Валидация шкал генетического риска развития сахарного диабета 2 типа на выборке населения регионов России из биобанка "НМИЦ ТПМ"

Введение

В 2019г сахарный диабет (СД) стал причиной ~2 млн смертей по всему миру. Более 95% от общего числа пациентов, страдающих СД, имеют СД 2 типа (СД2)¹. Кроме того, СД2 является фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний [1]. Данные о наследуемости СД2 сильно варьируются от 26 до 72% согласно различным близнецовым исследованиям [2][3].

За последние 20 лет, благодаря полногеномному поиску ассоциаций (genome-wide association studies — GWAS) показано, что большинство распространенных заболеваний человека объясняются не вариантами в одном гене, а большим количеством отдельных вариантов, распределенных по всему геному [4]. GWAS Catalog, база данных, агрегирующая информацию об исследованиях по полногеномному поиску ассоциаций, содержит информацию о 227 исследованиях, где одним из изучаемых признаков был СД2². На основании выявленных ассоциаций создаются шкалы генетического риска (ШГР), используемые для оценки генетической предрасположенности человека к определенному признаку или заболеванию. Значение ШГР для некоторого признака конкретного человека рассчитывается на основе генотипа человека и данных, полученных в GWAS для этого признака [5][6]. Для создания ШГР могут быть использованы данные GWAS, проведенного в рамках того же исследования [7] или выполненного ранее на другой выборке [8][9]. Число включенных в ШГР вариантов широко варьируется и может достигать нескольких млн³. Большинство ШГР объясняют лишь небольшую часть вариабельности признака, однако они являются устойчивой мерой генетической предрасположенности человека к заболеваниям, что привело к рутинному применению ШГР в биомедицинских исследованиях [5].

Для проведения валидации уже существующих ШГР необходимы выборки, включающие тысячи участников. Поэтому наиболее оптимальным является использование данных биобанков, содержащих информацию об изучаемом признаке. Примером может выступать коллекция данных биобанка Соединенного Королевства (UK Biobank) [8][10], которая позволяет проводить как повторные исследования, так и оценивать этнические особенности наследуемости заболевания или признака. На сегодняшний день в России такие исследования стали доступны благодаря развитию биобанков. В частности, в настоящей работе использованы данные биобанка ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России [11] — одного из наиболее крупных биобанков РФ, члена Национальной ассоциации биобанков и специалистов по биобанкированию (НАСБИО) [12].

К настоящему времени созданы десятки ШГР СД2 [13]. В рамках ряда исследований было продемонстрировано, что при применении моделей оценки риска возникает необходимость принимать во внимание популяционный эффект даже для лиц из разных европейских популяций одинаковой этнической принадлежности [4][14][15]. Генетическая структура российской и европейской популяции различается еще более существенно [16][17]. Кроме того, популяционные исследования, проведенные на выборках регионов европейской части России, показали достоверные отличия в аллельных частотах некоторых клинически значимых вариантов нуклеотидной последовательности (ВНП) от данных, полученных на европейской популяции (non-Finnish Europeans) [18][19].

Целью настоящей работы: провести валидацию и оценить точность 14 шкал ШГР СД2, созданных ранее в других странах, на выборке населения регионов России из биобанка ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России.

Материал и методы

Выборка

В исследование была включена подвыборка из репрезентативной выборки населения Вологодской области (n=707) из исследования "Эпидемиология сердечно-сосудистых заболеваний и их факторов риска в регионах Российской Федерации" (ЭССЕ-Вологда) [20] и 460 пациентов, чья кровь была биобанкирована в Биобанке ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России, общая выборка составила 1167 участников, доля мужчин в выборке — 48,8%. Общая характеристика выборки представлена в таблице 1. В рамках исследования ЭССЕ-РФ проводился опрос по стандартному вопроснику, разработанному на основе адаптированных международных методик и включающему информацию о поведенческих привычках, анамнестических данных и т.д. [20]. Диагноз СД2 ставился при наличии хотя бы одного из следующих критериев: уровень глюкозы натощак >7 ммоль/л; положительный ответ на вопрос: "Говорил ли Вам когда-нибудь врач, что у Вас имеется/имелся сахарный диабет 2 типа?"; прием гипогликемической терапии. В общей выборке в анализ включены возраст, пол, уровень глюкозы натощак (ммоль/л) и/или диагноз СД2, и/или сахароснижающая терапия. Показатель, "диагноз СД2" был доступен для обеих выборок, а показатели "уровень глюкозы натощак (ммоль/л)" и "прием гипогликемической терапии" — только для ЭССЕ-Вологда (n=703). Количество участников с СД2 (поставленный диагноз или уровень глюкозы >7 ммоль/л) составило 286 из 1167. Обе выборки являются коллекцией биобанка ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России [11]. Исследование одобрено Независимым Этическим Комитетом ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России. Все участники дали письменное информированное согласие.

Выбор ШГР

В исследование были включены 14 ШГР [8][9][21-32], которые были доступны на момент начала исследования в 2021г, рассчитанные для европейской популяции (non-Finnish Europeans) [13]. Исходные данные по всем 14 ШГР были подробно описаны ранее [13].

Генетический анализ

Геномная дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) из образцов цельной крови была выделена с помощью набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Германия). Концентрацию ДНК определяли на флуориметре Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, США) или спектрофотометре NanoDrop OneC (Thermo Fisher Scientific, США). Секвенирование следующего поколения (NGS — next-generation sequencing) с использованием таргетной панели, включавшей 14 ШГР СД2, было проведено для всех участников исследования. Библиотеки, приготовленные с помощью SeqCap EZ Prime Choice Library (Roche, Швейцария), были отсеквенированы на приборе NextSeq 550 (Illumina, США). Все этапы NGS были выполнены в соответствии с протоколами производителей.

Биоинформатический анализ

Парноконцевые прочтения были получены в формате fastq и выровнены на референсный геном GRCh38. Дальнейшая обработка данных и оценка контроля качества были выполнены на основе ранее разработанного пайплайна [19] на базе GATK 3.8 [33]. ШГР были вычислены для генотипов каждого образца путем суммирования эффектов каждого ВНП из оригинальных исследований с учетом количества копий аллеля.

Статистический анализ

Для статистического анализа использовались библиотеки base, stats, dplyr и pROC языка R v. 4.1⁴. Непрерывные признаки описаны медианой и интерквартильным размахом Me [Q25; Q75]. Сравнение непрерывных параметров в независимых выборках выполнено с помощью критерия Манна-Уитни. Анализ ассоциаций ШГР с СД2 проведен при помощи логистической регрессии с поправкой на пол и возраст. В качестве метрики качества для моделей регрессии использована площадь под ROC-кривой (AUC). Уровень статистической значимости принят равным 0,05.

Результаты

Сила ассоциации между включенными в анализ ШГР и наличием СД2 оценена при помощи AUC, которые представлены в таблице 2. AUC для регрессии СД2 на пол и возраст без добавления ШГР составила 77,12%. AUC является стандартной метрикой качества и используется для определения общей производительности модели, благодаря чему можно сравнить результаты данной работы с полученными в исходных исследованиях. В таблице 2 приведены данные по количеству ВНП, включенных в каждую из 14 ШГР, а также количество ВНП, которое было использовано в данном исследовании. Кроме того, приведены данные AUC из оригинальных исследований, при условии их наличия. Результаты анализ AUC приведены и для ШГР, и для моделей, включающих ШГР, пол и возраст).

Из 14 ШГР, включенных в исследование, только две не показали достоверно значимых результатов на российской выборке [25][30]. Наиболее высокий результат получен для ШГР Langenberg C, et al. (2014) [24] (49 ВНП), Liu SY, et al. (2015) [26] (39 ВНП) и Qi Q, et al. (2017) [29] (80 ВНП). Добавление к этим ШГР общепринятых факторов риска (пол, возраст) значимо увеличивало AUC c 59,05 до 78,75% (p<0,001), c 59,25 до 78,56% (p<0,001), c 59,46 до 78,41% (p<0,001), соответственно. AUC только для ШГР варьировался от 54,49 [23] до 59,46% [29], а AUC для моделей, включающих ШГР, пол и возраст — от 77,56 [23] до 78,75% [24].

К сожалению, данные AUC только для ШГР были указаны лишь в двух оригинальных работах [22][27], а для моделей с включением ШГР, пола и возраста — в трех [8][9][21], что не позволило провести полноценное сравнение между исследованиями.

Обсуждение

В рамках настоящего исследования впервые проведена валидация на российской популяции 14 ШГР СД2, рассчитанных на выборках европейского происхождения и включавших от 296 до 303 053 участников и от 12 до 80 ВНП [8][9][21-32]. Включение лишь небольших по размеру ШГР объясняется тем, что в качестве метода генотипирования использовалось NGS с помощью таргетной панели отдельных участков генома, а не полногеномное секвенирование или высокоплотные микрочипы.

Невозможность валидации ШГР, включавших сотни тысяч и миллионы ВНП, была одним из ограничений этого исследования. Так, например, ШГР из 136795 ВНП была разработана в GWAS Mahajan A, et al. (2018) [10] на выборке UK Biobank (n=441894). C-статистика (аналог AUC) составила 66%, а доля объясненной вариабельности СД2 — 18% [10]. В другой работе, выполненной Khera A, et al. (2018) (n=288978), на основе GWAS [34] была создана ШГР из 6 млн ВНП, объясняющая 2,9% вариабельности СД2 [35]. В этих исследованиях использовался обобщенный коэффициент детерминации. Этот коэффициент в настоящем исследовании не оценивался, т.к. его сложно интерпретировать и сравнивать между исследованиями [5].

Пять ШГР из 6 исследований [8][9][21][24][27][31], включенных в настоящее исследование, были построены на GWAS Morris AP, et al. (2012) [36]. ШГР, созданная на основе этого GWAS в работе Vassy JL, et al. (2014), включала 62 ВНП, AUC для моделей с включением ШГР, пола и возраста составила 72,6% [9]. В настоящем исследовании добавление ШГР к факторам риска (пол, возраст) значимо увеличивало AUC c 77,12 до 78,64% (p=0,009). Эта же шкала была использована в работе Walford GA, et al. (2014), где AUC для модели, включающей только ШГР, составила 64,1% [21]. Кроме того, еще в двух других исследованиях, в которых были разработаны ШГР на основе GWAS [34], были предоставлены данные по AUC: в исследовании Talmud PJ, et al. (2015) AUC для модели, включающей только ШГР (65 ВНП), составила 60,2% [27], в работе Chen X, et al. (2021) AUC для модели с включением ШГР (60 ВНП), пола и возраста составила 68,1% [8].

Из 14 ШГР, разработанных на европейской популяции, 12 продемонстрировали достоверно значимые результаты на российской выборке. Одним из возможных объяснений отсутствия значимых результатов для двух ШГР является то, что их конструирование проводилось с нарушениями принятой методологии, описанной в работе Choi SW, et al. (2020) [5]. Эти результаты подчеркивают, что воспроизводимы только те ШГР, которые построены при помощи методов статистики, специфических для данной области количественной генетики.

В первой работе с нарушенной методикой, выполненной Klimentidis YC, et al. (2015), изучалась ассоциация генетического риска для повышенного уровня триглицеридов (ТГ) в плазме со случаями СД2 [25]. В частности, ассоциация ШГР для ТГ с СД2 подменена на ассоциацию взаимодействия ШГР для ТГ и СД2 при регрессии на ТГ. Во второй работе Liu T, et al. (2018) разработана ШГР из 12 ВНП, ассоциированных с процентным содержанием жира в организме [30]. В работе игнорировалась поправка на множественные сравнения и использовались невзвешенные ШГР.

Таким образом, представляется крайне важным обязательная валидация на выборках российских пациентов для ШГР, разработанных в других популяциях. При этом важно подчеркнуть, что проведение таких валидаций невозможно без использования данных о пациентах и их биообразцов из коллекций российских биобанков. Проведение настоящего исследования стало возможным благодаря коллекциям биобанка ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России [11], содержащих информацию о наличии заболевания СД2, уровне глюкозы натощак и приеме сахароснижающей терапии.

Заключение

Впервые в России было проведено исследование 14 ШГР СД2, разработанных на других популяциях; 12 ШГР прошли валидацию и в будущем могут быть применены для улучшения прогнозирования риска развития и профилактики СД2 в России. Таким образом, Российские биобанки играют очень важную роль в валидации таких ШГР.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.