Оптимизация условий хранения РНК в биобанке, а также методов ручного и автоматизированного выделения РНК из цельной крови и лейкоцитарной фракции

Цель. Оптимизация методики выделения и хранения рибонуклеиновой кислоты (РНК) из цельной крови и лейкоцитарной фракции.

Материалы и методы. Сравнение качества выделения проводилось для образцов РНК, полученных из 228 образцов лейкоцитарной фракции и 198 образцов цельной крови. Выделение было проведено из свежих и замороженных образцов с помощью реагента ExtractRNA™ и автоматизированной станции MagNA Pure Compact. Были опробованы различные способы удаления эритроцитов — с помощью центрифугирования и обработки гемолитиками двух производителей, а также способы заморозки материала для последующего выделения РНК — с консервантами и без них.

Результаты. Была проверена 21 комбинация условий. Наиболее качественная РНК выделялась при ручной экстракции с использованием реагента ExtractRNA™ из свежей, очищенной гемолитиком “Амплисенс” лейкоцитарной фракции (успешность выделения — 94%, медиана RIN=8,4); замороженной в IntactRNA™, очищенной центрифугированием лейкоцитарной фракции (успешность выделения — 100%, медиана RIN =8); замороженной в ExtractRNA™, очищенной центрифугированием лейкоцитарной фракции (успешность выделения — 100%, медиана RIN =9,3).

Заключение. Из замороженных фракций крови возможно выделение РНК, не уступающей по качеству выделенной из свежих образцов. Таким образом, проводить выделение РНК сразу после поступления биологического материала не обязательно.

1. Bayatti N, Cooper-Knock J, Bury JJ, et al. Comparison of blood RNA extraction methods used for gene expression profiling in amyotrophic lateral sclerosis. PLoS One. 2014;9:87508. doi:10.1371/journal.pone.0087508.

2. Knepp JH, Geahr MA, Forman MS, et al. Comparison of automated and manual nucleic acid extraction methods for detection of enterovirus RNA. J Clin Microbiol. 2003;41:3532-6. doi:10.1128/JCM.41.8.3532-3536.2003.

3. Kresse SH, Namlos HM, Lorenz S, et al. Evaluation of commercial DNA and RNA extraction methods for high-throughput sequencing of FFPE samples. PLoS One. 2018;13. doi:10.1371/journal.pone.0197456.

4. Hammerle-Fickinger A, Riedmaier I, Becker C, et al. Validation of extraction methods for total RNA and miRNA from bovine blood prior to quantitative gene expression analyses. Biotechnol Lett. 2010;32:35-44. doi:10.1007/s10529-009-0130-2.

5. Sung JK, Dix DJ, Thompson KE, et al. Effects of storage, RNA extraction, genechip type, and donor sex on gene expression profiling of human whole blood. Clin Chem. 2007;53:1038-45. doi:10.1373/clinchem.2006.078436.

6. Schwochow D, Serieys LEK, Wayne RK, et al. Efficient recovery of whole blood RNA — a comparison of commercial RNA extraction protocols for high-throughput applications in wildlife species. BMC Biotechnol. 2012;12:33. doi:10.1186/1472-6750-12-33.

7. Hantzsch M, Tolios A, Beutner F, et al. Comparison of whole blood RNA preservation tubes and novel generation RNA extraction kits for analysis of mRNA and miRNA profiles. PLoS One. 2014;9:e113298. doi:10.1371/journal.pone.0113298.

8. Elliott P, Peakman TC. The UK Biobank sample handling and storage protocol for the collection, processing and archiving of human blood and urine. Int J Epidemiol. 2008;37:234-44. doi:10.1093/ije/dym276.

9. Huang LH, Lin PH, Tsai KW, et al. The effects of storage temperature and duration of blood samples on DNA and RNA qualities. PLoS One. 2017;12:e0184692. doi: 10.1371/journal.pone.0184692.

10. Shen Y, Li R, Tian F, et al. Impact of RNA integrity and blood sample storage conditions on the gene expression analysis. Onco Targets Ther. 2018;11:3573-81. doi:10.2147/OTT.S158868.

11. Mendy M, Caboux E, Lawlor RT, et al. Common Minimum Technical Standards and Protocols for Biobanks Dedicated to Cancer Research. IARC Technical Publication, No 44. Lyon (FR): International Agency for Research on Cancer; 2017 ISBN: 97892-832-2463-1.

12. Coppola L, Cianflone A, Grimaldi AM, et al. Biobanking in health care: Evolution and future directions. J Transl Med. 2019; 17. doi:10.1186/s12967-019-1922-3.

13. Hentze JL, Kringelbach TM, Novotny GW, et al. Optimized Biobanking Procedures for Preservation of RNA in Tissue: Comparison of Snap-Freezing and RNAlater-Fixation Methods. Biopreserv Biobank. 2019;17:562-9. doi:10.1089/bio.2019.0028.

14. Ozkan H, Kerman E. Comparative Evaluation of RNAlater Solution and Snap Frozen Methods for Gene Expression Studies in Different Tissues. Rev Rom Med Lab. 2020;28:287-97. doi:10.2478/rrlm-2020-0024.

15. Passow CN, Kono TJY, Stahl BA, et al. RNAlater and flash freezing storage methods nonrandomly influence observed gene expression in RNAseq experiments. bioRxiv. 2018:379834. doi:10.1101/379834.

16. Chatterjee A., Ahn A., Rodger E. J., Stockwell P. A., Eccles M. R. (2018) A Guide for Designing and Analyzing RNA-Seq Data. In: Raghavachari N., Garcia-Reyero N. (eds) Gene Expression Analysis. Methods in Molecular Biology, Vol 1783:35-80. Humana Press, New York, NY. doi:10.1007/978-1-4939-7834-2_3.

17. Duale N, Lipkin WI, Briese T, et al. Long-term storage of blood RNA collected in RNA stabilizing Tempus tubes in a large biobank — Evaluation of RNA quality and stability. BMC Res Notes. 2014;7:633. doi:10.1186/1756-0500-7-633.

18. Opitz L, Salinas-Riester G, Grade M, et al. Impact of RNA degradation on gene expression profiling. BMC Med Genomics. 2010;3:36. doi:10.1186/1755-8794-3-36.

19. Gaignaux A, Ashton G, Coppola D, et al. A Biospecimen Proficiency Testing Program for Biobank Accreditation: Four Years of Experience. Biopreserv Biobank. 2016;14:429-39. doi:10.1089/bio.2015.0108.

20. Becker C, Hammerle-Fickinger A, Riedmaier I, et al. mRNA and microRNA quality control for RT-qPCR analysis. Methods. 2010;50:237-43. doi:10.1016/j.ymeth.2010.01.010.

21. Bustin SA. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): Trends and problems. J Mol Endocrinol. 2002;29:23-39. doi:10.1677/jme.0.0290023.

22. Fabre AL, Colotte M, Luis A, et al. An efficient method for longterm room temperature storage of RNA. Eur J Hum Genet. 2014;22:379-85. doi:10.1038/ejhg.2013.145.

23. Hubel A, Spindler R, Skubitz APN. Storage of human biospecimens: Selection of the optimal storage temperature. Biopreserv Biobank. 2014;12:165-75. doi:10.1089/bio.2013.0084.

24. Mazur P. Cryobiology: The freezing of biological systems. Science. 1970;168:939-49. doi: 10.1126/science.168.3934.939.

25. Olivieri EHR, De Andrade Franco L, Pereira RG, et al. Biobanking practice: RNA storage at low concentration affects integrity. Biopreserv Biobank. 2014;12:46-52. doi:10.1089/bio.2013.0056.

26. Shabihkhani M, Lucey GM, Wei B, et al. The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings. Clin Biochem. 2014;47:258-66. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2014.01.002. doi:10.15829/1728-8800-2021-3114 ISSN 1728-8800 (Print) ISSN 2619-0125 (Online)