Идентификация патогенного варианта c.683_684insCTGCAAGGACAAATCTGACGA гена рецептора липопротеинов низкой плотности у пациента с семейной гиперхолестеринемией. Клинический случай

Введение

Семейная гиперхолестеринемия (СГХС) — наследственное заболевание, вызываемое патогенными вариантами нуклеотидной последовательности (ВНП) генов, влияющих на обмен липопротеинов низкой плотности (ЛНП) и функционирование рецепторов к ним. Патогенные ВНП приводят к повышению уровня холестерина (ХС), транспортируемого ЛНП, к развитию атеросклеротического поражения сосудистого русла и клинической манифестации ишемической болезни сердца (ИБС) в молодом и детском возрасте [1-3].

Наследственные дефекты гена рецептора ЛНП (LDLR) приводят к нарушению удаления XC из кровотока и повышению уровня ХС ЛНП. Однако признаки СГХС не всегда обнаруживаются у молодых пациентов биохимическими методами из-за отсутствия клинических проявлений [4][5]. Важно также учитывать кумулятивное бремя XC и обращать внимание не только на повышенный уровень ХС ЛНП, но и на длительность такого повышения [2][6]. Гомозиготная форма СГХС легко выявляется по высокому уровню ХС ЛНП, но при гетерозиготной форме уровень ХС ЛНП может значительно варьировать. Этим определяется актуальность генетической диагностики СГХС, когда диагноз может быть поставлен еще до развития осложнений. Чаще всего при СГХС генетические дефекты обнаруживаются в последовательности рецептора ЛНП, спектр которых широк и специфичен для каждого этноса. Поэтому необходимо знать национальный спектр патогенных ВНП для диагностики заболевания. В России к 2022г было известно 203 вида патогенных или вероятно патогенных ВНП в гене рецептора ЛНП (LDLR) [7].

Выявление наследственного дефекта помогает определить дальнейшую тактику как в отношении самого пациента, так и его ближайших родственников с целью вторичной и ранней первичной профилактики осложнений атеросклероза.

Клинический случай

Информация о пациенте

Пациент В, 14 лет, обратился в связи с появлением болей в области сердца, и периодически появляющейся болезненности в области коленных суставов, больше справа, преимущественно в вечернее время, скованности нет.

Анамнез жизни: многократно переносил трахеобронхит.

Аллергические реакции на шоколад, клубнику, цитрусовые в виде появления высыпаний на коже, зуда.

Занимается танцами, нагрузки 3-4 раза в нед. по 2-2,5 ч.

Имеет двух сестер, воспитывается некровными родителями, по анамнезу биологических родителей данных нет. Сестры пробанда не имеют стигм, характерных для СГХС (ксантом, ксантеллазм, липоидной дуги роговицы) и признаков ИБС.

Результаты физикального осмотра

При осмотре состояние удовлетворительное, по органам и системам без особенностей. Выявлена липоидная полудуга роговицы. Визуально коленные, голеностопные суставы, мелкие суставы кистей и стоп не изменены.

Диагностическая оценка

При выполнении биохимического анализа крови выявлена выраженная дислипопротеинемия (ДЛП) с преимущественным повышением уровня ХС ЛНП, вторичные причины ДЛП были исключены (патология щитовидной железы, холестаз, нефротический синдром), показатели липидного спектра пациента представлены в таблице 1. Биохимический анализ крови: общий белок 74,7 г/л, билирубин 14,1 мкмоль/л, аланинаминотрансфераза 13,1 МЕ/л, аспартатаминотрансфераза 30 МЕ/л, креатинфосфокиназа 113 мкмоль/л, глюкоза 5,1 ммоль/л, креатинин 57 мкмоль/л. Выявлено повышение иммуноглобулина Е до 168 МЕ/л (при норме 0-90 МЕ/л), остальные иммуноглобулины в норме. В клиническом анализе крови без патологии.

На электрокардиограмме — синусовая аритмия (частота сердечных сокращений 70-77 уд./мин). Неполная блокада правой ножки пучка Гиса. Укорочение PQ интервала.

По данным эхокардиографии: увеличение полости левого желудочка (конечно-диастолический размер — 47 мм), клапаны не изменены, септальных дефектов нет. Сократительная способность нормальная, фракция выброса — 75%, расчетное давление в правом желудочке 18,6 мм рт.ст. Выявлен врожденный порок сердца — открытый артериальный проток, диаметр 1,5 мм. Ложная хорда левого желудочка.

Ультразвуковое исследование коленных суставов: конфигурация суставов правильная, целостность и структура сухожилия четырехглавой мышцы бедра и собственной связки надколенника не нарушены. Патологии не выявлено.

Рентгенограмма коленных суставов без патологических изменений.

При обследовании сестер 15 и 16 лет — у одной из сестер также выявлена выраженная ДЛП (таблица 1). Уровни липопротеина (а) (Лп(а)) у пробанда и сестер в пределах нормы.

Генетический анализ: прямое секвенирование всех экзонов и промоторной области гена LDLR пробанда с клиническими признаками СГХС на платформе Illumina HiSeq 1500 в "Health in Code" (Испания). Для проведения генетического анализа у родственников пробанда были использованы образцы геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) его родной и единоутробной сестёр. Геномную ДНК из замороженной крови выделяли методом высаливания белков [8] с модификациями. Для детекции инсерции c.683_684insCTGCAAGGACAAATCTGACGA проводили анализ миграции амплификатов экзона 4В гена рецептора ЛНП в 8% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием серебром. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с помощью стандартных праймеров [9].

При выполнении генетического анализа выявлена инсерция c.683_684insCTGCAAGGACAAATCTGACGA. Данный ВНП был впервые описан в 1992г Hobbs HH; он приводит к дупликации в 4-м экзоне гена рецептора ЛНП в последовательности рецептора аминокислотных остатков с 221 по 227 (p.Asp221_Asp227dup) [9]. Кроме США этот ВНП был также обнаружен в Великобритании [10], Японии [11], Испании [12], и Нидерландах [13].

На рисунке 1 представлена родословная пробанда и электрофореграмма ПЦР-продуктов, полученных после амплификации последовательности экзона 4В пробанда, его двух сестер, и пациента без СГХС. В норме размер амплификата должен составлять 268 п.н. — ему соответствует зона гомодуплекса. Зона над ней имеет размер 289 п.н. и представляет собой зону гомодуплексов амплификата с дупликацией (нижняя стрелка). Верхняя стрелка указывает на зону гетеродуплексов, образующихся при спаривании мутантного и нормального аллелей. Клинические данные пробанда и его сестер соответствуют данным генетического анализа.

Клинический диагноз

Таким образом, у пробанда 14 лет диагностирована определенная СГХС согласно критериям Саймона-Брума (у пациента <16 лет уровень общего ХС >6,7 ммоль/л или ХС ЛНП >4,0 ммоль/л в сочетании с позитивным ДНК-тестом) [14], носителем генетического дефекта исходя из представленных данных, видимо, является мать.

Обсуждение

К настоящему времени в России диагностирован лишь 1% пациентов с СГХС, при этом диагностика заболевания в детском и молодом возрасте, остается на крайне низком уровне [14].

Нами представлен клинический случай определенной СГХС согласно критериям Саймона-Брума. Результаты генетического исследования также подтвердили наличие СГХС у единоутробной сестры пробанда 16-ти лет. В гене рецептора ЛНП (LDLR) была обнаружена дупликация c.683_684insCTGCAAGGACAAATCTGACGA, которая, как было показано с помощью теста на функциональную активность рецептора ЛНП в культивируемых фибробластах больного СГХС с данной мутацией, является патогенной и приводит к развитию СГХС [9]. Предложен быстрый способ идентификации этого варианта с помощью гель-электрофореза ДНК, позволяющего выявлять дополнительные зоны гомодуплексов с мутацией и гетеродуплексов мутантных и нормальных амплификатов экзона 4В. Данный ВНП в России, ранее не обнаруживали [7].

Заключение

В последние годы внимание мирового медицинского сообщества обращено к созданию, ведению и анализу регистров пациентов с СГХС с целью получения данных об особенностях диагностики, клинической картине, гендерных различиях в конкретной стране или регионе. В России также ведется регистр пациентов с СГХС-РЕНЕССАНС (Регистр пациентов с семейной гиперхолестеринемией и пациентов очень высокого сердечно-сосудистого риска с недостаточной эффективностью проводимой гиполипидемической терапии), однако в связи с недостаточной изученностью популяции России на предмет наличия мутаций в гене рецептора ЛНП у больных СГХС, а также ее гетерогенностью, необходимо проводить ее дальнейшее исследование.

Информированное согласие

От родителей пациента получено письменное добровольное информированное согласие на публикацию описания клинического случая (дата подписания 17.05.2022г).

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.