Изменение протеома конденсата выдыхаемого воздуха под влиянием ингаляционного водорода у пациентов с постковидным синдромом

Введение

Пандемия острого вирусного заболевания, вызванная распространением коронавируса SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome CoronaVirus 2), впервые зафиксирована в декабре 2019г в городе Ухань, КНР. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения на 4 декабря 2022г, во всем мире зарегистрировано >641 млн подтвержденных случаев заболевания и 6,6 млн смертей¹.

Особое внимание в процессе пандемии было уделено постковидному синдрому (ПКС). Согласно Ballering AV, et al., из 8 пациентов, перенесших новую коронавирусную инфекцию (COVID-19, COronaVIrus Disease 2019), у одного формировался ПКС [1]. В настоящее время выделяют две формы ПКС: ранний ПКС, который продолжается от 4 до 6 нед. от начала заболевания и может иметь затяжной характер; если ПКС продолжается >3 мес., а в отдельных случаях до года, то эту форму обозначили как Long COVID-19. Клинические проявления ПКС зависят от сопутствующих заболеваний пациентов, состояния их иммунной системы, эффективности медикаментозной терапии, назначенной в острый период заболевания. У 20% перенесших COVID-19 симптомы ПКС персистируют до 12 нед., а в 2,3% случаев — до 12 мес. [2]. Многие из этого контингента пациентов, перенесших ПКС, нуждаются в специализированном лечении, регулярном наблюдении и в повторной госпитализации.

В течение пандемии было апробировано несколько вариантов клинических рекомендаций. В их основе лежало применение противовирусных препаратов, моноклональных антител. В более тяжелых случаях проводились реанимационные мероприятия, включая неинвазивную вентиляцию и искусственную вентиляцию легких. Необходимо отметить высокую эффективность вакцинации как метода первичной профилактики.

Была выполнена серия работ по применению ингаляционной терапии активной формой водорода (АФВ) у пациентов с ПКС [3].

Возрастающий интерес к АФВ основан на его антиоксидантных свойствах и способности влиять на окислительно-восстановительные процессы. Вирусные инфекции, индуцирующие воспалительные реакции, иммунный ответ, приводят к образованию активных форм кислорода [4].

АФВ, являясь восстановителем, обладает эффективным антиоксидантным действием, нейтрализует провоспалительные медиаторы и, таким образом, способствует снижению миграции клеток воспаления в легочную ткань, тем самым сводя к минимуму степень повреждения легких [5]. Кроме того, терапия АФВ оказалась существенно эффективнее стандартно применяемой кислородной поддержки при обострениях хронической обструктивной болезни легких. Этот эффект достигается за счет снижения сопротивления потоку газов в дыхательных путях [6].

Объектом исследования в настоящей работе является конденсат выдыхаемого воздуха (КВВ). Это научное направление метаболомики получило название бризомика.

КВВ является объектом исследования маркеров воспаления у пациентов с симптомами острой дыхательной недостаточности, перенесших COVID-19, а также служит для оценки эффективности проводимой терапии [7].

Протеомный анализ КВВ позволяет выявлять диагностические и прогностические белковые маркеры [8], а также способствует получению новых знаний о патофизиологических процессах в легких [9], в частности при COVID-19 и ПКС.

Цель настоящего исследования — изучение влияния ингаляционного водорода АФВ на протеом КВВ у пациентов с ПКС.

Материал и методы

Характеристика пациентов. В рандомизированное контролируемое параллельное проспективное исследование были включены 60 пациентов, перенесших COVID-19 с ПКС в период выздоровления, имеющих клинические проявления синдрома хронической усталости (СХУ) и получавших стандартную терапию по протоколу ведения пациентов с СХУ. Пациенты были разделены на 2 группы: 1 группа (основная) — 30 человек, которые получали стандартную терапию и ингаляции АФВ (аппарат "SUISONIA", Япония) на протяжении 10 сут. и 2 группа (контрольная) — 30 медицинских работников, которые получали только стандартную терапию. Краткие данные пациентов представлены в таблице 1. Дизайн исследования и подробная характеристика больных, включенных в программу, описаны ранее [3].

Ингаляционная терапия АФВ. Ингаляционная терапия АФВ проводилась через носовую канюлю (Intersurgical Ltd, Великобритания), соединенную с аппаратом "SUISONIA" Япония). Все пациенты подвергались процедуре ежедневно на протяжении 10 сут. в течение 90 мин согласно инструкции применения оборудования и опыта работы японских коллег.

Сбор и пробоподготовка КВВ. Образцы КВВ собирали в течение 10 мин с помощью специального стандартизованного аппарата Rtube ("Respiratory Research, Inc.", США) в соответствии с разработанными нами ранее протоколами и рекомендациями [10]. Аликвоты КВВ (объём ~1 мл) переносили в полипропиленовые пробирки, устойчивые к низким температурам со слабо-адсорбирующей поверхностью. Собирающую емкость дополнительно промывали органическим растворителем; полученный смыв объединяли с КВВ и лиофилизировали до полного высыхания. Высушенные образцы подвергали гидролизу — расщеплению белков с помощью трипсина (Promega, USA); пробы хранили при -80⁰ C до проведения протеомного анализа.

Высокоэффективная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС). Образцы триптических пептидов анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) на основе системы нано-ВЭЖХ Dionex Ultimate3000 (Thermo Fisher Scientific, США) и времяпролетного масс-спектрометра высокого разрешения с ионной подвижностью timsTOF Pro (Bruker Daltonics, США). Хроматографическое разделение проводили на C18 капиллярной колонке-эмиттере (25 см×75 мкм, 1,6 мкм, Ion Optics, Parkville, Австралия) при скорости потока 400 нл/мин путем градиентного элюирования от 4 до 90% фазы B в течение 40 мин. Подвижная фаза А состояла из 0,1% муравьиной кислоты в воде, а подвижная фаза В состояла из 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле.

Масс-спектрометрический анализ проводили с использованием метода сбора данных, зависящего от данных (DDA — data dependent acquisition), с параллельным накоплением и последовательной фрагментацией (PASEF). Источник ионизации электрораспылением (ESI) работал при напряжении 1500 В, смещении торцевой пластины 500 В и скорости потока газа-осушителя 3,0 л/мин при температуре 180⁰ C. Измерения проводили в диапазоне m/z от 100 до 1700 Th. Подвижность ионов находилась в пределах от 0,60 до 1,60 В с/см². Общее время цикла составило 1,88 с, а количество сканирований PASEF MS/MS было установлено равным 10.

Статистический анализ. Списки точных масс пептидов и масс их фрагментов были использованы для поиска и идентификации белков по базе данных при помощи программы Peaks Studio (Bioinformatics Solutions Inc., США, version 8.5). Для идентификации использовали следующие параметры поиска: фермент — трипсин; точность измерения масс родительского иона — 10/25 ppm; точность масс фрагментов — 0.5/0.05 Da; возможные модификации — окисление метионина (Oxidation (M): 15.99), деамидирование остатков глутамина и аспарагина (Deamidation (NQ): 0.98), а также модификации цистеинов во время пробоподготовки с помощью IAC или NEM (Carbamidomethylation: 57.02, N-ethylmaleimide on cysteines: 125.05). Также проводили анализ с использованием режима поиска с допустимым отклонением. Для обеспечения достоверности пороговое значение ложноположительных идентификаций устанавливалось на уровне 0,1% для спектров, пептидов и белков. После идентификации пептидов и белков проводили количественный анализ их относительного содержания в группах образцов методом LFQ.

Для построения диаграммы Венна был использован ресурс http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/, анализ молекулярных функций белков проводили, используя ресурс http://pantherdb.org/ [11].

Результаты

Всего было исследовано 108 проб КВВ: 60 образцов на момент начала исследования и 48 образцов — в конечной точке (12 пациентов выбыло по личным мотивам). Объем пробы собранного конденсата выдыхаемого воздуха составлял 900±400 мкл.

С помощью масс-спектрометрии высокого разрешения было суммарно идентифицировано 478 белков и 1350 пептидов. Число белков в пробах после терапии АФВ, в среднем, на 12% больше, чем до нее (398 и 349, соответственно). Для более полного анализа были отобраны только белки, которые воспроизводились у >10% пациентов каждой из групп, их суммарное число составило 227. Анализ распределения белков по различным группам пациентов (рисунок 1) показывает, что лишь половина (112) этих белков являются общими для всех групп образцов и выявляются в КВВ до, после и в независимости от водородной терапии. Доминирующая часть этих белков имеет связывающие и каталитические функции, а также структурную молекулярную активность (таблица 2) и, в частности, представлена актинами, миозинами и коллагенами, которые участвуют в воспалении, опосредованном хемокиновыми и цитокиновыми путями, Rho гуанозинтрифосфатазной регуляции цитоскелета, интегриновом сигналинге и сигналинге никотинового ацетилхолинового рецептора, а также участвующими в гликолизе α-енолазой, триозофосфатизомеразой, пируваткиназой и глицеральдегид-3-фосфатизомеразой.

Среди остальных особенно следует отметить белки, которые есть только в исходной группе и перестают выявляться в КВВ после стандартной и ингаляции АФВ (39), а также белки, которые появляются в образцах двух групп на 10-е сут.: 25 из них появляются в обеих группах, 14 — только в контрольной группе, 20 — только в основной группе (рисунок 2).

Кроме качественной разницы в белковых составах КВВ у различных групп, были выявлены и количественные изменения.

В некоторых исходных пробах обеих групп можно наблюдать значительное увеличение интенсивности белков, коррелирующих с анамнезом пациентов — уровень белка повышен у курильщиков (проба 331) и пациентов с респираторными патологиями (проба 551 — астма), а также у перенесших COVID-19 в тяжелой степени (проба 151 — длительное течение заболевания).

Тем не менее, количественные изменения 36 белков в совокупности позволили достоверно различить подгруппы до и после прохождения терапии. Результаты, представленные на рисунке 2, отражают более существенное влияние АФВ на количественные изменения ряда белков (рисунок 3 А), чем это имеет место в контрольной группе (рисунок 3 Б). Важно отметить, что среди этих белков есть участники процессов свертывания крови (α-1-антитрипсин), опосредованного хемокинами и цитокинами воспаления, и ряда сигнальных путей (цитоплазматический актин 2), ответа на окислительный стресс (тиоредоксин), гликолиза (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) и пр. Очевидно, переключения этих процессов играют важную роль на этапе восстановления функций легких при ПКС.

На гистограмме представлена доля пациентов в каждой группе, у которых к концу исследования наблюдалось повышение уровня белков КВВ; при этом в группе, получающей водородную терапию, таких пациентов было больше (рисунок 3).

В таблице 3 значимо меняющиеся белки распределены по функциональным группам. Самые большие группы — это структурные и защитные белки. Их концентрация значительно увеличилась в основной группе.

Важно отметить увеличение частоты встречаемости и концентрации в основной группе белка тиоредоксина, выполняющего роль защиты клеток от окислительного стресса путем детоксикации перекисей, а также белка аннексина А2.

Обсуждение

В последние десятилетия в комплексном лечении больных с респираторными патологиями хорошо себя зарекомендовала терапия медицинскими газами [12-14], в частности водородная терапия — ингаляция смесью кислорода и водорода. Имеются сообщения о влиянии АФВ на активность противовоспалительных медиаторов, сложилось предварительное впечатление о спаринг-эффекте водорода и при ингаляции кислородом [6].

Уже в самом начале пандемии были получены данные о преимущественном распространении SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome CoronaVirus 2) респираторным путем, в виде аэрозолей, т.е. ингаляционный путь распространения превалировал над желудочно-кишечным, кожным и т.д.². К числу этих аэрозолей, в частности, относится КВВ. В связи с этим многие исследования были посвящены изучению возможности детектирования вирусных частиц в КВВ, особенно ввиду высокого процента ложноотрицательных результатов анализа ротоглоточной среды у клинически положительных пациентов с COVID-19 [15-17].

Выдыхаемый воздух содержит и другие маркеры COVID-19, подходящие для его диагностики: например, в предоперационный период часто проводят детекцию летучих органических соединений с помощью электронного носа [18].

Анализ полученных результатов по белковому составу КВВ показал, что АФВ способствует увеличению доли белков с каталитической, молекулярно-адапторной и транспортной активностями и снижению доли связывающих белков. В то же время, при проведении только стандартной терапии в контрольной группе, наоборот, увеличивается доля связывающих белков и, кроме того, увеличивается аденозинтрифосфат (АТФ)-зависимая активность. Анализ биологических путей подчеркивает существенную разницу в меняющихся физиологических процессах у пациентов двух групп: в контрольной группе сохраняется существенная роль процессов свертывания (фактор свертывания XIII), интегринового и апоптотического сигналинга (филамин-В и родственный белок теплового шока 71 кДа), проявляется пуриновый биосинтез de novo (митохондриальная гуанозинтрифосфат:аденозинмонофосфат фосфотрансфераза АК3); тогда как при ингаляции АФВ важную роль играет сигналинг, опосредованный рецепторами гастрина и холицистокинина (кластерин), активизируются цикл трикарбоновых кислот и синтез АТФ (митохондриальные фумаратгидролаза и АТФ-синтаза), метаболизм пурина и проявляются пути спасения аденина и гипоксантина, ксантина и хинина (пурин-нуклеозидфосфорилаза). Таким образом, качественный анализ показывает существенное влияние терапии АФВ на протеом КВВ и отражает характерные изменения физиологических путей с существенным снижением доли провоспалительных процессов, которое происходит в большей степени, чем в контрольной группе, где применяли стандартную терапию.

Представляется немаловажным присутствие среди значимо меняющихся белков большого числа кератинов, что заслуживает дополнительного обсуждения. В предыдущих работах было показано, что цитоскелетные кератины являются основными белковыми компонентами КВВ как у курильщиков, так и у некурящих здоровых людей [19]. Согласно каталогу белков человека, цитокератины СК 1, 2, 9 и 10 — эпидермального происхождения, поэтому считается, что данные белки вносятся при пробоподготовке или имеют экзогенное происхождение, т.е. не относятся к белкам дыхательных путей [20]. В предыдущем исследовании выдвинуто предположение, что эти экзогенные кератины в КВВ являются свободно циркулирующими белками воздуха [19].

Кератины также являются основными структурными белками в эпителиальных клетках, повышенная секреция кератинов у пациентов после водородной терапии обусловлена, по-нашему мнению, освобождением респираторного тракта от поврежденного эпителия.

Из некератиновых белков наиболее часто в КВВ встречается дермцидин — белок-антибиотик, обладающий антибактериальной и протеолитической активностью. Известно, что дермцидин секретируется потовыми железами человека [21], экспрессия дермцидина наблюдается и во многих других тканях, включая респираторный тракт.

Содержание защитного белка аннексина А2 увеличивается в группе после водородной терапии. Этот белок имеет решающее значение для фибринолиза в легких, действуя как корецептор, который активирует эндогенный тканевый активатор плазминогена для лизиса тромбов и стимуляции клиренса фибрина. Аннексин А2 способствует эластичности легких, а также участвует в стабилизации и восстановлении клеточных мембран клеток легочного эпителия, тем самым предотвращая апоптоз [22].

Заключение

Результаты проведенного исследования группы медицинских сотрудников, перенесших COVID-19 и включенных в исследование в связи с ПКС, позволяют заключить, что применение водородной терапии способствует переключению ряда физиологических процессов, что может влиять на успех восстановительного лечения при ПКС. В частности, полученные результаты указывают на активацию водородной терапией аэробного синтеза АТФ в митохондриях, что хорошо соотносится с выявленным лабораторными исследованиями снижением уровня лактата (отражающим снижение анаэробного гликолиза) в крови исследованных пациентов [20]. Представляется важным, что данная терапия может тормозить провоспалительные процессы, негативно влияя на процессы свертывания и сигнальные пути интегринов и апоптоза, и, кроме того, активировать защитные пути, цикл трикарбоновых кислот, FAS-сигналинг и метаболизм пурина, что может быть важным для эффективного восстановления после перенесенного COVID-19.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.