Анализ возможности применения результатов секвенирования транскриптома при выборе лекарственной терапии пациентов с колоректальным раком

Введение

Анализ мультиомных данных по измерению активности генов, экспрессии белков или изменениям метаболома становится стандартным подходом к характеристике патологического состояния пораженного организма или ткани. Все чаще некоторые из этих методов применяются в комбинированном подходе, что приводит к получению больших наборов многопрофильных данных [1][2]. Тем не менее, проблема выявления основных молекулярных механизмов, отличающих данное патологическое состояние от нормы, остается открытой. Механизм развития болезни может быть описан посредством построения моделей перестройки клеточных регуляторных путей, например, в результате генетических или эпигенетических изменений, влияющих на активность соответствующих генов. Реконструкция специфических для заболевания регуляторных путей может помочь идентифицировать потенциальные мастер-регуляторы (МР) соответствующего патологического процесса, что в свою очередь открывает возможности для разработки новых подходов к лечению. В настоящее время набирает популярность гипотеза о том, что воздействие на определенные МР может остановить патологический процесс и устранить причину заболевания [3].

Традиционные биоинформационные подходы, применяемые для анализа мультиомных данных, дают лишь очень ограниченное представление о причинах наблюдаемых явлений и поэтому мало способствуют пониманию молекулярных механизмов паталогического процесса. В транскриптомных исследованиях такого рода, как правило, только выявляются дифференциально экспрессирующиеся гены (ДЭГ), но вся цепь молекулярных событий, приведших к дифференциальной экспрессии, остаётся невыясненной [4]. В противоположность этому, применяемый нами метод был разработан для интерпретации данных, связанных с этиологией патологического состояния. Этот подход дополняет классический анализ ДЭГ и включает в себя два основных этапа:

1) анализ промоторов и энхансеров ДЭГ на предмет выявления факторов транскрипции, участвующих в их регуляции и, таким образом, важных для изучаемого процесса;

2) реконструкция сигнальных путей, которые активируют эти факторы транскрипции, и идентификация МР на вершине таких путей.

Результаты, полученные после реконструкции сигнальных путей, используют в поиске лекарственных препаратов (ЛП), пригодных для ингибирования (или активации) идентифицированных молекулярных мишеней в контексте изучаемого заболевания. Поиск осуществляется в базах данных уже известных ЛП. Это, так называемое повторное открытие лекарств (drug repurposing), — новая парадигма в фармакологии с целью преодоления кризиса, связанного с дороговизной и недостаточной эффективностью создания нового ЛП к каждой отдельной клеточной мишени [5]. Этот шаг выполняется с использованием информации из базы данных HumanPSD™ (The Human Proteome Survey Database), а также базы данных спектров биологической активности 2245 химических соединений, рассчитанных с помощью программы PASS (Prediction Activity Structure Substances) на основе подхода (Q)SAR (Quantitative Structure-Activity Relationship).

Описанный целостный подход позволяет в конце концов получить способ воздействия на весь набор патологически изменённых регуляторных путей в клетке, находящихся под контролем определённых МР. В настоящий момент за рубежом уже выполнено несколько исследований такого рода [5-7].

Целью настоящей работы является анализ применимости данных РНК (рибонуклеиновая кислота)-секвенирования с последующим выявлением МР для предсказания эффективности таргетной терапии у российских пациентов с колоректальным раком.

Материал и методы

В настоящем исследовании использовали образцы ткани трех пациентов с колоректальным раком, полученные из послеоперационного материала. Характеристика пациентов представлена в таблице 1. Все пациенты подписали информированное добровольное согласие на участие в исследовании. Форма информированного согласия и иные документы в рамках данного научно-исследовательского проекта были одобрены на заседании № 119 Экспертного совета по этике СПб ГБУЗ "Городская больница № 40" 9 февраля 2017г.

Все пациенты на момент включения в исследование имели метастатическую стадию заболевания и получали стандартные схемы противоопухолевой терапии в зависимости от локализации опухоли и статуса мутаций в генах RAS и BRAF. Пациент 1 с левосторонней локализацией опухоли и генами RAS и BRAF дикого типа получил 3 линии терапии. В 1 линии проведена химиотерапия по схеме mFOLFOX6¹, в комбинации с панитумумабом, во второй mFOLFOX6 в сочетании с бевацизумабом, в 3 линии FOLFIRI² с рамуцирумабом. Второй пациент в связи с правосторонней локализацией опухоли в 1 линии получил комбинацию mFOLFOX6 с бевацизумабом, во 2 линии FOLFIRI c рамуцирумабом. У пациента 3 была выявлена мутация гена KRAS, в связи с чем в 1 линии применялась схема mFOLFOX6 c бевацизумабом, во 2 линии так же mFOLFOX6 c бевацизумабом, в 3 линии FOLFIRI с афлиберцептом, в 4 линии регорафениб и в 5 линии FOLFIRI с афлиберцептом. Для каждого пациента был проведен анализ как опухолевой, так и здоровой ткани. Из образцов была выделена РНК методом фенол-хлороформной экстракции и проведено секвенирование транскриптома c использованием реагентов KAPA mRNA HyperPrep Kit (Roche) на секвенаторе MiSeq (Illumina). Прочтения, полученные в ходе севенирования, прошли контроль качества в программе FastQC³. Далее прочтения были выровнены на референсный геном человека версии hg38 с помощью программы bowtie [8]. Подсчет прочтений, относящихся к конкретным генам, выполнен пакетом featureCounts [9]. Выявление ДЭГ и поиск МР, а также составление схем метаболических сетей и МР проведены с помощью собственных алгоритмов geneXplain⁴. Дополнительно был выполнен анализ промоторов и энхансеров ДЭГ на предмет выявления факторов транскрипции, участвующих в их регуляции, с использованием базы данных TRANSFAC^® совместно с алгоритмами идентификации сайтов связывания TF Match и CMA (Composite Module Analyst). Реконструкция сигнальных путей, активируемых найденными факторами транскрипции, а также идентификация МР проведена с применением базы данных по передаче сигналов TRANSPATH^® и специальных алгоритмов поиска графов, реализованных в программном обеспечении "Genome Enhancer".

Результаты

Для всех образцов ткани были получены результаты РНК-секвенирования, в ходе анализа которых были обнаружены ДЭГ и мутации в нескольких генах, важных для назначения ЛП. Так, для пациента 2 выявлены мутации в гене BRCA2, а для пациента 3 — мутации в генах BRCA2, P53 и KRAS.

Поскольку пациент 3 имел наибольшую продолжительность жизни после начала лечения (таблица 1), представляло интерес более подробно исследовать образцы его опухолевой ткани. В валике опухоли обнаружена KRAS-мутация (p.G12S c.34G>A), в то время как в центре она отсутствует. Мутации гена BRCA1 (p.K1183R c.3548A>G и p.1136R c.3667A>G) присутствуют в здоровой ткани, но не выявлены в опухолевой. Экспрессия гена RNF43 отсутствует в здоровой ткани и в валике, но присутствует в центре опухоли, что может указывать на герминальную природу мутации. Проведенное сравнение профилей экспрессии в центре и валиках опухоли пациента 3 показало высокую корреляцию, свидетельствующую о том, что это одна и та же опухоль, с ~4000 общими генами, находящимися в состоянии повышенной экспрессии. Тем не менее, наблюдается некоторая гетерогенность: в каждой части опухоли экспрессируются ~1000 уникальных генов, в основном некодирующих РНК. В частности, для валика опухоли характерна повышенная экспрессия генов IRAK1, PELE1, IRF1, MYD88, AKR1C4 и E2F7. В центре опухоли обнаружены следующие сверхэкспрессированные гены: DHFR, DCK, POLR3G, STAT1, IL10RB и MAP3K1.

На основании анализа ДЭГ были найдены МР, приведенные в таблице 2. Выявленные изменённые метаболические пути для каждого пациента представлены на рисунках 1-3 Приложения. Полученные МР были проранжированы в соответствии с их расчетным вкладом в нарушения экспрессии генов в опухолевой ткани. Ранжирование проводилось согласно оценке значимости транскрипционного фактора, рассчитываемого внутренними алгоритмами geneXplain для выявления уровня регуляции, на котором действует фактор. Основываясь на этом списке, алгоритм также подобрал наиболее подходящие ЛП, в случае пациентов 1 и 2, отличающиеся от назначенных в клинике. Это регорафениб, целекоксиб, трастузумаб и бевацизумаб для пациента 1, регорафениб и ларотректиниб для пациента 2. В случае пациента 3 расчеты показали, что основное лечение было назначено верно, но его можно было бы дополнить препаратами олапариб, целекоксиб и куркумин.

Обсуждение

Согласно исследованиям, непрерывная активация каскада рецептора эпидермального фактора роста (кодируемого геном EGFR) является одной из основных причин образования опухолей [10]. Причиной подобного события могут быть значительное увеличение количества рецепторов на мембране клетки, мутации в структуре самого рецептора, приводящие к активации в отсутствие лиганда, или мутации в молекулах других участников каскада, способных привести к его запуску независимо от статуса EGFR. Гены BRAF, KRAS и NRAS являются непосредственными участниками RAS-каскада. Мутации в этих генах ассоциированы с колоректальным раком и являются биомаркерами, позволяющими оценить прогноз заболевания и перспективы использование таргетных ЛП. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)-тест на выявление этих мутаций является неотъемлемой частью комплекса исследований опухолевой ткани, т.к. определенные варианты генотипов напрямую влияют на выбор и эффективность ЛП, используемых в противоопухолевой терапии [11].

У пациентов 1 и 2 не было выявлено мутаций в генах RAS-каскада, что, как правило, является положительным прогностическим признаком. Больным с подобной генетической картиной обычным назначением являются препараты, влияющие на фактор роста эндотелия сосудов VEGF (vascular endothelial growth factor) или его рецепторы [12]. В дополнение к стандартному курсу химиотерапии, в т.ч. с иринотеканом, этим двум пациентам добавлен бевацизумаб или рамуцирумаб. Бевацизумаб, селективно связывается с VEGFA и блокирует его связывание с рецепторами, замедляя, тем самым, рост и темпы васкуляризации опухоли [13]. Рамуцирумаб ингибирует рецептор VEGFR2 и не позволяет связываться с ним его лигандам: VEGFA, VEGFC и VEGFD. Таким образом, нейтрализуется их способность к активации пролиферации через каскад протеинкиназ p44/p42. Иринотекан ингибирует фермент топоизомеразу 1, участвующий в синтезе дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) [14].

Несмотря на позитивный прогноз, в обоих случаях лечение дало только временный эффект стабилизации и частичного регресса опухоли с последующим прогрессированием и летальным исходом. Согласно нашим результатам, у пациента 1 были более приоритетные лекарственные мишени, и персонализированный подбор препаратов на основании анализа ДЭГ и МР теоретически мог бы повысить эффективность противоопухолевой терапии. В список возможных терапевтических мишеней вошли белки, кодируемые генами EGF, EGFR, ERBB2, SRC, mTOR и PDK1 (таблица 2). VEGFA же, на который была нацелена таргетная терапия, находится только на 71-м месте в ранжированном списке МР, что указывает на его второстепенную роль в патогенезе аденокарциномы кишечника у пациента 1. В связи с этим схема лечения могла бы быть иной и более эффективной. Препаратами выбора могли бы стать регорафениб, являющийся ингибитором широкого спектра протеинкиназ, участвующих в ангиогенезе опухоли [14], целекоксиб, специфично блокирующий циклооксигеназу-2 [15], и трастузумаб, взаимодействующий с внеклеточным доменом рецептора 2 эпидермального фактора роста человека ERBB2 [16]. Эту терапию можно было бы дополнить бевацизумабом, что, вероятно, улучшило бы результаты лечения и обеспечило бы более долгосрочную стабилизацию состояния.

Перейдем к пациенту 2, который получал аналогичное лечение. Изначально у пациента наблюдалась стабилизация состояния, однако вскоре последовало прогрессирование, сопровождавшееся метастазированием в легкие и печень, что в конечном итоге привело к летальному исходу. Использование бевацизумаба и рамуцирумаба могло быть неэффективным, поскольку их мишени не попадают в спектр МР данной опухоли. Вместо этого более значимыми целями для лечения могли бы быть такие молекулы, как с-MET и NTRK2. Последний, хотя обычно экспрессируется в мозге, иногда может быть активен в опухолях⁵. В данном случае наиболее перспективными препаратами являются регорафениб — пероральный мультикиназный ингибитор, в т.ч. специфичный к PDGFRA [14], и ларотректиниб, который был одобрен к применению при колоректальном раке в 2020г [17].

Рассмотрим пациента 3, у которого изначально присутствовали метастазы в легких и печени. Пациенту были назначены стандартные схемы химиотерапии в сочетании с анти-VEGF терапией бевацизумабом и далее афлиберцептом. В результате лечения наблюдался частичный регресс опухоли. Продолжительность жизни пациента, несмотря на наличие мутации в гене KRAS составила 51 мес.

В данном случае видим, что наличие МР VEGFA (таблица 2) сыграло ключевую роль, т.к. бевацизумаб, нацеленный на этот фактор, оказал положительное влияние на лечение. Тем не менее, согласно списку найденных МР, VEGFA занимает 23-е место по значимости, что указывает на то, что назначенный бевацизумаб не покрывает все возможные терапевтические мишени, что могло обусловить лишь частичный эффект противоопухолевой терапии.

Согласно расчетам, одной из наиболее эффективных мишеней является ген PDPK1, и для блокировки кодируемого им белка применяют препарат целекоксиб [15]. Еще одной интересной мишенью является продукт гена GSK3B, который, хотя и известен как негативный биомаркер колоректального рака, обычно связан с другими типами рака, например, с раком легких [18].

Помимо поиска МР одним из важных этапов подбора таргетной терапии является анализ мутаций. Мы можем использовать имеющиеся данные РНК-секвенирования для поиска вариантов и анализа генетической гетерогенности опухоли. Хотя транскриптомный метод менее точен, чем геномный, он подходит для поставленной задачи. Исследование этим методом опухолевого материала пациента 3 выявило мутации в генах BRCA2, P53 и KRAS. Причём оказалось, что опухоль в значительной степени гетерогенна. Обнаруженная в валике опухоли, но не в центре KRAS-мутация (p.G12S c.34G>A) может объяснить частичный регресс опухоли при наличии мутантного статуса, что указывает на возможность лечения с использованием ингибиторов EGFR [14]. Наличие мутации BRCA2 (p.V2466A c.7397C>T) является показанием к использованию препарата олапариба, приводящего к задержке прогрессирования опухоли в организмах с дефицитом BRCA [16].

Гетерогенность опухоли проявилась и при анализе экспрессии в разных частях опухоли. Так, для валика опухоли характерна повышенная экспрессия генов, которые участвуют в сигнальных путях (IL-1, TLR9) и метаболизме белков (IRAK1, PELE1, IRF1, MYD88, AKR1C4 и E2F7) [19, 20]. Обнаруженные в центре опухоли сверхэкспрессированные гены вовлечены в сигнальные пути (IL-10, MAPK1/MAPK3) и метаболизм нуклеиновых кислот (DHFR, DCK, POLR3G, STAT1, IL10RB и MAP3K1) [21]. Путь HIF-1α (Hypoxia-inducible factor 1-alpha, фактор, индуцируемый гипоксией 1-альфа,) активируется при дефиците кислорода, типичен для центра солидных опухолей и запускает VEGF-сигнализацию [21]. В целом, HIF-1α участвует в регуляции активности широкого спектра генов, задействованных в канцерогенезе [22], причем из-за особенностей оксигенации в центре опухоли и на периферии могут быть задействованы разные сигнальные пути.

На основании всех данных можно сделать вывод, что мишень VEGFA существует, и препарат бевацизумаб может быть применен, хотя он не является наиболее приоритетным, т.к. его значимость невысока. В качестве альтернативы используется афлиберцепт, который в последующем был назначен пациенту.

Итак, сочетание лечения с использованием бевацизумаба (или афлиберцепта) и куркумина представляется оптимальным вариантом, учитывая наличие мишеней VEGF и GSK3B.

Заключение

В результате настоящего исследования для каждого из трех пациентов был выявлен список МР, ранжированных относительно своей пригодности в качестве терапевтической цели на основе оценки влияния на экспрессию подконтрольных ДЭГ. Для пациентов 1 и 2 было показано, что, согласно нашим расчетам, выбранная таргетная терапия не была эффективной, поскольку при стандартной диагностике могли быть упущены индивидуальные особенности молекулярных путей, снижающие или полностью сводящие на нет действие некоторых лекарственных средств. У пациента 3 частично совпали спрогнозированные и примененные препараты, что, предположительно, и стало причиной последующей частичной ремиссии.

Таким образом, была проанализирована возможность применения данных по РНК-секвенированию с последующим выявлением ДЭГ и генов МР для предсказания эффективности терапии пациентов с аденокарциномой кишечника. В дальнейшем необходимы клинические исследования эффективности назначения лекарственной терапии на основе комплексного анализа МР.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.