Создание коллекции образцов компонентов крови больных множественной миеломой

Введение

Множественная миелома (ММ) — В-клеточная злокачественная опухоль, характеризующаяся мультифокальной пролиферацией неопластических плазматических клеток, которые продуцируют моноклональный иммуноглобулин (Ig). ММ — это второе по распространенности гематологическое злокачественное новообразование в мире с ежегодной заболеваемостью 1% от всех злокачественных опухолей и 10-15% от всех опухолей системы крови [1]. У большинства пациентов ММ характеризуется секрецией Ig, который продуцируется аномальными плазматическими клетками. Однако у 15-20% пациентов клетки ММ секретируют только моноклональные свободные легкие цепи, а у <3% пациентов эти клетки не секретируют моноклональный белок. Клинические и биологические особенности ММ связаны с генетическими аберрациями, такими как перестройка локусов генов тяжелой цепи Ig, мутации соматических генов и хромосомные делеции, хромосомная гиперплоидия с участием нечетного числа хромосом. Всё это обуславливает высокую вариабельность течения болезни [2]. Одной из проблем при лечении ММ является значительная генетическая клональная гетерогенность заболевания. Имеющиеся биомаркеры не учитывают эту особенность ММ, поэтому для лучшего прогнозирования течения заболевания и отслеживания реакции на лечение необходима разработка более совершенных биомаркеров.

В некоторых случаях у пациента отсутствуют признаки активности заболевания, поэтому между временем установки диагноза и определением терапевтической тактики врач вынужден наблюдать пациентов несколько недель и даже месяцев. Потеря времени начала терапии может привести к стремительному развитию осложнений заболевания, затруднению лечения и неэффективности терапии.

Поскольку ММ обладает значимой вариабельностью клинических проявлений и высокой активностью патологического процесса, для принятия решений относительно терапии и лечения ММ руководствуются показателями биомаркеров [3]. Существует много типов биомаркеров, в общих чертах их можно разделить на молекулярные, гистологические, физиологические или, в некоторых случаях, радиографические [4]. Достижения в терапии за последние два десятилетия улучшили результаты лечения пациентов, в то время как использование новых технологий расширило понимание молекулярных факторов, лежащих в основе возникновения и прогрессирования заболевания [5]. Но, несмотря на их важность и потенциал в лечении ММ, фактическое количество биомаркеров, которые в настоящее время регулярно используются, по-прежнему невелико.

Значительные успехи были достигнуты в понимании молекулярных механизмов развития ММ, что способствовало появлению более сложной классификации, которая включает не только традиционные диагностические критерии, но также иммунофенотип, генетические и молекулярные особенности [6].

Все чаще встречаются исследования по поиску биомаркеров, ассоциированных с различными заболеваниями, где в качестве биоматериала используют коллекции образцов, предоставленные биобанком. Такие коллекции уже содержат клиническую и лабораторную информацию о пациентах, патологии, типах собранных тканей, проверки качества биообразцов и температурных режимах криоконсервации. Например, на базе биобанка Первой дочерней больницы Университета Чжэнчжоу в Китае проводятся исследования, посвященные профилированию метаболизма триптофана у пациентов с сахарным диабетом 2 типа с диабетической гломерулопатией [7].

Salvatore M, et al. (2021) совместно с коллегами, основываясь на данных, полученных из биобанка Великобритании, занимаются фенотипической оценкой риска развития рака поджелудочной железы на ранних этапах [8].

Илларионов Р.А. и др. (2020) на базе биобанка лаборатории геномики с группой биоресурсных коллекций отдела геномной медицины ФГБНУ “НИИ АГиР им. Д.О. Отта” создают коллекцию образцов беременных женщин на разных сроках гестации с целью поиска ранних биомаркеров преждевременных родов. Поскольку сбор биоматериала от женщин на протяжении всей беременности и в родах — крайне сложный процесс, создание подобной коллекции является значимым заделом для будущих фундаментальных и прикладных исследований в области биомедицины [9].

С 1984г по настоящее время в МРНЦ им. А. Ф. Цыба — филиале “НМИЦ радиологии” Минздрава России ведутся работы по формированию клеточного биобанка. В частности, под руководством профессора А. Г. Коноплянникова был проведен ряд экспериментов по изучению введения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) лабораторным животным и оценке возможной роли МСК в случае антрациклиновой кардиомиопатии. Полученные результаты позволили разработать внутренний протокол использования МСК при кардиотоксической химиотерапии. Создание клеточного биобанка дает возможность рассматривать метод клеточной терапии как один из перспективных для применения в клинической практике [10].

В настоящее время в России биобанки активно развиваются, о чем свидетельствует создание в 2018г Национальной ассоциации биобанков и специалистов по биобанкированию (НАСБИО), основной целью которой является объединение специалистов РФ в области биобанкирования, а также налаживание взаимодействия с мировым профессиональным сообществом для реализации крупномасштабных исследовательских проектов. В 2019г Биобанк ФГБУ “НМИЦ онкологии” Минздрава России стал одним из членов НАСБИО [11].

Целью настоящей работы было создание на базе биобанка ФГБУ “НМИЦ онкологии” Минздрава России г. Ростова-на-Дону коллекции биообразцов ММ для потенциальных фундаментальных и прикладных исследований в области биомедицины. Бесперебойный доступ к образцам крови больных ММ поспособствует определению конкретных генетических мутаций, которые играют важную роль в патогенезе ММ, что может дать исследователям преимущество в открытии новых стратегических методов лечения пациентов с ММ.

Материал и методы

Биологические образцы и аннотируемые данные собираются для исследования с помощью биобанкирования — процесса, который координируется биобанком. В коллекцию образцов ММ были включены биологические образцы, полученные от пациентов >18 лет с диагнозом ММ, которые проходили лечение в НМИЦ онкологии с 2019г. Отбор больных проводился методом рандомной выборки по мере поступления в отделение онкогематологии.

По этическим причинам согласие на участие пациентов является ключевым вопросом. Уважение прав и достоинства пациентов лежит в основе медицинского прогресса. Поэтому в проект были включены только больные, подписавшие информированное согласие на использование их биоматериала в научных целях (рисунок 1).

Объектом исследования была венозная кровь, забор которой проводился утром с 8 до 9 ч, натощак, из локтевой вены в пробирки 4-х типов (рисунок 2).

Для выделения сыворотки крови использовали пробирки BD Vacutainer Plus Serum (красная крышка), на Рис. 2 Пробирки для выделения сыворотки, плазмы и мононуклеарной фракции крови. стенки которых напылен активатор свертывания (кремнезем).

Плазму крови выделяли из пробирок с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) BD Vacutainer, содержащих К2ЭДТА (сиреневая крышка) и CTAD BD Vacutainer с буферным раствором цитрата, аденозина, теофилина и дипиридамола для стабилизации гепарина в условиях in vitro.

Мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови выделяли с применением пробирок BD Vacutainer CPT с антикоагулянтом (цитрат натрия) и разделительной системой гель/Ficoll^TM. Ficoll^TM — сильно разветвленный гидрофильный полисахарид, позволяющий отделить фракцию МНК при центрифугировании. Полиэфирный гель обеспечивает разделение осадка клеток крови от плазмы и МНК и предотвращает их смешивание. Внутренняя поверхность пробирок покрыта силиконом, что позволяет предотвратить неспецифическую активацию клеток.

Для выделения сыворотки и плазмы крови материал в пробирках осаждали в центрифуге ЦЛМН-Р10-01- “Элекон” (Элекон-М, Россия) при 1500 об./мин в течение 15 мин, после чего супернатант отбирали в стерильные криопробирки и замораживали в парах жидкого азота.

Для выделения МНК пробирку центрифугировали. Стандартный принцип метода выделения МНК путем центрифугирования в градиенте фиколла-урографина основан на разделении клеточных элементов крови при центрифугировании по плотности, удельная плотность фиколла-урографина составляет 1,077 г/см³. Фиколл выступает в роли агрегатора эритроцитов, а урографин необходим для создания плотности 1,077 г/см³ и изотоничности [12]. После центрифугирования происходит разделение крови на 4 фракции: первая фракция содержит эритроциты, тромбоциты и гранулоциты, которые осаждаются на дно пробирки, вторая фракция — фиколл-урографин, третья фракция, расположенная непосредственно над фиколлом, представляет собой опалесцирующую мононуклеарную фракцию, в которую входят лимфоциты, субпопуляция моноцитов и бластные гемопоэтические клетки, четвертая фракция — плазма крови (рисунок 3 А). Недостатоком такого метода является наличие остаточных сгустков эритроцитов в слое МНК, которые контаминируют выделяемую фракцию. В настоящей работе применяли пробирки с разделительной системой гель/Ficoll^ТМ (рисунок 3 Б), где эритроциты, тромбоциты и гранулоциты проходят не только через градиент плотности, но и под давлением в результате центрифугирования на высоких скоростях продавливаются через разделительный гель, что гарантирует чистоту выделения МНК. Полученные МНК осаждали дважды в стерильном фосфатно-солевом буфере при 1500 об./мин в течение 5 мин и переносили в стерильные криопробирки для дальнейшей криоконсервации в парах жидкого азота.

Все образцы содержатся в криохранилище биобанка при температуре от -65 до -196^оС. Диапазон температур отображается на мониторе криогенного резервуара в режиме реального времени и определяется заданными техническими характеристиками.

Регистрация, учет и паспортизация материала осуществляются с использованием таблиц MS Office Excel, а также специализированного программного обеспечения FreezerPRO (RuRo), которое представляет собой визуальную базу данных для учета и хранения информации о биологических образцах (рисунок 4).

Электронный каталог разработан в виде базы данных, в которой содержится информация о полученных образцах. Каждому образцу присвоен уникальный идентификационный номер. Помимо идентификационного номера в каталоге собраны персональные, клинические и лабораторные данные о пациентах, а именно: лабораторный номер пациента, пол, дата рождения, возраст, место проживания, национальность, классификация по международной классификации болезней 10 пересмотра (МКБ-10), диагноз и стадия заболевания, сопутствующие заболевания, результаты иммунофиксации сыворотки крови, дата забора и заморозки образца. Все персональные данные пациентов помещены в архив с ограниченным доступом.

Результаты

В настоящее время работа по составлению коллекции ММ продолжается. По состоянию на август 2021г в криохранилище биобанка ФБГУ “НМИЦ онкологии” Минздрава России хранится 175 образцов сыворотки крови, плазмы и МНК
больных ММ. Образцы были получены от 32 пациентов обоих полов (11 мужчин и 21 женщина) в возрасте 40-79 лет (средний возраст 59,5±1,65 лет). Диагноз был установлен на основании данных клинического обследования: спиральная рентгеновская компьютерная томография органов брюшной полости, грудной клетки, малого таза, головного мозга, электрофорез белков сыворотки крови, миелограммы [13]. Разделение пациентов на возрастные группы выполнено согласно классификации Всемирной организации здравоохранения (рисунок 5 А).

На рисунке 5 Б представлено распределение пациентов по стадиям заболевания. Было отмечено, что превалирующее большинство пациентов (69%) поступило со II стадией заболевания, что в 2,5 раза превышало долю больных с III стадией заболевания (28%). Также в выборке присутствует 1 пациент с I стадией ММ.

На рисунке 5 В представлено распределение пациентов по национальной принадлежности. Согласно опросу и визуальной оценке, в выборке преобладали пациенты европеоидного типа. Преобладающая часть больных проживала в Ростовской области (53%), в 3,3 раза меньше в Краснодарском крае (16%) и в Республике Дагестан (16%), остальные — в Республике Калмыкия (3%), Чеченской республике (3%) и Ставропольском крае (9%) (рисунок 5 Г). При этом стоит отметить, что ФГБУ “НМИЦ онкологии” Минздрава России консультирует, обследует и лечит в основном жителей 15 территориальных образований Южного и Северо-Кавказского федеральных округов.

Обсуждение

Для прогнозирования риска прогрессирования бессимптомной (“тлеющей”) ММ (M-градиент в сыворотке ≥30 г/л или в моче >500 мг/24 ч и/или клональные плазмоциты в костном мозге (КМ) 10- 60%, отсутствуют критерии органного поражения, ассоциированного с миеломной болезнью (CRAB), и опухолевый биомаркер SLiM, без первичного AL-амилоидоза) становится актуальной генетическая характеристика [14], которая является фундаментальным прогностическим фактором выживаемости при активной ММ [15]. Для генетического скрининга пациенты проходят многократную аспирацию КМ, что, помимо болезненности процедуры, может быть не полностью репрезентативным из-за очагового поражения КМ, пространственной гетерогенности генома или экстрамедуллярной опухоли (ЭМ). Многорегиональное секвенирование КМ из верхней части заднего гребня подвздошной кости и очаговых поражений в работе Rasche L, et al. (2017) у >75% пациентов показало пространственную геномную гетерогенность [16]. В связи с этим растет интерес к альтернативным стратегиям мониторинга генетического ландшафта медуллярных и ЭМ опухолевых плазматических клеток.

Жидкостная биопсия — анализ клеток или клеточных продуктов, выделяемых опухолями в периферическую кровь, является минимально инвазивным подходом для мониторинга генетических изменений. В результате апоптоза или некроза опухолевых и нормальных клеток, в большей части из гемопоэтических, происходит высвобождение внеклеточной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) (вкДНК); вкДНК опухолевого происхождения в зависимости от типа и стадии опухоли может присутствовать в очень низких концентрациях [17].

Интересно, что при таргетном секвенировании вкДНК при ММ были получены результаты, по большей части совпадающие с теми, что были получены в исследованиях аспирата КМ [18][19]. Причиной этого может являться высокая генетическая гетерогенность ММ между пациентами и в каждом отдельном случае [20]. Не стоит исключать и возможность того, что изменение числа копий может являться краеугольным камнем прогнозирования на генетической основе [21]. Полноэкзомное секвенирование вкДНК при ММ в исследовании Manier S, et al. (2018) дало информацию о генетических профилях и показало их высокую схожесть с аспиратами КM, но ограничивалось применением у <25% пациентов с данным заболеванием (при циркулирующей опухолевой ДНК ≥10% от общей вкДНК) [22]. Следовательно, существует необходимость альтернативных стратегий для всесторонней неинвазивной генетической характеристики ММ.

В работе Ravi G, et al. (2021) указали, что средний возраст пациентов с ММ на момент постановки диагноза составляет 66-70 лет [23]. Nandakumar B, et al. (2019) проводили исследование по оценке выживаемости пациентов с диагнозом ММ, в котором приняли участие 3449 человек с вышеуказанным диагнозом, поставленным в период 2004-2017 гг. Средний возраст пациентов составлял 64 года [24].

Исследование Razavi P, et al. (2019) показало, что подавляющее большинство мутаций вкДНК имеют особенности, соответствующие клональному гематопоэзу [25], что подчеркивает важность секвенирования вкДНК при отсутствии опухолевых клеток или ДНК зародышевой линии, например, Т-клеток.

Одной из альтернативных стратегий для неинвазивной генетической характеристики ММ может быть применение циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) [26], количество которых в ПК является прогностически значимым у пациентов с моноклональной гаммапатией неопределенного значения, бессимптомной и активной MM [27][28]. ЦОК обеспечивают прямую оценку ДНК опухоли и, несмотря на минимальную доступность материала из-за низкой чистоты сортировки с помощью иммуномагнитных шариков CD138, продемонстрировали высокую согласованность между генетическими изменениями в образцах циркулирующей опухолевой ДНК, ЦОК и КМ от 4-х пациентов. Однако в исследовании Mishima Y, et al. (2017) при сравнении данных мутационного профиля ЦОК и опухолевых клеток КМ от 8-и пациентов с ММ были получены противоречивые результаты [29]. Наконец, в сравнительно недавней работе Garces JJ, et al. (2020) было определено, что примерно 2/3 всех вариантов и большинство MMрекуррентных мутаций являются общими для опухолевых клеток КМ и ЦОК. Интересно, что некоторые из них были клональными в одном образце, но субклональными в другом, что предполагает транспортировку опухолевых клеток из отдаленных участков КМ (или ЭM), которые могут не нести эти мутации или иметь их на субклональных уровнях [30].

Поиск новых биомаркеров ММ остается актуальной проблемой, поэтому необходимо провести исследование различного биоматериала, доступ к которому выполняется наименее инвазивным и травматичным способом. Кроме того, по опыту, выделение ЦОК, изучение которых вызывает огромный интерес, возможно на градиенте плотности 1,077 г/см³ в слое с МНК. Вероятно, аспираты КМ продолжат оставаться золотым стандартом для генетической характеристики пациентов с MM. Однако, если неинвазивный скрининг станет возможным, широко применимым и даст прогностически значимую информацию, его можно будет рассматривать как дополнительный подход к стратификации больных, позволяющий хотя бы частично избежать аспирации КМ в течение клинического курса у некоторых пациентов.

Заключение

Идентификация биомаркеров при ММ чрезвычайно важна для снижения затрат на терапию и для повышения чувствительности молекулярного мониторинга, позволяющего на ранней стадии идентифицировать группы риска с точки зрения неэффективности лечения или плохого прогноза. Отсутствие доступа к нужным биообразцам — серьезная проблема. Совершенствование механизмов, обеспечивающих надлежащий и эффективный доступ исследователей при сохранении целостности клинических архивов и соблюдение требований, установленных потребностями клиницистов, имеет решающее значение. Благодаря накопленному опыту проведения работ, а также стандартизации отчетности, Биобанк ФГБУ “НМИЦ онкологии” Минздрава России служит ценным ресурсом для обеспечения исследований в области разработки новых предиктивных молекулярных маркеров.

Результатом проделанной работы служит коллекция из 175 образцов сыворотки крови, плазмы, фракции мононуклеарных клеток периферической крови больных ММ. Проведена паспортизация образцов с указанием дополнительной информации о месте проживания, национальности, диагнозе и стадии заболевания, а также сопутствующей патологии. Данные биообразцы послужат материалом для дальнейших фундаментальных исследований.

Благодарности. Авторы выражают глубокую признательность за активное содействие в работе инженерам отдела эксплуатации медицинского оборудования ФГБУ “НМИЦ онкологии” Минздрава России.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.