Влияние длительного хранения образцов сывороток крови в условиях биобанка для проведения популяционных сероэпидемиологических исследований

Введение

Основным методом проведения эпидемиологических исследований в отношении актуальных инфекционных болезней является изучение популяционного иммунитета к соответствующим возбудителям. Своевременная оценка риска развития вспышек и эпидемий среди населения, основанная на использовании указанного метода, позволяет "выиграть время" для планирования и проведения профилактических мероприятий [1][2]. Значимость популяционных исследований различных аспектов инфекционной патологии стала основанием для формирования паспортизированной коллекции образцов сывороток крови. Использование материалов банка сывороток крови позволяет проводить широкомасштабные научные исследования, которые в значительной мере расширяют представления об особенностях эпидемиологических процессов многих инфекций [3]. С каждым годом в мире увеличивается число биобанков, растет спектр и перечень направлений исследовательской работы с их привлечением [4-6]. Тем не менее, многие вопросы касающиеся, в т.ч. организации и стандартизации процессов в биобанке, требуют изучения и уточнения [7][8]. В связи с этим следует отметить, что период хранения биообразцов в банке может исчисляться как днями и неделями, так и десятилетиями, что ставит вопрос о достоверности и воспроизводимости результатов популяционных исследований, проведенных с использованием долго хранимых биообразцов.

Значительное количество современных научных работ посвящены вопросам оценки стабильности биохимических аналитов (ионный состав, гормоны, холестерин и т.д.), а также разнообразных белковых фракций в образцах сыворотки крови [9-12]. Изучение сохранности антител IgG при проведении исследования популяционного иммунитета в отношении инфекций представлено фрагментарно, несмотря на актуальность такого рода работ [13][14].

Стабильность — это способность биологического материала сохранять первоначальные свойства определенного маркера в течение некоторого периода времени в некоторых пределах при хранении в заданных условиях. Для количественного определения стабильности используют в т.ч. вычисление доли проб, в которых после хранения уровень исследуемого маркера был изменен. Критическое значение указанной доли образцов в разных исследованиях варьирует в небольших пределах и, в среднем, составляет 15% [11]. Стабильность проб биологического материала на преаналитическом этапе зависит от температуры окружающей среды, механических воздействий (например, встряхивание проб при транспортировке) и, главное, времени.

Образцы сыворотки и плазмы крови стандартно хранят при температуре -70° C и ниже, т.к. большинство биохимических и иммунологических показателей не отличаются высокой степенью стабильности при хранении на -20 — -30° C (допустимо в течение 3 нед.). Экспериментально показано, что биообразцы могут храниться в течение 24 ч до биохимического исследования, при увеличении этого времени до 36 ч отмечаются процессы деградации аналитов [12][15].

Наиболее оптимальным для обеспечения сохранности биообразцов является использование высокопроизводительных автоматизированных систем хранения биологического материала, однако возможно также использование морозильных камер с температурой хранения от -70 до -80° C [5][6][9]. Для обеспечения стабильности всех маркеров важным является быстрое замораживание образцов сыворотки и плазмы, т.к. при затягивании этого процесса образуются кристаллы льда, которые разрывают молекулы, особенно белковые. Поэтому сразу после центрифугирования аликвотированные образцы необходимо замораживать при температуре ≤-70° C. При этом размораживание их следует производить медленно, при +4° C (на льду) [3].

Маркеры, представленные белковыми фракциями, являются наиболее стабильными при хранении. По результатам исследования интерлейкинов различных классов установлено, что при продолжительности хранения 2 нед. их уровень изменяется по-разному в зависимости от температурных условий. Так, при температуре 2-8° C средний их уровень в образцах сыворотки крови снижался (-15%), а при более глубоком замораживании до -80° C увеличивался (+17%) [10]. При этом температура хранения -20° C в течение того же периода времени не влияла на уровень исследуемого маркера.

Среди всех классов иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgE, IgG) IgG является наиболее стабильным. По некоторым данным уровень IgG в образцах сыворотки крови не изменяется в течение 8 мес. при температуре -20° C, в то время как для IgM и IgE этот период сокращается до полугода¹. Экспериментальные исследования сохранности IgG при долгосрочном хранении при низких температурах (≤-70° C) требуют значительных временных затрат, и представлены в научной литературе фрагментарно, в то время как актуальность таких работ на сегодняшний день очевидна.

Цель исследования — оценить сохранность антител класса IgG при долгосрочном хранении образцов сыворотки крови на примере специфических к вирусам кори и краснухи антител.

Материал и методы

В исследовании использованы образцы сыворотки крови (n=180) от случайно выбранных условно здоровых лиц, проживающих в Москве, из коллекции отдела эпидемиологии ФГБУ "НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи" Минздрава России (Москва). Все образцы коллекции, использованные для проведения работы, собраны, первично исследованы и заморожены в один день. Формирование указанной коллекции биообразцов одобрено Комитетом по биомедицинской этике ФГБУ "НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи" Минздрава России (Протокол № 2 от 04.02.2016г).

Взятие крови осуществляли из локтевой вены с помощью системы однократного применения BD Vacutainer Safety-Lok (Becton Dickinson and Company, США) в количестве 4-5 мл в лечебно-профилактическом учреждении по соглашению о научном сотрудничестве. Для сбора и хранения образцов крови применяли пробирки с активатором свертывания. После доставки в лабораторию для отделения сыворотки образцы цельной крови центрифугировали (10 тыс. об./мин в течение 15 мин при температуре 18-25° C), затем аликвотировали и маркировали с помощью штрихкодов. Хранение полученных аликвот при низких температурах (-70° C) осуществляли в криопробирках (производство Axygen Scientific, США) с завинчивающимися крышками, исключающими самопроизвольное вскрытие.

Образцы сывороток крови были исследованы 3-кратно: сразу после поступления в лабораторию, по завершении 20 мес. хранения при температуре -70° C, после 6 лет хранения при температуре -70° C. Для предотвращения повторных циклов замораживания/оттаивания для исследования использовали разные аликвоты. Однократное размораживание биообразцов проводили постепенно по ступенчатой схеме, включающей последовательное выдерживание в температурных интервалах: 1) -20 — -22° C (сут.); 2) +4° — +6° C (сут.); 3) +19° — +21° C (2 ч).

Изучение напряженности иммунитета к вирусам кори и краснухи в каждом образце сыворотки крови осуществляли методом твердофазного непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием отечественных тест-систем производства ЗАО "ВекторБест" ("Векто-корь IgG", "Векто-рубелла IgG") однократно без повторов. Все исследования выполнены в соответствии с инструкциями фирмы-изготовителя: серопозитивными считались образцы, в сыворотке крови которых определялись специфические IgG-антитела к вирусу кори на уровне ≥0,18 МЕ/мл (cut off), к вирусу краснухи ≥10 МЕ/мл (cut off). В случаях определения значения меньше указанных уровней, образец считался отрицательным, и обследованный пациент учитывался как серонегативный.

Согласно протоколу, исследование включало две серии опытов.

Опыт 1: изучение влияния условий хранения образцов сывороток крови (n=90, №№ 1-90) при температуре -70° C в течение 20 мес. Для этого были исследованы, проанализированы и сопоставлены уровни специфических IgG к вирусам кори и краснухи в нативных образцах (сразу при поступлении в лабораторию) и по прошествии указанного периода хранения (повторно).

Опыт 2: изучение влияния условий хранения образцов сывороток крови (n=90, №№ 91-180) при температуре -70° C в течение 6 лет. Для этого были исследованы, проанализированы и сопоставлены уровни специфических IgG к вирусу кори в нативных образцах (сразу при поступлении в лабораторию) и по прошествии указанного периода хранения (повторно).

Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью программ Microsoft Excel и STATISTICA 12.0. Уровни значимости альфа и бета установлены равными 5% (т.е. значение р<0,05, рассматривается как значимое, а анализ имел 95%-ю мощность). Для статистического анализа полученных значений уровня специфических IgG на каждом этапе исследования было оценено распределение исследуемых величин (критерий Шапиро-Уилка), использованы соответствующие методы описательной статистики — рассчитаны следующие показатели: медиана (Me) и интерквартильный размах (Q25-Q75). Для проверки достоверности различий между группами обследованных использовался критерий Вилкоксона (Т). Критическое значение (T_крит) для него согласно табличным данным при n=90 удовлетворяло неравенству T_крит>466. Для оценки корреляционной связи использовался коэффициент корреляции Спирмена (ρ).

Результаты

При использовании критерия Шапиро-Уилка установлено, что распределение серопозитивных образцов с разным уровнем антител к вирусу кори и краснухи не соответствовало "нормальному" закону (распределению Гаусса) при р<0,001 (рисунки 1, 2). В связи с этим результаты исследования в дальнейшем были охарактеризованы непараметрическими методами описательной статистики.

Согласно результатам опыта 1 установлено, что продолжительность хранения 20 мес. при температуре -70° C оказала приемлемое влияние на уровень антител к вирусам кори и краснухи. Доля проб, в которых после хранения уровень исследуемого маркера был изменен, не превышала 15%. При повторном исследовании средний уровень антител в отношении вируса кори снизился на 13,1%: от 0,36 (0,08-1,21) до 0,31 (0,02-1,2) МЕ/мл) и на 11,8%: от 169,5 (45-235) до 160,5 (72-198) МЕ/мл) в отношении вируса краснухи (рисунки 3, 4). Указанные различия оказались статистически значимы: так, критерий Вилкоксона для кори составил Т=26 (р<0,05), для краснухи Т=31 (р<0,05), что удовлетворяло неравенству Т<T_крит.

Стоит отметить, что некоторые образцы сыворотки крови были серонегативными (доля их составила 36,7% к вирусу кори и 10% к вирусу краснухи) при первичном исследовании (уровень IgG в них был <0,18 МЕ/мл и 10 МЕ/мл, соответственно). Кроме того, в 20% случаев уровень IgG оказался достаточно небольшим и находился в пределах от 0,18 до 0,5 МЕ/мл (корь) и от 10 до 200 МЕ/мл (краснуха). С учетом данных о снижении среднего уровня антител после хранения ожидаемым было увеличение численности образцов с уровнем IgG ниже порового при повторном исследовании, что, в конечном итоге, не нашло подтверждения полученными результатами. Так, количество серонегативных образцов к возбудителям обеих инфекций не изменилось по прошествии 20 мес. хранения, т.е. не произошло снижения уровня специфических антител до неопределяемого в образцах, имевших значения, близкие к пограничному — cut off =0,18 МЕ/мл (корь) и cut off =10 МЕ/мл (краснуха).

Установлено, что чем выше был уровень IgG в нативном образце сывороток крови, тем более выраженным было его снижение при повторном исследовании (рисунок 5).

Видно, что в отношении кори исследуемые показатели в пределах 1 МЕ/мл практически совпадали при первичном и повторном исследовании, тогда как при значениях >2 МЕ/мл разница была более выраженной и достигла максимума в образцах с высоким (>4 МЕ/мл) уровнем IgG. Аналогичные данные были получены и в отношении краснухи. Значения уровня специфических антител >250 МЕ/мл выявлены только в нативных образцах.

Согласно результатам опыта 2 установлено, что продолжительность хранения в течение 6 лет при температуре -70° C существенно не повлияла на сохранность IgG к вирусу кори. Так, при повторном исследовании средний уровень антител в отношении возбудителя этой инфекции снизился на 33,8%: от 0,72 (0,4-1,79) до 0,0,34 (0,181,14) МЕ/мл). Критерий Вилкоксона в опыте 2 для кори составил Т=276 (р<0,05), что также как в опыте 1, удовлетворяло неравенству Т<T_крит. (рисунок 6).

Доля серонегативных в нативных образцах была меньше, чем по результатам опыта 1 и составила 21,1%, тогда как доля образцов с невысоким уровнем антител в пределах 0,18-0,5 МЕ/мл была больше — 37,8%. Установлено, что за 6-летний период хранения образцов только два из них, имевшие первоначальные уровни антител 0,3 и 0,4 МЕ/мл, стали серонегативными при повторном исследовании.

Выявленная в опыте 1 тенденция прослеживалась и в опыте 2 — чем выше был уровень IgG в нативных образцах сывороток крови, тем более выраженным было его снижение при повторном исследовании. Для наглядности такой зависимости на рисунке 7 мы упорядочили указанные значения в выборке от меньшего к большему, и представили их попарно (первичное и повторное исследование). Корреляционный анализ выявил сильную положительную связь между уровнем антител при первичном исследовании и разницей (Δ) между первичным и повторным результатом для каждого образца сыворотки крови (ρ=0,83 при р>0,00001).

Обсуждение

Полученные в настоящей работе данные согласуются с результатами других исследователей. Так, показано, что при хранении биообразцов в течение 6 лет при температуре -70° C уровни показателей липидного профиля, инсулина и тиреотропного гормона снизились незначительно, что свидетельствовало о правомочности длительного хранения биообразцов с перспективой проведения дальнейших лабораторных исследований [9]. Аналогичные результаты были получены для других биохимических показателей [12][15], а также для разных классов цитокинов [10].

Особенностью серологических исследований является то, что распределение значений уровня антител IgG имеет смещение, и не подчиняется нормальному закону, что согласуется с данными научной литературы [16][17]. В связи с этим небольшие значения вблизи cut off наиболее многочисленны в выборке значений уровня указанного маркера, что часто приводит к трудностям в их интерпретации и делении на серопозитивные и серонегативные образцы. Более того, проблема усугубляется при долгосрочном хранении, когда средний уровень IgG смещается еще больше в сторону небольших значений, что может отразиться на достоверности результатов будущих исследований. Однако обнаруженный нами эффект большей "точности" измерения именно низких значений по сравнению с высокими значениями уровня антител к вирусам кори и краснухи при повторном исследовании с отсутствием перехода через границу cut off в исследуемых образцах (из области серопозитивных значений в область серонегативных), может нивелировать снижение среднего в выборке. Такой результат, на наш взгляд, является крайне важным для исследований популяционного иммунитета к возбудителям инфекционных заболеваний, в частности кори и краснухи, т.к. основным критерием защищенности населения в отношении соответствующих возбудителей является именно долевое распределение серонегативных и серопозитивных лиц. При этом распределение лиц с разным уровнем антител среди серопозитивных играет меньшую роль.

Причины обнаруженного эффекта могут быть различными и, возможно, являются следствием молекулярных и биохимических характеристик иммуноглобулинов IgG. Однако, на наш взгляд, наиболее очевидным объяснением могут быть особенности методики постановки ИФА. Согласно инструкции по применению набора реагентов "Векто-корь IgG" и "Векто-рубелла IgG", определение уровня антител в сыворотке крови происходит после построения калибровочного графика (метод кусочно-линейной аппроксимации) в соответствии со значениями оптической плотности в калибровочных образцах и соотнесения с ними фактически полученных значений оптической плотности в пробах. Однако при построении такого графика используют калибровочные образцы с увеличивающимся "шагом" друг относительно друга, а именно: 0,15; 0,5; 1; 2; 5 МЕ/мл (корь) и 10, 50, 100, 200, 800 МЕ/мл (краснуха). Таким образом, понятно, что точность измерения при высоких значениях ниже, чем при низких. Это связано с необходимостью в практической медицине выявления, прежде всего лиц иммунных и неиммунных к возбудителю, для чего реализована возможность постановки качественного варианта ИФА с тем же набором реагентов.

Ожидаемым результатом является большее влияние периода хранения в 6 лет на сохранность IgG к вирусу кори в сыворотке крови по сравнению с 20-месячным сроком. Однако и оно, с нашей точки зрения, не является критичным для качества последующих исследований популяционного иммунитета. Несмотря на то, что среднее значение уровня антител уменьшилось на 33,8%, только 2 образца из 90 стали серонегативными (т.е. 2% из исследуемой выборки). Здесь следует учитывать, что чувствительность набора реагентов в отношении вируса кори составляет 0,07 МЕ/мл (инструкция по применению набора реагентов). Так, диапазон значений для контрольного образца составляет 1,1-1,8 МЕ/мл, что в процентном выражении соответствует колебанию в 38,9%. Таким образом, полученные результаты опыта 2, свидетельствуют об отсутствии критического влияния 6-летнего периода хранения на достоверность будущих популяционных исследований. В качестве ограничения следует отметить, что в проведенной нами работе некоторые особенности преаналитического этапа, такие как продолжительность транспортировки от места взятия крови до лаборатории, условия хранения биоматериала и прочие, не были учтены. Это теоретически могло отразиться на полученных результатах [18]. Например, в отношении некоторых цитокинов было показано, что указанные факторы влияют на результаты исследования [10]. Кроме того, хранение образцов в лаборатории в нашем случае предполагало использование низкотемпературных морозильных камер, что сопровождалось необходимостью применения ручного труда и, в свою очередь, могло отразиться на результатах. Указанные объективные ограничения были учтены при формировании протокола исследования: так, максимально возможно сокращена длительность всех манипуляций с образцами сыворотки крови. Суммарно закладка на хранение образцов проведена не позднее 12 ч с момента взятия цельной крови, а хранение их при повторном исследовании в условиях комнатной температуры (+19 — +21° C) не превышало 2 ч, тогда как по результатам исследования интерлейкинов, менее стойких по сравнению с иммуноглобулинами, допускается их хранение до 24 ч [18-20].

Заключение

В соответствии с полученными результатами исследования можно сделать общий вывод, что хранение образцов сывороток крови при низких температурах позволяет обеспечить сохранность IgG к вирусам кори и краснухи на достаточно продолжительный срок для будущих исследований. Очевидно, что по возможности необходимо минимизировать период хранения и в идеале проводить лабораторный анализ в день взятия биопробы. Однако в современных условиях стремительного развития отрасли биобанкирования и трансляционной медицины в целом, хранение образцов для будущих исследований является неизбежным, и диктует необходимость оптимизации используемых технологий и процедур в биобанках. Ввиду того, что Ig являются одним из самых стойких маркеров, используемых при проведении исследований, а метод ИФА — одним из самых надежных, популяционные исследования на их основе имеют широкую перспективу использования материалов биобанков.

Шестилетний период хранения биообразцов при температуре -70° C оказал некоторое влияние на уровень антител к вирусу кори, что выразилось в снижении медианы на 33%. Для определения принципиальной значимости таких изменений необходимо проведение дополнительных исследований и определения четких количественных критериев оценки, которые в настоящее время отсутствуют. Тем не менее, учитывая особенности методики постановки ИФА, а также то, что указанные образцы используются для проведения популяционных серологических исследований, по мнению авторов, такое изменение не является критичным. Очевидно, что актуальным является продолжение изучения влияния условий хранения, в т.ч. температуры и продолжительности, для определения момента наступления необратимых изменений биообразцов, делающих их непригодными для повторных исследований.

Отношения и деятельность. Работа выполнена при поддержке Государственного задания Минобрнауки РФ № FZWN-2020-0017.