Характеристика биоресурсной коллекции биообразцов от беременных женщин на разных сроках гестации для поиска ранних биомаркеров осложнений беременности и перспективы ее научного использования

Введение

В настоящее время происходит смена парадигм в подходах и методологиях проведения клинических и научных исследований. Одной из причин таких изменений является появление и развитие нового направления — биобанкирования образцов различного типа биоматериала. Биобанки уже сегодня являются современной платформой, обеспечивающей доступ к высококачественному биоматериалу, стандартизованному на всех этапах получения образцов. Основным преимуществом биобанков является возможность многократного применения биоматериала в различных исследованиях [1]. Особенно это важно при получении уникального биоматериала от сложных когорт исследуемых, к которым, в первую очередь, относятся беременные [2][3].

Для обеспечения современных потребностей проведения фундаментальных и прикладных научных исследований в области акушерства, гинекологии и неонатологии была создана "Коллекция биообразцов от беременных женщин на разных сроках гестации для поиска ранних биомаркеров осложнений беременности", не имеющая аналогов в Российской Федерации. В настоящее время существуют лишь отдельные коллекции биообразцов, собираемые в интересах выполнения конкретных научных работ. Cбор биологического материала происходит по различным протоколам, без единой стандартизации, а также зачастую после проведения исследования хранится в ненадлежащих условиях, что сокращает возможность его использования в других исследованиях.

Созданная биоресурсная коллекция включает в себя образцы венозной крови (цельная кровь, плазма и сыворотка крови), мочи, пуповинной крови (цельная кровь) и биоптатов плацентарной ткани женщин с различной акушерской патологией (преэклампсия, гестационный сахарный диабет (ГСД), задержка развития плода и др.) и с неосложненным течением беременности. Сбор биологического материала проводится в соответствии с разработанными стандартными операционными процедурами, что позволяет значительно повысить его качество и снизить частоту ошибок в исследовании, связанных с преаналитическим этапом. Непосредственно сбор биологических образцов совмещается с плановыми диагностическими мероприятиями (взятие крови на анализ и т.п.), которые проводятся в стационарных условиях и не доставляют больших неудобств беременной женщине. Выполняемые систематизация и проверка качества, а также наличие низкотемпературных холодильных установок с необходимыми режимами хранения обеспечивают длительную сохранность биологического материала и возможность его использования в других исследованиях, в т.ч. сторонними организациями при выполнении совместных проектов. Собранные в динамике различные типы образцов биологического материала (венозная кровь, пуповинная кровь, плацентарная ткань) и наличие данных анамнеза, результатов клинико-лабораторного, инструментального обследований и данных об исходе беременности, позволят обеспечить системный подход к реализации планируемых исследований.

В статье представлен результат 4-летней работы по созданию, пополнению и поддержанию коллекции биообразцов от беременных женщин на разных сроках гестации для поиска ранних биомаркеров осложнений беременности с особым вниманием на представление сопровождающей биообразцы клинико-анамнестической информации. Ранее было опубликовано подробное описание особенностей создания данной коллекции, которое включает в себя этапы подготовки, сбор биоматериала, пробоподготовку, хранение и контроль качества биообразцов [4]. В настоящей работе более подробно представлена клинико-анамнестическая характеристика женщин, образцы которых включены в коллекцию.

Материал и методы

По состоянию на 01.09.2022г коллекция включает 16625 биообразцов различного типа биоматериал от 355 беременных женщин. От одного донора (пациентки) были собраны образцы в I, II и III триместрах и после родоразрешения. В I триместре был собран биоматериал от всех пациенток, во II триместре — от 274, в III — от 182, после родоразрешения — от 82. Исследование одобрено этическим комитетом при ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д. О. Отта" (протокол № 97 от 27.06.2019г). Информированное согласие было подписано всеми женщинами до их включения в исследование и обработки их персональных и медицинских данных. Количество биообразцов представлено в таблице 1.

Первичным биоматериалом в I, II и III триместрах являются венозная периферическая кровь (сбор осуществляется в две вакуумные пробирки с К2-этилендиаминтетрауксусной кислотой и в одну пробирку с активатором свертывания крови) и моча. После родоразрешения дополнительно были собраны биоптаты ткани плаценты и пуповинная кровь. Взятие, обработка биоматериала перед хранением и хранение проводились согласно заранее разработанным стандартным операционным процедурам. После взятия биоматериала первичную обработку проводили в течение 2 ч. Методы и условия пробоподготовки, хранения и контроля качества описаны ранее [4]. Типы биоматериала, количество аликвот, объем и условия пробоподготовки и хранения представлены в таблице 2.

Статистический анализ клинико-анамнестических данных выполнен с использованием Statistica 10.0 (StatSoft, Inc., США). Непрерывные переменные представлены как среднее ± стандартная ошибка.

Результаты и обсуждение

В исследование приняли участие 355 беременных женщин на ранних сроках гестации. Средний срок беременности при вступлении в исследование составил 11±1,4 нед. с разбросом от 9 до 14 нед. беременности. У наибольшего числа пациенток беременность была одноплодная — 91,6% (n=325), многоплодная беременность — у 8,4% (n=30) женщин.

Общие и анамнестические данные. Возраст беременных варьировал от 19 до 47 лет, при этом средний возраст составил 33,2±2,26 лет. Первородящие и повторнородящие беременные были представлены примерно в равном соотношении — 183 (51,6%) и 172 (48,4%), соответственно. У повторно беременных среднее число беременностей в анамнезе составило 2,8±1,27, при этом наименьшее число беременностей в анамнезе было 1, наибольшее — 8. У повторнородящих среднее число родов в анамнезе составило 1,4±1,02, при этом наименьшее число родов в анамнезе было 1, наибольшее — 5. У 19,2% (n=68) женщин, беременность наступила в результате экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). При этом, среднее число неудачных попыток ЭКО в анамнезе у женщин, включенных в исследование, составило 3,6±1,52, с разбросом от 1 до 7 неудачных попыток в анамнезе.

В обследованной когорте женщин частота невынашиваний беременности в анамнезе составила 37,1% (n=132) и была в 2-2,5 раза выше по сравнению с частотой в популяции (15-27%), согласно представленными в литературе данными [5]. Вероятно, такая частота связана с высокой обращаемостью пациенток как со спорадическим, так и привычным невынашиванием за помощью в НИИ АГиР им. Д. О. Отта к специалистам, традиционно практический и научный интерес которых связан с проблемой невынашивания. Среднее число невынашиваний в анамнезе у беременных составило 1,8±0,96, при этом наименьшее число потерянных беременностей в анамнезе — 1, наибольшее — 4. Среднее число медицинских абортов в анамнезе составило 0,3±0,8, все были выполнены на ранних сроках гестации (до 12 нед. беременности). Только у одной беременной медицинский аборт был выполнен при сроке гестации 21/22 нед. в связи с врожденным пороком развития плода (гастрошизис). Среди включенных в исследование пациенток у 7,6% (n=27) в анамнезе были спонтанные преждевременные роды (ПР), при этом наибольшее число ПР, произошедших у одной женщины, составило 3. У данных беременных предыдущие беременности осложнялись тяжелыми патологиями беременности: преэклампсия в анамнезе была у 5,1% (n=18) женщин. Антенатальная гибель плода (гибель плода до родов) в анамнезе была у 2,3% (n=8), а интранатальная гибель (гибель плода в родах) в анамнезе у 0,9% (n=3), основной причиной которых были тяжелые осложнения беременности, такие как преэклампсия, ГСД и преждевременная отслойка плаценты.

Гинекологические заболевания. В исследуемой группе была проанализирована частота хронических пролиферативных заболеваний (наружный генитальный эндометриоз (НГЭ), аденомиоз, миома матки), воспалительных заболеваний органов малого таза (хронический аднексит, хронический эндометрит), хирургических гинекологических вмешательств (диатермоэлектрокоагуляция шейки матки, гистероскопия, выскабливание полости матки) и др. Наиболее часто встречавшейся гинекологической патологией в данной группе была миома матки, которая была выявлена у 59 (16,6%) женщин. Другим часто встречающимся пролиферативным заболеванием был НГЭ в 12,1% (n=43), при этом аденомиоз имел место у 3,1% (n=11) данных женщин. Частота воспалительных заболеваний органов малого таза, представленных хроническим эндометритом и хроническим аднекситом, составила 11,6 (n=41) и 4,2% (n=15), соответственно. Синдром поликистозных яичников был установлен у 3,9% (n=14) беременных, включенных в исследование. Внутриматочная патология в анамнезе была у 3,9% женщин: полип эндометрия 2,3% (n=8), гиперплазия эндометрия 1,7% (n=5). Внутриматочные вмешательства (выскабливание полости матки, гистероскопия, в т.ч. диагностическая) были в анамнезе у 30,9% (n=110) женщин, а оперативное лечение патологии шейки матки — диатермоэлектроэксцизия — у 0,9% (n=3) пациенток.

При анализе частоты экстрагенитальных заболеваний у беременных, с наибольшей частотой встречались патологические процессы щитовидной железы, представленные в 70% случаев гипофункциональными состояниями, — 15,8% (n=56). Следующим наиболее часто встречающимся заболеванием был хронический цистит, который установлен у 14,9% (n=53) женщин. Другие патологические состояния мочевыводящих путей встречались также часто: бессимптомная бактериурия у 5,9% (n=21), хронический пиелонефрит у 7,9% (n=28), мочекаменная болезнь у 1,7% (n=6).

Нарушения углеводного обмена, выявленные до беременности, в исследуемой когорте встречались часто, что также связано с наличием в НИИ АГиР им. Д. О. Отта диабетического Центра и возможностью включения в исследование пациенток с сахарным диабетом 1 и 2 типов, которые в группе составили 9,6 (n=34) и 1,9% (n=7), соответственно.

Сердечно-сосудистые заболевания, выявленные у беременных, в основном были представлены гипертонической болезнью в 6,2% (n=22), варикозной болезнью в 8,7% (n=31). Венозные тромбоэмболические осложнения (тромбоз глубоких вен) в анамнезе были у 1,7% (n=6) женщин, что было связано с включением пациенток с установленным антифосфолипидным синдромом (АФС). При этом АФС был у 7,3% (n=26), наследственная тромбофилия — у 6,2% (n=22) беременных.

Гестационные осложнения. Анализ патологических состояний при беременности и гестационных осложнений показал, что избыточная прибавка веса при беременности (>12 кг при одноплодной, >21 кг при многоплодной беременности) встречалась у 32,9% (n=117). Средняя прибавка веса в исследуемой группе составила 11,4±2,28 кг, при этом были пациентки, которые потеряли в весе за время беременности: наибольшая потеря за всю беременность составила 4 кг, а наибольшая прибавка в весе составила 22 кг. Анемия беременных различной степени тяжести встречалась в 46,2% (n=164). У 37,4% (n=133) женщин течение беременности на ранних сроках осложнилось угрозой прерывания беременности (угрожающим выкидышем до 22 нед. беременности), у 20,9% (n=71) –угрожающими преждевременными родами (>22 нед. беременности). Такие высокие показатели осложненного течения беременности, как на ранних, так и поздних сроках гестации, были, вероятно, связаны с тем, что ~35% пациенток были привлечены в исследование в период госпитализации в отделение патологии беременности НИИ АГиР им. Д. О. Отта по различным показаниям.

У 8,7% (n=31) женщин при беременности по данным ультразвукового исследования (УЗИ) была установлена истмико-цервикальная недостаточность (ИЦН), которая была диагностирована при укорочении длины шейки матки <25 мм. У 6,2% (n=22) беременных коррекция ИЦН потребовала установки акушерского пессария, у 1,7% (n=6) была проведена хирургическая коррекция: на шейку матки был наложен циркулярный шов (циркляж).

Нарушение углеводного обмена при беременности встречалось в 12,8% случаев: ГСД с корректируемыми уровнями гликемии при помощи диетотерапии был выявлен у 10,4% (n=37), ГСД, потребовавший назначение инсулинотерапии, был диагностирован у 2,4% (n=9) беременных. Течение беременности у 8,7% (n=31) осложнилось гипертензивными расстройствами (преэклампсия умеренная и тяжелая), у 0,56% (n=2) женщин, беременность осложнилась тяжелым, жизнеугрожающим состоянием — HELLP-синдромом — HELLP-синдром включает в себя гемолиз (H — hemolysis), повышение активности печеночных ферментов (EL — elevated liver enzymes) и снижение числа тромбоцитов (LP — low playelet count).

В исследуемой группе у 3,4% (n=12) женщин был выявлен холестатический гепатоз беременных. По данным УЗИ при беременности в 10,4% случаев было выявлено аномальное количество околоплодных вод: многоводие у 8,7% (n=31) женщин, маловодие у 1,7% (n=6). Также по данным УЗИ у 3,4% (n=12) была установлена задержка роста плода (отмечается замедление показателей прироста предполагаемой массы плода и/или окружности живота <10-го процентиля в сочетании с патологическим кровотоком по данным УЗ-допплерографии или значения предполагаемой массы плода и/или окружности живота).

При беременности женщины данной когорты перенесли инфекционные процессы: у 16,3% (n=58) женщин была установлена острая респираторная вирусная инфекция, у 15,5% (n=55) подтверждено заболевание новой коронавирусной инфекцией (COVID-19 — COrona VIrus Disease 2019). Низкие показатели заболеваемости COVID-19 в большей степени связаны с началом сбора биоресурсной коллекции в допандемийный период.

Течение родов и осложнения. Данные об исходах беременности получены у 285 женщин. У 4,0% (n=11) женщин беременность прервалась на ранних сроках (до 12 нед. гестации): в 72,7% (n=8) случаях произошел спонтанный выкидыш, в 27,3% (n=3) –неразвивающаяся беременность.

У 2 женщин произошла антенатальная гибель плода при сроке 25 и 26 нед. гестации, основными причинами которой в первом случае послужил декомпенсированнный сахарный диабет 1 типа, во втором — АФС. От участия в исследовании по различным причинам отказались 19 беременных. Структура отказов и анализ причин изложен в статье, где проанализирован менеджмент качества сбора биообразцов и ассоциированных с ними данных [6].

В настоящее время беременность пролонгируется у 49 женщин, роды произошли у 274 женщин. Самостоятельные роды произошли у 68,3% (n=187) беременных. Спонтанные роды начались с преждевременного излития околоплодных вод у 80 (29,2%) беременных. Преждевременные роды (с 22 до 36 нед. 6/7 дней гестации) произошли у 13,5% (n=37) участниц исследования, из которых у 7,7% (n=21) были спонтанными (начались со схваток или преждевременного излития околоплодных род) и 5,8% (n=16) индуцированных (досрочное родоразрешение в связи с медицинскими показаниями со стороны матери или плода). Течение родов осложнилось аномалией родовой деятельности — ее слабостью в 6,2% (n=17) случаев. Быстрые роды произошли у 1,1% (n=3) из всех беременных. В течение родов у 0,73% (n=2) беременных был установлен хорионамнионит (воспаление хориона и амниона с инфицированием околоплодной жидкости). Оперативным путем были родоразрешены 87 (31,7%) беременных. Такой высокий процент операции кесарева сечения в группах был связан с включением беременных с отягощенным акушерским и гинекологическим анамнезом, серьезной патологией до беременности (сахарный диабет 1 типа, АФС), пациенток с многоплодной беременностью. Плановое кесарево сечение было выполнено у 22,2% (n=61), экстренное кесарево сечение у 9,5% (n=26) женщин. Наиболее частыми показаниями для оперативного родоразрешения были: рубец на матке после операции кесарева сечения в анамнезе в 21,8% (n=19) случаев, многоплодная беременность — в 19,5% (n=17), преэклампсия — в 16,1% (n=14), осложнения, связанные с сахарным диабетом — в 12,6% (n=11), экстрагенитальная патология — в 8,1% (n=7), отсутствие биологической готовности к родам — в 6,9% (n=6), внутриутробная гипоксия плода — в 3,5% (n=3), отслойка нормально расположенной плаценты в — 2,3% (n=2), отягощенный акушерский анамнез (антенатальная гибель плода в анамнезе) — в 2,3% (n=2), другие — в 6,9% случаев (n=6).

Состояние новорожденных. От 274 беременностей родилось 296 детей: 21 были многоплодные роды, из них одни роды трихориальной триамниотической тройней. Масса детей при рождении варьировала от 1120 до 4760 г и, в среднем, составила 3344,3±560,3 г. Средний балл по шкале Апгар на 1 мин (Апгар 1) составил 7,6±0,86 баллов, при этом наиболее низкая оценка составила 4 балла, наибольшая 9 баллов. На 5 мин (Апгар 2) средний балл составил 8,3±0,90, наименьший — 5 баллов, наибольший — 10 баллов. Асфиксия новорожденных была установлена в 2,7% (n=8) случаев, при этом 1% (n=3) случаев пришлись на асфиксию легкой степени и 1,7% (n=5) на асфиксию средней степени. Тяжелой асфиксии среди новорожденных установлено не было. Синдром дыхательных расстройств, потребовавший интубации и искусственной вентиляции легких новорожденных, во всех случаях был связан с нарушениями адаптационных механизмов в связи с недоношенностью детей. Основные клинические данные, ассоциированные с образцами представлены в таблице 3.

Заключение

Описанная в настоящей статье коллекция включена в 2022г в состав уникальной научной установки УНУ "Репродуктивное здоровье человека" (регистрационный номер УНУ_3076082) биобанка "Генофонд" ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д. О. Отта". Создание коллекции направлено на разработку комплексного инновационного подхода к анализу влияния экогенетических факторов на популяционную заболеваемость социально-значимых форм акушерских патологий с учетом этнической принадлежности, возраста, пола, условий проживания, питания и полиморфизма генов человека. Особо перспективной представляется возможность поиска на платформе биоколлекции наиболее ранних биомаркеров осложнений гестации, т.к. образцы у беременных были получены проспективно на ранних сроках беременности, до возникновения акушерских осложнений и далее при развитии их клинических проявлений. Коллекция может служить источником валидационных выборок беременных женщин в течение всего срока гестации. На базе коллекции выполнена работа по определению профиля микроРНК (микро-рибонуклеиновая кислота) и пиРНК (PIWI-рибонуклеиновая кислота, обнаруживаемая в комплексах с белками семейства Piwi) во время беременности с течением срока гестации в сыворотке и плазме крови при физиологической беременности, были определены особенности профиля микроРНК и пиРНК в плазме и сыворотке крови, отличие в профиле микроРНК и пиРНК в I, II и III триместрах [7][8]. Также выполнена работа по определению эффективности CRD-теста (окрашивание Конго красным, Congo Red Dot) при преэклампсии в моче. На основании полученных данных выявили, что CRD-тест позволяет диагностировать патологическое состояние преэклампсия на 1920 нед. беременности.

На сегодняшний день ведутся исследования профиля микроРНК при преэклампсии, ГСД и преждевременных родов у беременных на ранних и средних сроках гестации. Помимо транскриптомных, выполняются протеомные исследования по определению уровня амилоидных белков в моче у пациенток с преэклампсией и при здоровой беременности. Развитие и исследование коллекции образцов позволит изучить физиологические особенности течения беременности, патогенетические механизмы развития гестационнных осложнений, разработать методы профилактики, диагностики и лечения акушерских осложнений, имеющих не только медицинское, но и социальное значение.

Отношения и деятельность. Исследование поддержано грантом РНФ № 19-75-20033. Часть работ выполнена на базе РЦ "Центр Биобанк" Научного парка СПбГУ.