Создание биоресурсной коллекции компонентов крови беременных женщин для выявления генетических особенностей плода, а также для поиска генетических маркеров гестационных осложнений

Введение

Профилактика и ранняя диагностика патологий плода и возможных осложнений во время беременности, родов и в послеродовом периоде являются одними из ключевых задач современного здравоохранения [1].

В последнее десятилетие возрос интерес к изучению внеклеточной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) (вкДНК), циркулирующей в плазме крови беременных. Помимо собственной вкДНК в плазме крови беременных, также содержится вкДНК плодного происхождения — внеклеточная фетальная ДНК (вкфДНК) [2]. В настоящее время вкфДНК используется для неинвазивного пренатального тестирования (НИПТ) хромосомных аномалий. НИПТ имеет высокую чувствительность и специфичность для распространенных хромосомных патологий таких, как трисомия 21 (синдром Дауна), трисомия 18 (синдром Эдвардса) и трисомия 13 (синдром Патау) [3]. В то же время возможности НИПТ для обнаружения других форм хромосомных аномалий, включая патологии половых хромосом, редкие аномалии, мозаичные формы анеуплоидий, частичные хромосомные аномалии, до конца не изучены [3].

В дополнение к обнаружению хромосомных аномалий стали появляться коммерческие тесты для выявления моногенных заболеваний у плода на основе исследования вкДНК. Тем не менее, вопрос скрининга генных мутаций у плода по вкфДНК остается открытым. Большинство тестов основаны на исследовании носительства патогенных мутаций у матери и отца, и только лишь в некоторых случаях применяется анализ вкДНК [1].

Недавние исследования показали возможность использования вкфДНК для прогнозирования риска развития акушерских патологий [4]. Изменения в профиле и уровне вкфДНК были обнаружены у женщин с преэклампсией [5], задержкой развития плода [6] и преждевременными родами [7][8]. Однако эти данные зачастую противоречивы, их недостаточно для использования в клинической практике, поэтому необходимы дальнейшие исследования.

Следует отметить, что вкДНК также содержит митохондриальную ДНК (вкмтДНК), фрагменты геномов вирусов и бактерий [9-11]. Повышение уровня митохондриальной ДНК (мтДНК) в крови обнаружено у женщин c преэклампсией [12-17], гестационным сахарным диабетом [18], задержкой развития плода [19]. Это позволяет рассматривать вкмтДНК в качестве потенциального биомаркера осложнений беременности. В свою очередь вирусные и бактериальные инфекции также могут вызвать осложнения беременности, а их своевременное выявление и лечение позволяет избежать тяжелых последствий [9][11][20].

Важная роль в развитии патологий беременности отводится полиморфизмам генов самой женщины, о чем свидетельствуют данные семейного анамнеза, результаты исследований близнецов, этнические различия и молекулярно-генетические исследования [21]. Однако данные о связи полиморфизмов различных генов с риском развития осложнений беременности по-прежнему противоречивы, что указывает на необходимость дополнительных исследований, а также пересмотра вклада генетических факторов в формирование патологий беременности.

В настоящее время оборудование и методы, используемые для анализа ДНК, стремительно развиваются. С появлением более совершенных и доступных вариантов возникает необходимость быстрой апробации и внедрения новейших технологий в лабораторную практику.

Решение описанных проблем невозможно без сбора биологических образцов от беременных женщин. В 2015г на базе Отдела геномной медицины ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д. О. Отта" было организовано отделение Биобанк "ГЕНОФОНД"¹. С 2019г Биобанк "ГЕНОФОНД" является членом Национальной ассоциации биобанков и специалистов по биобанкированию (НАСБИО). Биобанк "ГЕНОФОНД" специализируется на сборе и хранении различных типов биообразцов от пациентов с заболеваниями, значимыми для репродукции. Коллекции биобанка постоянно пополняются и формируются в соответствии с научными проектами ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д. О. Отта".

Цель настоящей работы — создание коллекции образцов плазмы и лейкоцитов крови беременных для усовершенствования методов неинвазивного пренатального тестирования, а также для поиска ДНК-маркеров и изучения молекулярных механизмов гестационных осложнений.

В статье представлены результаты 5-летней работы по созданию, развитию и поддержанию коллекции образцов компонентов крови беременных женщин, дана клиническая характеристика биообразцов, представлены результаты сбора исходов беременности, кратко подведены итоги использования коллекции и определены дальнейшие перспективы.

Материал и методы

Для создания коллекции используются образцы крови женщин >18 лет с одноплодной беременностью сроком >9 нед., которые направлены в ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д. О. Отта" для проведения инвазивной пренатальной диагностики (ИПД) или НИПТ хромосомных аномалий. Работа одобрена Этическим Комитетом ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д. О. Отта" (№130 от 16 июля 2020г) и проводится в соответствии с Хельсинкской декларацией. Взятие крови осуществляется после получения информированного согласия женщины на использование ее биоматериала в научных целях. Перед взятием крови у всех женщин собирается информация о возрасте, весе, росте, сроке и способе наступления беременности, о результатах раннего пренатального скрининга и данных ультразвукового исследования. В случае необходимости ИПД кровь собирают до процедуры.

Сбор биологического материала и его обработка проводится в соответствии с разработанными стандартными операционными процедурами. Взятие крови производится в пробирки объемом 10 мл с 0,5 М раствором K₂-ЭДТА (2-замещенной калиевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты) в случае кратковременного хранения или в пробирки, содержащие стабилизатор вкДНК (Streck, США или GBM, Россия), если требуется длительное хранение до пробоподготовки. Если кровь собрана в пробирки с К₂-ЭДТА, обработка биоматериала проводится в течение 2 ч после сбора [22]. Если кровь собрана в пробирки со стабилизатором вкДНК, то ее обработка проводится не позднее, чем через 14 дней после венепункции, в соответствии с рекомендациями производителя. Образцы плазмы с гемолизом или хилезом исключаются из коллекции. Количество аликвот, условия пробоподготовки и хранения представлены в таблице 1.

Для НИПТ используется одна аликвота плазмы крови. Выделение ДНК проводится с помощью набора реагентов "MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit" ("Thermo Fisher Scientific Inc.", США) согласно рекомендациям производителя. НИПТ проводится методом полногеномного высокопроизводительного секвенирования вкДНК на приборе Ion GeneStudio S5 (Thermo Fisher Scientific Inc, США) или на приборе DNBSEQ-G50 (MGI, Китай) с последующим применением ранее разработанного биоинформатического алгоритма². У женщин с высоким риском по результатам НИПТ осуществляется сбор информации о результатах ИПД (или о результатах кариотипирования материала плода после завершения беременности). В случае низкого риска, а также при пролонгировании беременности в случае высокого риска осуществляется сбор данных о течении, исходах беременности и состоянии новорожденных после родоразрешения.

Для учета образцов, клинических и геномных данных используются таблицы Excel. Все сведения об образцах хранятся с соблюдением условий конфиденциальности — каждому образцу присваивается уникальный идентификационный номер. Результаты секвенирования хранятся в виде файлов в формате bam для прибора Ion GeneStudio S5 или в виде fastq — для прибора DNBSEQ-G50.

Статистическая обработка данных проведена с помощью программы Jamovi (version 2.3.26). Для показателей, характеризующих качественные признаки, указано абсолютное значение и относительная величина в процентах. Для количественных переменных рассчитывали среднее и стандартное отклонение от среднего (все переменные имели нормальное распределение согласно критерию Шапиро-Уилка).

Результаты

Количество образцов в коллекции по состоянию на 01.07.2023г представлено в таблице 2. Работа по сбору биообразцов и созданию коллекции продолжается. Для формирования коллекции используются две группы биообразцов.

В первом случае используются образцы крови беременных, которые направлены в ФБНУ "НИИ АГиР им. Д. О. Отта" для проведения ИПД в связи с риском рождения ребенка с анеуплоидией. В коллекцию включаются образцы крови всех женщин. После ИПД осуществляется сбор сведений о кариотипировании материала плода. Преимуществами такого подхода являются непосредственное определение кариотипа плода и возможность формирования контрольных выборок. С помощью этого подхода на 01.07.2023г собраны образцы крови от 322 беременных (таблица 3). Средний возраст женщин составляет 29,6±5,44 лет (20-47 лет). Сроки беременности находятся в пределах от 9 до 32 нед. гестации (среднее значение 13/4±2/6 нед.). Нормальный кариотип определен в 241 случае, из них 52,3% (126) случаев — плоды мужского пола и 47,7% (115) случаев — плоды женского пола. У 67 плодов выявлены анеуплоидии (таблица 3). Для 200 женщин проведено полногеномное секвенирование вкДНК.

Вторую группу составляют образцы крови женщин, направленных на НИПТ. При выявлении высокого риска по результатам НИПТ женщина направляется на ИПД для цитогенетического исследования материала плода. Если результаты НИПТ и ИПД совпадают, образец включается в коллекцию. В случае низкого риска по результатам НИПТ образец хранится до завершения беременности родами, после чего осуществляется сбор данных о течении и исходах беременности. К достоинствам этого подхода можно отнести полногеномное секвенирование вкДНК образцов всех женщин, возможность отбора образцов с редкими хромосомными аномалиями, возможность сбора биоматериала до клинических проявлений осложнений беременности и формирования выборок женщин в зависимости от гестационных патологий.

На 01.07.2023г с помощью НИПТ обследованы образцы плазмы крови от 5554 пациенток. Для 5492 женщин получен результат. Средний возраст этих женщин составил 33,5±3,21 лет (19-47 лет), средний срок беременности при взятии крови — 12±1,4 нед. (9-34 нед.).

Высокий риск хромосомных нарушений у плода по результатам НИПТ определен в 254 наблюдениях, 201 случай хромосомных аномалий был подтверждён в результате ИПД (таблица 4). Важно отметить, что в случае редких хромосомных аномалий исследование кариотипа плода было выполнено только у 12 женщин, 6 случаев были подтверждены результатами ИПД. Среди них два случая трисомии по хромосоме 2, один случай трисомии по хромосоме 22, один случай моносомии хромосомы 18 (у плода выявлена делеция длинного плеча хромосомы 18), два случая трисомии по хромосоме 16. Все эти образцы включены в коллекцию.

Низкий риск хромосомных нарушений у плода с помощью НИПТ был определен в 5238 наблюдениях. На 01.07.2023г у 635 женщин после завершения беременности родами осуществлен сбор данных о течении и исходах беременности. Для 45 женщин получение сведений не представлялось возможным, их образцы были исключены из коллекции; в то же время для 590 женщин информация была получена. У всех этих женщин было получено фенотипическое подтверждение отсутствия анеуплоидий и пола плода. Основные клинические данные представлены в таблице 5. Средний возраст в этой когорте женщин составил 34,0±5,18 лет (20-46 лет). Средний срок беременности при сборе крови составил 14±1,6 нед. (9,5-34 нед.). У большинства женщин (552 (93,6%)) взятие крови осуществлялось до 20 нед. беременности: у 280 (47,5%) беременных — до 13 нед. и у 272 (46,1%) беременных — между 14 и 20 нед. Только у 38 (6,4%) биоматериал был получен после 20 нед. В 212 случаях беременность осложнилась "большими акушерскими синдромами": гестационный сахарный диабет на диетотерапии был диагностирован у 62 (10,5%) женщин, на инсулинотерапии — у 17 (2,9%) беременных, гипертензия беременных — у 23 (3,9%), преэклампсия — у 49 (8,3%), преждевременные роды — у 25 (4,2%) женщин, задержка развития плода была установлена в 36 (6,1%) случаях.

Всего, по состоянию на 01.07.2023г в коллекции содержатся образцы плазмы крови и лейкоцитарной пленки от 5814 беременных. Для 5692 женщин выполнено полногеномное секвенирование вкДНК. Данные о цитогенетическом исследовании материала плода после ИПД собраны у 522 женщин, данные о течении и исходах беременности — у 590 женщин.

В настоящей работе образцы коллекции были использованы для апробации и валидации ранее разработанного биоинформатического алгоритма НИПТ методом высокопроизводительного секвенирования на приборе DNBSEQ-G50 (MGI, Китай). В качестве контроля использовали аликвоты плазмы крови 50 беременных плодами с нормальным кариотипом. Для валидации НИПТ использовали аликвоты плазмы крови других 150 женщин: 100 беременных плодами с нормальным кариотипом и 50 образцов беременных плодами с хромосомными патологиями. Во всех случаях результаты, полученные как цитогенетическим методом, так и при использовании НИПТ, совпали. Отсутствие анеуплоидий у плода после анализа вкДНК было определено в 100 наблюдениях, патология кариотипа была определена в 50 наблюдениях (таблица 6). Все патологии были определены верно. Таким образом, специфичность метода соответствовала ожидаемой и составила >99,9%. Чувствительность метода — 100%.

Обсуждение

Биоресурсные коллекции являются важным инструментом для проведения научных исследований, создания более совершенных диагностических тестов, разработки новых подходов к лечению и профилактике различных заболеваний человека.

В последние годы в России стали появляться стандартизированные коллекции биообразцов, которые собираются в период беременности. Так, в ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д. О. Отта" ведутся работы по созданию уникальной коллекции биоматериала женщин на разных сроках гестации. В эту коллекцию входят образцы венозной крови, мочи, пуповинной крови и плацентарной ткани от женщин с различной акушерской патологией и с неосложненным течением беременности. На сегодняшний день собрано >400 образцов, и сбор продолжается. Основные области использования этой коллекции связаны с поиском ранних молекулярно-генетических маркеров наиболее распространенных осложнений беременности [23]. В то же время такая важная область медицины, как пренатальная диагностика осталась без внимания. В настоящей работе мы приступили к формированию биоресурсной коллекции, ориентированной на разработку новых методов неинвазивной пренатальной диагностики на основе анализа вкДНК.

В качестве первичного биоматериала была выбрана цельная кровь, собранная в пробирки с К₂-ЭДТА или со стабилизатором вкДНК. Экспериментальные исследования показали, что наиболее подходящим биоматериалом для выделения вкДНК является плазма крови [24], а оптимальным вариантом для взятия крови является ее забор в пробирки с К₂-ЭДТА [24]. Однако этот тип пробирок пригоден только для кратковременного хранения при комнатной температуре до центрифугирования из-за разрушения клеток и контаминации геномной ДНК. Для длительного хранения до центрифугирования подходят пробирки, содержащие стабилизатор, защищающий клетки крови от деградации [24]. Важно отметить, что оба типа пробирок подходят для сбора лейкоцитов, содержащих геномную ДНК беременных женщин, которую можно использовать для поиска генов предрасположенности к осложнениям беременности. Также образцы геномной ДНК беременных в ряде подходов НИПТ используются в качестве контроля [3], что обусловило необходимость сбора лейкоцитов крови.

Для анализа вкДНК беременных используются различные молекулярно-генетические методы. Одним из наиболее успешных и перспективных методов является высокопроизводительное секвенирование [3]. Поэтому в 2017г в ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д. О. Отта" был начат сбор образцов крови беременных женщин, направленных на ИПД, с целью разработки технологии НИПТ хромосомных аномалий метолом высокопроизводительного секвенирования. Эти образцы составили основу представленной коллекции, которая сформирована из двух групп: образцы от женщин, беременных плодами с хромосомными аномалиями, и образцы беременных плодами без хромосомных патологий.

В 2019г на базе собранных образцов была выполнена апробация технологии НИПТ хромосомных аномалий на основе ионного полупроводникового секвенирования на приборе Ion GeneStudio S5 (Thermo Fisher Scientific Inc, США). Для этого был разработан оригинальный биоинформатический протокол оценки риска хромосомных патологий у плода. Были использованы аликвоты плазмы крови от 185 женщин с одноплодной беременностью. При исследовании 145 образцов анеуплоидий у плода обнаружено не было, что соответствовало результатами цитогенетического исследования. В 40 случаях были выявлены хромосомные аномалии. Все 40 анеуплоидий, обнаруженных с помощью НИПТ, соответствовали результатам ИПД [25][26].

С 2020г разработанный вариант НИПТ внедрён в клиническую практику ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д. О. Отта". На сегодняшний день этим методом протестировано >5000 образцов беременных женщин [27], что позволило значительно увеличить количество образцов с хромосомными аномалиями и расширить спектр патологий, входящих в коллекцию.

В 2022г на базе коллекции было проведено тестирование разработанного биоинформатического алгоритма НИПТ с использованием технологии высокопроизводительного секвенирования, предложенной китайской компанией MGI. Результаты апробации, представленные в настоящей работе, свидетельствуют об успешном тестировании протокола НИПТ для прибора DNBSEQ-G50 (MGI, Китай). С декабря прошлого года эта технология применяется в ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д. О. Отта", к настоящему времени проанализировано >1500 образцов плазмы крови беременных женщин.

Электронный каталог коллекции включает информацию о результатах раннего пренатального скрининга, что позволяет проводить дополнительные исследования. Так, на основе тестирования 4272 образцов коллекции исследована эффективность разработанного варианта НИПТ в клинической практике. Проведенные исследования показали, что прогностическая ценность НИПТ для трисомий по хромосомам 21, 18 и 13 значительно выше, чем у раннего пренатального скрининга, что соответствует данным других исследователей [27]. Показано, что предложенный вариант НИПТ позволяет с высокой точностью выявлять регулярные трисомии, анеуплоидии по половым хромосомам, а также "редкие находки" [27].

Преимуществом созданной коллекции является то, что для большинства образцов вкДНК проведено полногеномное секвенирование. Это открывает широкие возможности для научных исследований.

Исследования, проведенные на основе имеющейся геномной информации, показали, что в образцах плазмы крови беременной можно обнаружить фрагменты ДНК вирусов, способных негативно влиять на течение беременности, таких как Varicella zoster, Human betaherpesvirus 5 (CMV) и Human parvovirus B19 [26]. Также было показано, что во вкДНК содержится достаточное количество мтДНК для анализа последней. Продемонстрировано, что вкмтДНК в плазме крови беременных может быть использована для поиска нуклеотидных вариантов и определения гаплогрупп мтДНК. Показано, что уровень мтДНК в плазме крови может служить дополнительным маркером качества биообразцов, направляемых на НИПТ [10]³.

Особо перспективной представляется возможность поиска на базе коллекции ранних ДНК-маркеров осложнений гестации. Во-первых, большинство образцов получены проспективно до возникновения акушерских осложнений. Во-вторых, в процессе формирования коллекции собираются данные о течении беременности. При этом клиническая аннотация биообразцов содержит подробную информацию о фоновых и гинекологических заболеваниях, а также об особенностях течения настоящей беременности. Эта информация позволяет формировать стратифицированные группы беременных в зависимости от целей исследования.

В настоящее время на базе коллекции проводятся исследования, связанные с оценкой клинической значимости детекции ДНК-вирусов в крови беременной, разработкой подходов к выявлению микроперестроек, созданием неинвазивных методов пренатального скрининга моногенных заболеваний и хромосомных патологий на основе таргетного секвенирования, а также поиском ДНК-маркеров осложнений беременности.

Заключение

Созданная коллекция, а также ассоциированные с ней клинические и геномные данные являются ценным ресурсом для фундаментальных и прикладных исследований. Образцы коллекции были использованы для разработки оригинального варианта НИПТ. На собранном биоматериале показана высокая специфичность и чувствительность НИПТ как метода пренатальной ранней диагностики хромосомных патологий плода. В настоящей работе проведена успешная апробация разработанного алгоритма НИПТ на секвенаторе DNBSEQ-G50 (MGI, Китай). Исследования, проведенные на основе имеющейся геномной информации, показали, что в образцах плазмы крови беременной можно обнаружить фрагменты ДНК вирусов, также в них содержится достаточное количество мтДНК для анализа. Такие преимущества коллекции, как использование стандартизированных протоколов сбора, обработки и хранения биообразцов, ранний срок беременности при сборе биоматериала, наличие подробной клинической аннотации и результатов полногеномного секвенирования вкДНК, данных о кариотипировании материала плода и исходах беременности, позволяют проводить на ее основе широкий спектр молекулярно-генетических исследований в области акушерства и гинекологии.

Отношения и деятельность. Исследование выполнено в рамках ФНИ № 1021062812133-0-3.2.2 "Оптимизация методов предикции, профилактики и лечения "больших акушерских синдромов", а также стратегии родоразрешения у беременных из групп высокого риска, с целью улучшения акушерских и перинатальных исходов". Использованы образцы, депонированные в УНУ (уникальную научную установку) "Репродуктивное здоровье человека" (регистрационный номер USU_3076082).