последующей активации CAD [5][44]. Нарушение этого пути (например, снижение экспрессии ICAD, мутации) может быть одним из молекулярных механизмов резистентности к химиотерапии. Кроме того, нарушение регуляции ICAD/CAD может быть связано с резистентностью к терапии не только в случае острого миелоидного лейкоза, но и других видов рака [43].

Было показано, что гипоксия активирует апоптоз даже в кардиомиоцитах нормальной ткани. Роль регуляции CAD/ICAD при сердечно-­сосудистой патологии пока малоизучена. Предполагается, что наблюдаемое при СН снижение гемодинамических возможностей сердца может быть обусловлено нарушенной регуляцией апоптоза, в результате чего происходит избыточная утилизация жизнеспособных кардиомиоцитов. Согласно Todor, et al. (2002), возникающие при СН отклонения на молекулярном уровне понижают порог резистентности клеток к различным стрессовым факторам, способным провоцировать апоптоз (рисунок 3). Для подтверждения этой гипотезы из 18 человеческих сердец, эксплантированных во время трансплантации сердца по поводу ишемической кардиомио­патии (n=9) или идиопатической дилатационной кардиомиопатии (n=9), были выделены кардиомио­циты. В качестве контроля использовалась ткань пяти нормальных донорских сердец, для которых не было подходящего реципиента. Кардиомиоциты инкубировали в течение 3 ч в нормоксических (95% воздуха-5% CO2) или гипоксических (95% N2-5% CO2) условиях. Экспрессию каспазы-3 и ICAD анализировали методом вестерн-­блота. В кардиомиоцитах нормальных донорских сердец 3-часовая гипоксия не повлияла на экспрессию этих белков (каспазы-3 и ICAD). Напротив, гипоксия привела к появлению активных форм каспазы-3 и ICAD как при ишемической кардиомиопатии, так и при идио­патической дилатационной кардиомиопатии. Таким образом, было показано, что кардиомиоциты при СН восприимчивы к индуцированному гипо­ксией апоптозу. Полученные результаты указывают на активацию CAD/ICAD при гипоксии в патологически измененном миокарде [44].

Выявленная взаимосвязь ICAD с выраженными атеросклеротическими поражениями коронарных артерий [9], указывает на определённую роль белка ICAD в атерогенезе, которая может быть связана с его ключевой функцией — контролем апоптоза и предотвращением вторичного некроза клеток внутри АСБ. В основе этого механизма лежит следующая патогенетическая цепь событий: в АСБ макрофаги и гладкомышечные клетки подвергаются активному апоптозу и на ранних стадиях этого процесса ICAD, ингибируя CAD, блокирует фрагментацию ядерной ДНК [45]. Однако при нарушении своевременной утилизации апоптотических клеток, известной как эффероцитоз, характерной для атеросклеротического микроокружения, клетки переходят в стадию вторичного некроза. На этой стадии активированные каспазы расщепляют комплекс ICAD/CAD, высвобождая CAD. Активированная субъединица CAD катализирует фрагментацию ДНК. Процесс завершается разрывом клеточной мембраны и высвобождением провоспалительного и тромбогенного содержимого, включающего фрагменты ДНК.

Таким образом, протеолиз комплекса CAD/ICAD c последующей активацией CAD, представляет собой критический молекулярный переключатель, преобразующий контролируемый "тихий" апоптоз в провоспалительный и дестабилизирующий некроз, способствующий прогрессированию и осложнениям атеросклероза. Исследование этих процессов открывает новые перспективы для поиска терапевтических мишеней, направленных на стабилизацию АСБ.

Отношения и деятельность. Государственное задание: "Создание базы протеомных профилей сыворотки крови основных хронических неинфекционных заболеваний как платформы для рационального выбора биомаркеров и разработки специфических диагностических систем" № 124013100889-7.