Инвентаризация и контроль качества "Коллекции биообразцов от беременных женщин на разных сроках гестации для поиска ранних биомаркеров осложнений беременности"

Введение

Современные биобанки представляют собой передовую платформу, обеспечивающую доступ к высококачественным биообразцам, прошедшим стандартизированные процедуры на всех этапах жизненного цикла. Одним из преимуществ биобанков является возможность многократного использования аликвот этих образцов в разнообразных исследованиях и при клинических испытаниях [1].

Основным интегральным критерием, характеризующим биообразцы, является такое понятие как "высокое качество". Оно включает в себя не только стандарты получения, лабораторную обработку и соблюдение оптимальных условий хранения биологического материала, но и регламентированный способ получения и хранения данных, ассоциированных с образцами.

Менеджмент качества, регулярно осуществляемый при биобанкировании, обеспечивает сбор и хранение проб с минимальным процентом ошибок и потерь. При этом он подразумевает регулярный скрининг коллекции на предмет наличия образцов, не соответствующих заявленным критериям качества. Одним из таких способов является инвентаризация.

Инвентаризация биобанка в широком смысле — это процесс учета и проверки наличия и качества образцов, хранящихся в биобанке. Инвентаризация может включать в себя оценку корректности указания в базе данных таких характеристик, как вид биологического материала, состояние пациента при получении образца, учреждение в котором был получен образец, даты сбора, имя специалиста, производящего забор биоматериала, номер пробы, первичное состояние образца и др. В процессе инвентаризации также может происходить проверка и обновление системы хранения и организации биобанка для обеспечения ее сохранности и удобства использования. Окончательным результатом инвентаризации можно считать полный и точный список всех биологических образцов, находящихся в биобанке, и наличие полноценной информации о каждом из них.

Непосредственный контроль качества биообразцов в первую очередь заключается в оценке пригодности образцов для реализации различных научных задач [2]. Способы оценки качества зависят от целей сбора биообразцов и проводимых на их основе исследований (геномных, протеомных, транскриптомных и др.). Итогом проведения процедуры по контролю качества является характеристика биообразцов по выбранным критериям. Так, к примеру, для молекулярно-генетических исследований важное значение имеют следующие показатели: концентрация нуклеиновых кислот, соотношение длин волн A260/A280, показатели целостности дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и рибонуклеиновой кислоты (РНК) — DIN (DNA Integrity Number) и RIN (RNA Integrity Number), соответственно [3-5].

Начиная с 2019г, на базе биобанка отдела геномной медицины им. В. С. Баранова ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д. О. Отта" началось формирование "Коллекции биообразцов от беременных женщин на разных сроках гестации для поиска ранних биомаркеров осложнений беременности" [6-8]. По состоянию на 15.09.2023г в коллекции находится 18390 биообразцов от 427 беременных женщин. Сбор биоматериала для коллекции осуществляется проспективно в 4-х временных точках (в I, II, III триместрах и после родоразрешения). От беременных женщин один раз в триместр производится забор материнской периферической крови (вакуумные пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) 9 мл — 2 шт.; вакуумные пробирки с активатором свертывания крови — 1 шт.), мочи (не <40 мл); после родоразрешения забирается дополнительно участок плаценты (размер не <2×2×2 см) и пуповинная кровь (вакуумная пробирка с ЭДТА 9 мл — 1 шт.). В стандартном случае на каждую точку сбора приходится 20 биообразцов (6 аликвот цельной крови по 1 мл, 4 аликвоты плазмы крови по 1 мл, 6 аликвот сыворотки крови по 650 мкл, 4 аликвоты мочи по 4,5 мл) [6-8]. Сбор идет на протяжении 4-х лет, коллекция постоянно пополняется. Вместе с тем на базе коллекции проводится обширный спектр научных исследований [6-8], что предполагает частичное использование собранных образцов. Отличительной особенностью коллекции является сбор образцов, а также ассоциированных клинических данных на разных сроках беременности от одной женщины. Эти факторы обусловили необходимость проведения инвентаризации коллекции и оценки качества собранных биообразцов.

В настоящей работе представлены результаты проверки наличия биообразцов, клинических данных, карты хранилищ, а также оценки их качества. В ходе работы обновлена карта криохранилища, определено состояние клинической и базы данных аликвот, добавлены недостающие сведения. Поскольку коллекция ориентирована на исследование молекулярно-генетических маркеров, то проведена проверка качества биобразцов на геномном, протеомном и транскриптомном уровнях.

Материал и методы

Образцы

В качестве материала для исследования использовали образцы плазмы и сыворотки крови, цельной крови и лейкоцитарной пленки. Случайным образом были отобраны биообразцы со сроком хранения 2, 3, 4 года (n=6 для каждого типа биоматериала в каждый год хранения).

Критерии включения женщин были следующими: возраст (25-35 лет), нормальный индекс массы тела (19-24 кг/м²), одноплодная беременность.

Критериями невключения были: тяжелые хронические заболевания (артериальная гипертензия, сердечно-сосудистые заболевания, почечная патология, сахарный диабет, гемотрансмиссивные инфекции (гепатиты, вирус иммунодефицита человека, антифосфолипидный синдром и др.); осложнения гестации (ранний токсикоз беременных, высокий риск хромосомных аномалий плода, врожденных патологий развития плода или преэклампсии по данным комбинированного первого скрининга); наличие осложнений поздних сроков беременности (гестационный сахарный диабет, преэклампсия, гепатоз, отслойка плаценты и др.), т.к. перечисленные заболевания могли повлиять на исследуемые показатели.

Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ "НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д. О. Отта" (Санкт-Петербург, Россия), протокол № 97 от 27 июня 2019г. Информированное согласие было подписано всеми женщинами до взятия биообразцов.

Процессинг биообразцов

Пробоподготовка образцов осуществлялась согласно стандартным операционным процедурам, описанными нами ранее [8]. Биообразцы цельной крови, плазмы, сыворотки и лейкоцитарной пленки хранились при температуре -80º С.

Инвентаризация коллекции

Инвентаризация коллекции проведена согласно следующему плану:

1. Проверка местонахождения криоштативов в хранилище, зафиксированных в базе. Обновление карты криохранилища.
2. Проверка наличия аликвот и добавление пометок об их отсутствии.
3. Редактирование ошибок в базе.
4. Проверка ассоциированных клинических данных в базе.
5. Сбор недостающих клинических данных и их добавление.
6. Исключение образцов при отсутствии данных.

Инвентаризация проводилась параллельно двумя сотрудниками биобанка для минимизации влияния человеческого фактора при проверке.

Выделение РНК

РНК экстрагировали из 10 мг лейкоцитарной пленки набором PureLink™ RNA Mini Kit (Invitrogen, США) в соответствии с инструкцией производителя. Для элюирования РНК использовали 50 мкл воды без рибонуклеаз.

Выделение внеклеточной ДНК (вкДНК)

Внеклеточную ДНК (вкДНК) экстрагировали из 300 мкл плазмы набором MGIEasy Circulating DNA Isolation Kit (BJI, Китай) в соответствии с инструкцией производителя. Для ресуспендирования вкДНК использовали 30 мкл элюирующего буфера.

Выделение ДНК из клеток крови

ДНК экстрагировали из 400 мкл цельной крови солевым методом [9]. Полученную ДНК элюировали в 100 мкл воды без нуклеаз.

Белковый электрофорез в полиакриламидном геле

Образцы сыворотки, хранившиеся при температуре -80º С, размораживали на льду. После размораживания образцы тщательно перемешивали пипетированием. Сыворотку разбавляли в десять раз. Для этого к 10 мкл образца добавляли 90 мкл фосфатно-солевого буфера (pH 7,6) (137 мМ NaCl; 2,7 мМ KCl; 10 мМ Na2HPO4; 1,76 мМ KH₂PO4), содержащего ингибиторы протеаз "Complete Tablets Mini" (Roche, США). К каждому образцу добавляли 34 мкл 4-кратного буфера для нанесения образцов, (100 мM Tрис-HCl (pH 6,8), 20% меркаптоэтанол, 10% доцецилсульфат натрия (SDS), 0,2% бромфеноловый синий и 40% глицерин). Образцы инкубировали на водяной бане при температуре 95º C в течение 10 мин. В лунки 10%-го полиакриламидного геля наносили по 2 мкл каждой пробы и проводили электрофорез по стандартной методике [10]. После электрофореза полиакриламидный гель промывали в воде в течение 15 мин. Проводили окрашивание геля в растворе Кумасси (0,2% Кумасси G-250, 10% уксусная кислота, 40% этанол) в течение 2-4 ч при постоянном покачивании. Для отмывки несвязавшегося с белками красителя гель ополаскивали в воде и отмывали в растворе (10% уксусная кислота, 40% этанол) в течение 1 ч, со сменой раствора для отмывки через 30 мин и дважды через 15 мин.

Оценка качества биообразцов

Качество выделенных образцов геномной ДНК (гДНК) оценивали путем измерения концентрации ДНК на флуориметре "Qubit 2.0" (Invitrogen, США) и 1X dsDNA HS Assay Kit, соотношения длин волн A260/A280 — на спектрофотометре "Nanodrop 2000" (Thermo Scientific, США). Целостность ДНК (DIN) определяли с использованием автоматического капиллярного гель-электрофореза на приборе "2200 TapeStation Instrument" (Agilent Technologies, США) и Genomic DNA ScreenTape.

Качество выделенных образцов вкДНК оценивали путем измерения концентрации вкДНК на флуориметре "Qubit 2.0" (Invitrogen, США) и 1X dsDNA HS Assay Kit. Целостность вкДНК определяли с использованием автоматического капиллярного гель-электрофореза на приборе "2200 TapeStation Instrument" (Agilent Technologies, США) и High Sensitivity DNA ScreenTape.

Качество выделенных образцов РНК оценивали путем измерения концентрации РНК на флуориметре "Qubit 2.0" (Invitrogen, США) и RNA High Sensitivity Assay Kit, оценки соотношения длин волн A260/A280, измеренных на спектрофотометре "Nanodrop 2000" (Thermo Scientific, США). Целостность РНК оценивали с помощью RIN с использованием автоматического капиллярного гель-электрофореза на приборе "2200 TapeStation Instrument" (Agilent Technologies, США) и RNA ScreenTape.

Фотофиксацию результатов белкового электрофореза проводили с использованием гель-документирующей системы ChemiDoc (BioRad, США), используя экран "Chemi".

Статистический анализ

Статистический анализ данных выполнен с использованием Statistica 10.0 (StatSoft, Inc., США). Достоверность различий определяли с помощью непараметрического рангового критерия Краскела-Уоллиса. Различия считали достоверными при p<0,05. Непрерывные переменные представлены как среднее ± стандартная ошибка (M±SEM).

Результаты

Инвентаризация

В результате инвентаризации была обновлена карта хранилища (расположение криоштативов в хранилищах), было проверено наличие аликвот (n=18390) в каждом из криоштативов и их расположение в штативе, также были исправлены ошибки в маркировке пробирок. Исправление ошибок проводилось согласно разработанным ранее стандартным операционным процедурам по пробоподготовке биообразцов, контролю качества биообразцов, хранению биообразцов и анализу данных [8]. В результате в базе данных было сделано 84 исправления найденных ошибок, а именно 4 в расположении криоштатива в хранилище, 43 в расположении криопробирки в криоштативе, 15 в маркировке пробирок, 22 в заполнении базы данных.

Была проведена проверка клинических данных, ассоциированных с биообразцами коллекции. В связи с тем, что сбор образцов происходит проспективно в 4-х временных точках (в I, II, III триместрах и после родоразрешения), есть вероятность отсутствия клинических данных во всех временных точках сбора, например, могут быть не указаны антропометрические показатели, информация о гинекологических и экстрагенитальных заболеваниях и т.д. [7]. В результате проверки были обнаружены неполные клинические данные у 64 пациенток из 427. Причины отсутствия данных: отказ от продолжения участия в исследовании, отказ от предоставления выписки после родоразрешения, переезд в другой регион/страну без предоставления контактных данных (таблица 1).

Оценка качества ДНК

Средняя концентрация ДНК, выделенной из 400 мкл цельной крови для образцов 2019-2022гг, составляет от 57,12 до 88,67 нг/мкл. Среднее соотношение A260/280 за эти года варьируется от 1,88 до 1,89, а DIN от 9,46 до 9,73, что свидетельствует о высоком качестве ДНК (таблица 2). Корреляции между продолжительностью хранения и общей концентрацией или качеством выделенной ДНК (показателями A260/280 и DIN) обнаружено не было. Эти данные позволяют предположить, что образцы цельной крови в коллекции содержат ДНК, пригодную для проведения молекулярно-генетических исследований, а качество ДНК не зависит от срока хранения [3][11][12].

Оценка качества вкДНК

Количественный флуорометрический анализ является оптимальным вариантом для анализа образцов с невысокой концентрацией ДНК [13]. Не рекомендуется использовать образцы с концентрацией вкДНК плазмы <2 нг/мл [5]. В настоящем исследовании средняя концентрация вкДНК варьировалась от 0,190 до 0,214 нг/мкл. На электрофореграмме основной пик фрагментов вкДНК соответствуют 150-170 пар нуклеотидов (п.н.) (рисунок 1). Основываясь на полученных результатах, показанных в таблице 3, можно заключить, что срок хранения плазмы крови не влияет на качество вкДНК, образцы 2019г и 2022г можно использовать для исследований.

Оценка качества РНК

Образцы РНК определяются как "хорошие" или "умеренные" с соотношением A 260/280 от 1,98 до 2,04 при RIN ≥6,9 и от 2,05 до 2,08 при RIN ≥5 [4].

Результаты анализа образцов 2019г являются пограничными, в отличие от результатов последующих лет, но при этом находятся в пределах нормы (таблица 4).

Таким образом, биообразцы, входящие в коллекцию, обладают хорошим качеством вне зависимости от срока хранения [4].

Оценка качества белкового профиля

На рисунке 2 представлены результаты анализа образцов сыворотки при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. Окрашенные полосы соответствуют основным мажорным белкам, представленным в сыворотке. Из представленных данных на рисунке 2 видно, что во всех образцах, вне зависимости от периода хранения, видны основные белковые зоны, их количество и размеры не различаются. Признаков деградации белковых зон после длительного хранения не наблюдается.

Обсуждение

В современном биобанке невозможно обойтись без мер по повышению и обеспечению качества коллекций и предоставляемых услуг [2]. Одними из важных аспектов обеспечения качества в биобанке являются контроль качества биообразцов и инвентаризация биоресурсных коллекций, включая ассоциированные с образцами данные. Проведение контроля качества позволяет не только убедиться в пригодности тех или иных биообразцов для определенных исследований, но и добиться воспроизводимости результатов анализа [2]. В свою очередь, возможность определить местоположение биообразца в хранилище и наличие ассоциированных с ним данных в любое время является не менее важным параметром в определении качества биобанка. Для этого в рамках обеспечения качества должна проводиться периодическая инвентаризация биоресурсных коллекций.

"Коллекция биообразцов от беременных женщин на разных сроках гестации для поиска ранних биомаркеров осложнений беременности" является уникальной и ценной базой для медицины, фундаментальных и прикладных направлений. Исследования на основе коллекции позволяют изучать патогенетические механизмы различных гестационных осложнений, а также разрабатывать новые методы диагностики и терапевтических мероприятий в области акушерства и гинекологии [6-8].

В коллекции представлены образцы цельной крови, плазмы, сыворотки, лейкоцитарной пленки, мочи, плаценты, пуповинной крови, которые собираются в разные периоды беременности. Анализ этих образцов позволяет получить разнообразную информацию о состоянии здоровья матери и плода, метаболических процессах, генетических маркерах и биохимических параметрах [8][14].

Коллекция пополняется с 2019г по настоящее время. За этот период могли накопиться различные ошибки, связанные с ведением электронной базы коллекции и фактическим наличием биообразцов. Для выявления и устранения этих ошибок была проведена инвентаризация коллекции. В первую очередь проверяли соответствие базы данных коллекции фактическому наличию аликвот в криоштативах, ошибки в расположении криопробирок в криоштативах, отсутствие или опечатки в маркировке криопробирок, а также ошибки в заполнении базы данных (опечатки, отсутствие информации). Все выявленные ошибки были связаны с человеческим фактором и могут быть обусловлены работой с большим количеством образцов. Полученные данные свидетельствуют о необходимости регулярного проведения инвентаризации для исключения преаналитических ошибок при формировании и использовании коллекции.

В ходе инвентаризации проведена оценка заполнения медицинской информации. Отсутствие или неполная клиническая характеристика образцов ограничивает их использование в исследованиях. Недостаточные клинические данные были обнаружены у 64 женщин, что составляет 15% от всех доноров коллекции. Образцы от этих женщин не подходят для поиска маркеров осложнений беременности, но могут быть использованы для тестирования новых методов исследования и оценки качества хранящихся образцов.

К сожалению, никаких рекомендаций по частоте проведения инвентаризации коллекций в биобанке нет, каждый биобанк принимает решение самостоятельно, основываясь на собственном опыте, размере коллекции или количества поступающих биообразцов.

Качество образцов в коллекции является ключевым фактором, гарантирующим возможность их использования в будущих исследованиях. Контроль качества позволяет минимизировать риски изменений в образцах в процессе длительного хранения, тем самым повышая достоверность результатов исследований, а также продлевая жизненный цикл коллекции. Текущие исследования, проводимые на базе коллекции, направлены на изучение геномных (ДНК), транскриптомных (РНК) и протеомных особенностей беременных женщин с различными осложнениями гестации. Поэтому для контроля качества образцов коллекции были выбраны показатели, характеризующие качество вкДНК и гДНК, РНК, белкового профиля. Оценивались следующие показатели ДНК: DIN, концентрация, A 260/280; вкДНК: концентрация; РНК: RIN, концентрация, A 260/280; деградация белковых зон.

К основным показателям качества гДНК относятся чистота (A260/280) и целостность (DIN). "Чистыми" являются образцы ДНК с соотношением А260/280 >1,8, В свою очередь ДНК считается высокоинтактной при значении DIN >8,5 [15]. Многие биобанки проводят свой контроль качества образцов ДНК: так, в норвежском популяционном биобанке HUNT Biobank (Норвегия) средняя концентрация ДНК составляет 50 нг/мкл, а соотношение A260/280 — 1,8, на основании тестирования 1255 образцов цельной крови¹. При контроле качества коллекции получены средние значения показателей концентрации для гДНК, выделенной из цельной крови, >50 нг/мкл, A260/280 >1,8, DIN >9, что свидетельствует о высоком качестве собранных нами образцов. Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод, что образцы коллекции могут быть использованы для любых типов исследований в области молекулярной генетики.

Как и в случае гДНК, одним из показателей пригодности вкДНК является ее концентрация [16]. Для оценки концентрации вкДНК нами был выбран метод флуориметрии, поскольку он является оптимальным для данного типа аналитов и обладает высокой точностью измерений [13]. Как правило, для проведения молекулярно-генетических исследований необходимо не <1 нг вкДНК [13], все протестированные нами образцы соответствуют этому требованию, что указывает на их хорошее качество.

В настоящее время наибольшее распространение для оценки целостности РНК получил метод определения индекса RIN: образцы РНК со значениями RIN ≥7 считаются интактными, следовательно, имеют высокое качество и пригодны для применения различных методов оценки экспрессии генов (чипы, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, микрочипы микроРНК, секвенирование РНК). Значения RIN от 5 до 7 указывают на небольшую деградацию РНК, <4 — на высокий уровень деградации РНК, такие образцы подходят для исследования микроРНК или экспрессии определенного гена [14]. Важно отметить, что концентрация и целостность РНК могут зависеть от типа исходного биоматериала [14][17]. Однако лишь в единичных публикациях представлены данные об этих параметрах в биобанках. Например, в Tumor Biobanks (Бельгия) был проведен контроль качества препаратов РНК, выделенных из опухолевых тканей, образцы со значениями RIN ≥7, 1,8≤ А260/280 ≤2,1 были определены как пригодные для всех транскриптомных исследований [17]. Образцы, взятые нами для проверки качества РНК, также имели RIN ≥7 и 1,8≤ А260/280 ≤2,1, что свидетельствует о возможности их применения в дальнейшей работе.

Согласно экспериментальным исследованиям протеомные маркеры обладают разной стабильностью [18], поэтому выбор метода для оценки качества образцов во многом зависит от целей исследования. К одному из показателей качества биообразцов относится белковый профиль, который может быть оценен с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. В публикациях нет сведений об использовании этого метода для оценки качества образцов в биобанках, он не является специфичным для конкретного типа протеомных маркеров, однако может служить средством для предварительной оценки деградации белков в биообразце. В ходе проверки качества образцов сыворотки с разным сроком хранения нами не было обнаружено каких-либо изменений в их белковом профиле. Это косвенно свидетельствует об отсутствии деградации белков в образцах сыворотки крови, хранившихся при температуре -80º C в течение >4 лет.

Таким образом, результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что образцы коллекции, вне зависимости от срока хранения обладают высоким качеством и могут быть использованы в различных типах исследований. Это было достигнуто благодаря регламентированию работ при создании коллекции: стандартизации всех проводимых процедур с биообразцами (сбор, обработка и хранение), своевременному техническому обслуживанию оборудования, обучению персонала, а также менеджменту качества. На данный момент отсутствуют международные и национальные рекомендации относительно периодичности проведения инвентаризации, т.к. во многом это зависит от индивидуальных характеристик и целей каждого биобанка. Основываясь на итогах проделанной работы, рекомендуем проводить инвентаризацию не реже одного раза в год или каждые 5000 образцов для исключения преаналитических ошибок при формировании коллекции. Полная и четкая база данных позволит ускорить процесс получения биообразцов с заданными параметрами для исследований, включая клиническую характеристику образцов.

Заключение

"Высокое качество" биообразцов является главным критерием оценки работы биобанка. Для его повышения необходимо выстраивать работу на основных принципах обеспечения качества, в т.ч. проводить контроль качества биообразцов и периодическую инвентаризацию биоресурсных коллекций.

Реализованный нами подход по оценке некоторых параметров образцов и проведенная инвентаризация "Коллекции биообразцов от беременных женщин на разных сроках гестации для поиска ранних биомаркеров осложнений беременности" может стать важным элементом по продвижению биобанкирования как основной базовой стратегии в поддержании качества проводимых исследований и клинических испытаний.

Отношения и деятельность. Исследование поддержано грантом РНФ № 19-75-20033. Часть работ выполнена на базе РЦ "Центр Биобанк" Научного парка СПбГУ.