Возможности банка биологических образцов для серологического мониторинга инфекционной заболеваемости

Введение

Технологии биобанкирования являются передовыми практиками мирового здравоохранения и важнейшим инфраструктурным звеном исследовательской работы на фундаментальном и клиническом этапах биомедицины [1][2]. Они играют критически важную роль в разработке средств и методов диагностики и лечения соматической патологии, а также изучения эпидемиологических и патогенетических особенностей известных и "новых" инфекций [3][4]. В настоящее время установлено, что важным аспектом построения системы биологической защиты населения является мониторинг инфекционной заболеваемости и прогноз развития эпидемического процесса [5][6]. Эффективным инструментом для решения данной проблемы является проведение сероэпидемиологических исследований, основанных на сборе и изучении образцов сывороток крови, что обеспечивает получение максимально надежных сведений о панораме иммунитета популяции [7][8].

Быстро развивающиеся технологии лабораторной диагностики инфекционных болезней позволяют выявлять маркеры нового поколения, повышая информативность мониторинговых исследований. При этом сопоставить данные с результатами, полученными в предыдущие годы, не всегда представляется возможным ввиду несоответствия современных и ранее используемых методик. Указанное обстоятельство сводит к минимуму попытки адекватно оценить динамику изменения лабораторных показателей. Решение описанной проблемы возможно при одновременном использовании единых иммунологических и молекулярно-биологических методов тестирования образцов, полученных из биобанков [9][10].

Строгие стандарты сбора и хранения коллекций биологических образцов обеспечивают достоверность результатов исследований и открывают перед учеными возможность анализа особенностей соматической и инфекционной патологии на принципиально новом уровне [11-13]. В РФ требования к организации и деятельности биобанков и правила хранения в них биологического материала утверждены приказом Минздрава России от 20 октября 2017г № 842н¹. Нормативным правовым актом предусмотрено соблюдение ряда условий по созданию системы качества на этапах заготовки, транспортировки, хранения и использования материалов из биобанков. На каждое из указанных действий должны быть разработаны стандарты операционных процедур и организован контроль их соблюдения. Такой подход позволяет обеспечить как высокое качество сохраняемых образцов, так и требования биологической безопасности. Последнее является чрезвычайно важной задачей, поскольку любой биологический материал может быть потенциально инфицирован патогенами, вызывающими болезни человека [14]. Перед поступлением в биобанк все образцы проходят строгий отбор, однако по ряду причин они не могут быть исследованы на наличие всех патогенных микроорганизмов. Значимость популяционных исследований отдельных аспектов инфекционной патологии стала основанием для формирования паспортизированной коллекции образцов сывороток крови еще в 1986г под руководством академика АМН СССР О. В. Барояна. В настоящий момент на базе отдела эпидемиологии ФГБУ "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи" Минздрава России (ФГБУ "НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи" Минздрава России) сформирована обширная коллекция сывороток крови, позволяющая проводить широкомасштабные научные исследования. Изучение распространенности специфических антител к возбудителям инфекционных болезней среди различных групп населения с использованием образцов из биобанка расширило представления об особенностях эпидемиологических процессов таких социально-значимых инфекций, как грипп и острые респираторные вирусные инфекции, вирусные гепатиты, инфекции, управляемые средствами вакцинопрофилактики (корь, краснуха и др.), позволило судить об истинном уровне заболеваемости, эффективности вакцинопрофилактики отдельных инфекций и принятии взвешенных решений при внесении корректировок в календарь прививок [15-19].

В последние годы в России существенно расширен перечень инфекционных болезней, регистрация которых осуществляется в рамках федерального государственного статистического наблюдения, приняты меры по совершенствованию эпидемиологического надзора и повышению качества лабораторной диагностики. Это оказало влияние на увеличение общего числа регистрируемых заболеваний. Примером тому может служить инфекционный мононуклеоз, регистрация которого в РФ осуществляется с 1990г. На протяжении всего периода статистического наблюдения заболеваемость данной патологией неуклонно росла и к 2022г достигла показателя 13,8 случаев на 100 тыс. населения. Необходимо отметить, что инфекционный мононуклеоз является симптомокомплексом, этиологическими агентами которого могут быть несколько патогенов — вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ), цитомегаловирус, вирус герпеса человека 6 типа и др. [20]. Около 90% случаев инфекционного мононуклеоза обусловлены ВЭБ. При этом отдельный статистический учет случаев заболеваний ВЭБ-инфекцией в Российской Федерации не ведется [21].

Заболевание, вызванное ВЭБ, имеет ряд особенностей, определяющих актуальность его изучения. В результате проникновения патогена в организм человека развивается первичная инфекция, которая может протекать как бессимптомно, стерто, так и с выраженными клиническими проявлениями, характерными для инфекционного мононуклеоза. После клинического выздоровления вирус, благодаря способности уклоняться от иммунного ответа, пожизненно сохраняется в организме хозяина. Болезнь переходит в хроническую форму. При этом периоды латентного течения периодически сменяются реактивациями. Хроническая ВЭБ-инфекция обуславливает развитие различной соматической, в т.ч. онкологической патологии. Наиболее изученными болезнями, ассоциированными с ВЭБ, являются лимфома Беркитта, назофарингеальная карцинома, рассеянный склероз [18].

Популяционные исследования частоты выявления специфических иммуноглобулинов (Ig) к белкам ВЭБ среди населения РФ ранее не проводились. В последние годы в научных статьях публикуются данные о распространенности отдельных серологических маркеров, однако сопоставить полученные результаты с данными прошлых лет не представлялось возможным [22]. Восполнить недостаток сведений позволило проведение ретроспективного исследования образцов сывороток крови, полученных из биобанка.

Цель исследования — анализ возможностей биобанка для изучения многолетней динамики частоты выявления маркеров инфицирования ВЭБ.

Материал и методы

Для проведения настоящего исследования из коллекции отдела эпидемиологии ФГБУ "НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи" Минздрава России (Москва) было получено 593 образца сыворотки крови от условно здоровых лиц в возрасте ≥18 лет, проживающих в Москве. В группу условно здоровых лиц были отнесены индивидуумы, прошедшие на момент забора образца крови периодический медицинский осмотр, по результатам которого не было выявлено клинических и лабораторно-инструментальных признаков патологических состояний.

Отбор образцов для формирования коллекции осуществлялся по результатам предоставления информированного добровольного согласия при соблюдении требований Хельсинкской декларации в соответствии с протоколом, одобренным Комитетом по биомедицинской этике ФГБУ "НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи" Минздрава России (Протокол № 2 от 04.02.2016). Образцы хранились при температуре -70º С, нарушений режима на протяжении всего периода нахождения в биобанке не зафиксировано. Размораживание каждого образца осуществлялось однократно непосредственно перед исследованием.

Для достижения поставленной цели были использованы образцы, отобранные в 2010, 2016, 2019, 2020, 2021 и 2022гг, которые изначально в момент их поступления в коллекцию на наличие маркеров ВЭБ не оценивались. Исследование проведено в ноябре 2022г спустя 12, 6, 3, 2, 1 год и 7 мес. после забора крови у условно здоровых лиц, соответственно.

Обнаружение специфических IgM и IgG к белкам ВЭБ осуществлялось методом количественного твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов реагентов производства "Вектор-Бест" (Россия). Диагностическая чувствительность и специфичность указанных наборов реагентов согласно инструкциям по применению составляет 100%. Определялось наличие следующих маркеров: IgM и IgG к капсидному (IgM VCA, IgG VCA), IgG к раннему (IgG EA) и нуклеарному (IgG EBNA) антигенам ВЭБ. При обнаружении IgM VCA и/или IgG EA, в т.ч. в сочетании с IgG VCA делалось заключение о наличии первичной ВЭБ-инфекции. Наличие на этом фоне IgG EBNA расценивалось как реактивация заболевания. Выявление только двух маркеров — IgG VCA и IgG EBNA свидетельствовало о латентном течении хронической инфекции.

По результатам проведенных лабораторных исследований рассчитывалась частота выявления маркеров на 100 обследованных лиц. Статистическая обработка проводилась с использованием методов непараметрической статистики. Достоверность различий оценивалась с помощью 95% доверительных интервалов (ДИ). Различия считались достоверными при р<0,05. Для оценки связи между параметрами использовался коэффициент ранговой корреляции Спирмена.

Результаты

Установлено, что все отобранные для исследования биологические образцы вне зависимости от года забора материала и поступления в банк сывороток крови были пригодны для проведения последующего лабораторного исследования. Маркеры, указывающие на наличие хронической ВЭБ-инфекции, выявлены в 99,2% образцов. При этом, частота обнаружения IgG VCA была достоверно выше таковой IgG EBNA (р<0,05), таблица 1.

Изучение характеристик образцов в зависимости от года их получения не выявило достоверных различий показателей по каждому из описанных маркеров наличия возбудителя (р>0,05). Дополнительно проведенный ранговый корреляционный анализ между превалентностью IgG VCA, IgG EBNA и продолжительностью хранения образцов установил отсутствие какой-либо значимой связи (коэффициент корреляции Спирмена составил -0,1 и -0,3, соответственно, связь обратная слабая незначимая).

Во всех группах образцов, поступивших в биобанк в разные годы, были выявлены IgM VCA и/или IgG EA, указывающие на наличие скрытых источников инфекции среди условно здоровых индивидуумов (таблица 2). При этом сочетание маркеров указывало на факты реактивации хронической ВЭБ-инфекции или суперинфицирования новым вариантом вируса. Частота выявления IgM VCA во всех исследованных образцах составила 4,4% (95% ДИ: 2,7-6,1) и достоверно не отличалась от таковой IgG EA — 6,1% (95% ДИ: 4,2-8,0) (р>0,05). Наличие одновременно двух маркеров инфицирования ВЭБ у одного обследованного лица имело место в шести случаях. Суммарная частота индивидуумов, имеющих в образце сыворотки крови один из указанных маркеров или их сочетание, достигла 9,4% (95% ДИ: 7,1-11,7).

В динамике в зависимости от года поступления образца в коллекцию показатели IgM VCA и IgG EA не имели достоверных различий между собой (р<0,05). Корреляционная связь между частотой выявления указанных маркеров присутствия возбудителя и продолжительностью хранения образцов в биобанке была слабой незначимой (коэффициент ранговой корреляции Спирмена составил -0,1 и 0,2, соответственно).

Обсуждение

Проведенное исследование позволило установить ряд важных характеристик образцов сывороток крови, находящихся на длительном хранении, необходимых для дальнейшей оценки эпидемического процесса ВЭБ-инфекции в рамках развития биобанкирования в России. В первую очередь, это отсутствие снижения частоты выявления специфических маркеров конкретного возбудителя, связанного с продолжительностью хранения образца.

Предположение о возможности таких изменений и их влиянии на полученный результат исследования было высказано рядом авторов [9][23] и вошло в основные положения методических документов². Считается, что IgG способны сохраняться в сыворотке крови при температуре -20º С в неизменной концентрации в течение 8 мес., в то время как IgM при аналогичных условиях хранения — только полгода. При более низкой температуре (-70º С) концентрация IgG сохраняются более длительный период времени [18]. В то же время, отечественными авторами было показано, что спустя 20 мес. от начала хранения при -70º С уровни IgG к вирусу кори в сыворотках крови незначительно снизились, но это не привело к изменению числа серонегативных образцов [9]. Это согласуется с полученными в настоящем исследовании результатами, в соответствии с которыми спустя 12 лет не только IgG, но и IgM к белкам ВЭБ идентифицировались в концентрациях, превышающих критические значения. Однако для получения убедительных доказательств изменения концентрации иммуноглобулинов к белкам ВЭБ при длительном нахождении в условиях биобанка целесообразно проведение исследования, дизайн которого предусматривал бы оценку образцов при поступлении на хранение и далее в динамике с заданными интервалами [24].

Вторым важным результатом стало обнаружение скрытых источников инфекции в когорте условно здоровых лиц, частота выявления которых варьировала в зависимости от года поступления сывороток в биобанк, что, вероятно, явилось следствием изменения эпидемической ситуации по ВЭБ-инфекции на территории г. Москвы [25]. Индивидуумы с бессимптомным и стертым течением болезни, как правило, не обращаются за медицинской помощью и активно вовлекаются в инфекционный процесс, что приводит к распространению патогенов посредством доступных механизмов передачи. Результаты проведенного ретроспективного исследования с использованием современных наборов реагентов обеспечили минимизацию вероятных диагностических погрешностей и позволили объективно оценить интенсивность эпидемического процесса, что необходимо для разработки эффективных подходов к профилактике.

Полученные данные являются уникальными, поскольку ранее оценка эпидемического процесса ВЭБ-инфекции проводилась косвенно по результатам регистрации клинических проявлений инфекционного мононуклеоза, достоверный диагноз которого не может быть установлен без лабораторной этиологической расшифровки [26]. Проведение серологических исследований с использованием возможностей биобанка позволит в будущем осуществлять многофакторный ретроспективный анализ заболеваемости, моделировать и разрабатывать прогнозные сценарии развития эпидемического процесса различных инфекций [27-29].

Работа с коллекцией сывороток отдела эпидемиологии ФГБУ "НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи" Минздрава России (Москва) предоставила уникальные возможности изучения распространенности и частоты выявления специфических иммуноглобулинов к белкам ВЭБ, что может быть использовано для разработки подходов иммунопрофилактики данной инфекции [30].

Ограничения исследования. Исследование имеет ограничения, обусловленные критериями отбора сывороток из биобанка, а также сопряженные с использованием наборов реагентов, чувствительность и специфичность которых, согласно инструкциям по применению, составляла 100%.

Заключение

Развитие банков сывороток крови и использование их возможностей для проведения серологических исследований позволяет получить информацию об эпидемическом процессе многих инфекций, в т.ч. тех, диагностика которых в предыдущие годы была недоступна, а официальный статистический учет не осуществляется.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.