Факторы преаналитического этапа, влияющие на уровни циркулирующих микроРНК плазмы и сыворотки крови

Введение

Микрорибонуклеиновые кислоты (микроРНК) — это короткие, одноцепочечные, некодирующие РНК длиной 18-25 нуклеотидов, которые функционируют как посттранскрипционные регуляторы экспрессии генов [1][2]. Внеклеточные микроРНК присутствуют в биологических жидкостях организма, в т.ч. в плазме и сыворотке крови [3]. В кровотоке внеклеточные микроРНК защищены от деградации, поскольку они включены в микровезикулы или экзосомы, связаны с липопротеинами высокой плотности или комплексом AGO2 (семейство белков Argonaute) [4][5].

Относительно высокая стабильность микроРНК в биологических жидкостях (например, плазме, сыворотке, моче, слюне), малоинвазивность процедуры взятия крови, быстрое высвобождение из межклеточной жидкости в кровоток при развитии патологии, а также возможность классифицировать особенности течения заболевания, его стадию, степень тяжести и другие клинические особенности с помощью профилей экспрессии микроРНК, обусловили повышенный интерес к оценке целесообразности их применения в качестве малоинвазивных биомаркеров для диагностики широкого спектра заболеваний [6-8]. Однако использование циркулирующих микроРНК в качестве биомаркеров в клинической практике требует высокочувствительных, воспроизводимых, надежных и устойчивых методов, позволяющих проводить их точную количественную оценку в плазме и сыворотке крови [8][9].

Преаналитические условия остаются основными искажающими факторами в исследованиях микроРНК [10]. Преаналитическая фаза исследований, проводимых с использованием биообразцов, включает их сбор, обработку, хранение и транспортировку. Все этапы могут существенно влиять на биологическую и химическую сохранность образцов и играют важную роль в надежности и воспроизводимости количественной оценки циркулирующих микроРНК [6][10]. Однако в настоящее время консенсус по методологическим параметрам, используемым при исследовании уровней экспрессии циркулирующих микроРНК, отсутствует [8].

В обзоре Van Der Schueren C, et al. (2024) была проанализирована частота упоминания преаналитических переменных в исследованиях РНК плазмы и было выявлено, что из 22 преаналитических переменных, входящих в три влияющие на анализ категории (забор крови, приготовление плазмы и выделение РНК), только три были указаны достаточно информативно более чем в половине работ (200 исследованиях 2018г и 2023г): проводилась ли очистка РНК, метод очистки и использованная фракция плазмы [11]. Процент представленных переменных варьировался от 4,6 до 54,6% (среднее значение 24,84%) в 2023г и от 4,6 до 57,1% (среднее значение 28,60%) в 2018г, что свидетельствует о недостаточности информации о преаналитических переменных в публикациях результатов исследований внеклеточных РНК [11].

Отсутствие воспроизводимости между исследованиями [9][12] свидетельствует о том, что для получения достоверных результатов необходимо следовать рекомендациям по повышению стабильности и воспроизводимости количественного определения циркулирующей микроРНК [13], учитывать влияние таких параметров, как дизайн исследования и анализ данных [14], преаналитические условия [15] и методика профилирования микроРНК [6][16][17], поскольку каждый отдельный шаг в методологической процедуре может потенциально иметь большое влияние на обнаружение микроРНК [18].

Цель обзора — рассмотрение основных современных оригинальных исследований, посвященных изучению преаналитических параметров на этапах от взятия крови до получения плазмы или сыворотки.

Методологические подходы

Поиск литературных источников проводился по заголовкам, аннотациям и ключевым словам в системах индексирования научных публикаций (Google Scholar, PubMed, eLIBRARY) с использованием следующих запросов: "serum+microRNA"/ "сыворотка+микроРНК" и "plasma+microRNA"/ "плазма+микроРНК" с добавлением дополнительных переменных "preanalytical"/"pre-analytical"/"преаналитический", "storage"/"хранение", "processing"/ "обработка", "centrifugation"/"центрифугирование", "anticoagulant"/"антикоагулянт". Глубина поиска составила 15 лет. В обзор были включены только оригинальные методические исследования тотальной циркулирующей микроРНК.

Результаты

Преаналитические факторы. Несмотря на растущее внимание к циркулирующим микроРНК, особенно полученным из плазмы или сыворотки крови, как к перспективным кандидатам на роль биомаркеров для выявление различных патологических состояний, их использование в клинических условиях затруднено. Различные факторы влияют на уровни микроРНК по отдельности или в сочетании, например, тип антикоагулянта крови, содержание тромбоцитов, степень гемолиза, а также процедурные различия, например, время и условия хранения крови, плазмы и сыворотки, протокол центрифугирования и способ выделения микроРНК [8].

В обзор были включено 21 методологическое исследование, направленное на изучение следующих преаналитических факторов: сбор, обработка, хранение, транспортировка биообразцов (таблица 1). Из всех включенных в обзор исследований, большинство посвящены анализу только плазмы (n=14), в остальных изучали и плазму, и сыворотку.

Среди методов анализа микроРНК в анализируемых работах преобладала количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени с обратной транскрипцией (кПЦР) (n=16) или цифровая капельная ПЦР [9], в одной из них помимо кПЦР использовалось секвенирование микроРНК [32]. В остальных применялся анализ с помощью микрочипов (n=2) [24][34], секвенирование РНК (n=1) [33] и малых РНК (n=1) [31].

Ограничением большинства исследований является небольшой размер выборки. Только в 4 исследованиях размер выборки превышал 20 образцов [9][19][23][31], из них >100 образцов было только в одном [23]. В двух исследованиях все образцы для отдельных экспериментов были получены от одного донора [9][27].

Многие исследования были не лишены недостатков в описании преаналитических факторов. Например, в одной работе [23] не указан набор для выделения микроРНК и протокол центрифугирования, а в другой не описано, как была выполнена нормализация данных кПЦР [28].

При проведении статистического анализа в области количественной генетики необходимо применение поправки на множественные сравнения [35], отсутствие которой приводит как к завышению уровня значимости, так и нахождению большого числа ложных ассоциаций. Из 21 рассматриваемой работы поправка на множественные сравнения была упомянута в 7 [8][20][29-32][34].

Сбор биообразцов. В ходе многочисленных исследований было показано, что уровни ряда микроРНК в плазме и сыворотке значимо различаются. Так, сравнительный анализ 985 микроРНК, показал, что уровень 249 микроРНК был значимо выше в сыворотке, а 50 — в плазме [34]. В отсутствие сопоставимых результатов важно использовать один тип образцов последовательно на протяжении всего исследования [1].

В работе Binderup HG, et al. (2018) проводили последовательный забор 30 образцов крови у одного донора с помощью одной венепункции. При сравнении средних уровней микроРНК в первых и последних 10 пробирках, вне зависимости от способа нормализации, статистически значимых различий не выявлено [9].

Chan S-F, et al. (2023) оценили уровень гемоглобина, а также относительный уровень эритроцитарных и тромбоцитарных микроРНК в плазме после центрифугирования, при использовании для забора крови пробирок разного объема (6 и 10 мл) и не выявили значимых различий [10].

Неправильная обработка крови может привести к загрязнению клеточным материалом, в т.ч. в результате гемолиза, активации или присутствия тромбоцитов, и изменениям в профиле микроРНК, которые не связаны с патологическими состояниями [10][21]. Влияние гемолиза эритроцитов на микроРНК плазмы и сыворотки изучалось в ряде работ [15][19][21][30]. Было показано, что в зависимости от уровня гемолиза в образце вызванные им изменения затрагивают до 65% (88/136) детектированных микроРНК плазмы [21]. Были проведены исследования по изучению связи использованных антикоагулянтов и пробирок разных производителей [27][28][31][32], а также времени и условий хранения крови [8, 10, 34] с гемолизом.

Большинство исследований по изучению влияния этапа забора крови на циркулирующие микроРНК плазмы касаются используемых антикоагулянтов (таблица 2).

Пробирки, содержащие антикоагулянты на основе этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и цитрата натрия, были включены во все сравнительные исследования, направленные на изучение влияния антикоагулянтов. Литий-гепарин [24][25], ACD-B (citric acid, trisodium citrate, dextrose; лимонная кислота, тринатрийцитрат, декстроза) [24][32], CTAD (citrate-theophylline-adenosine-dipyridamole; цитрат натрия, теофиллин, аденозин и дипиридамол) [30][32] были включены в два исследования каждый.

В плазме, полученной с использованием литий-гепарина, исследуемые микроРНК не были детектированы в обеих работах [24][25]. Glinge C, et al. (2017) не обнаружили значимых различий в уровнях исследуемых микроРНК в плазме, полученной с другими антикоагулянтами [25], а в работе Basso D, et al. (2017) микроРНК, выделенная из плазмы с другими антикоагулянтами, была оценена как высококачественная [24].

Mussbacher M, et al. (2020) обнаружили значимое повышение уровней микроРНК в ЭДТА-плазме и усиление этого эффекта со временем при хранении при комнатной температуре (КТ) [30]. В рекомендациях этого исследования CTAD указан как предпочтительный антикоагулянт [30]. Zhelankin AV, et al. (2022) выявили различия в микроРНК профилях образцов плазмы, полученных с использованием калиевой соли ЭДТА (K₂ЭДТА), и полученных с использованием других включенных в исследование антикоагулянтов, и предположили, что это связано в повышенным уровнем гемолиза в образцах с ЭДТА [32]. Suzuki K, et al. (2022) обнаружили повышенный уровень эритроцитарных микроРНК, в образцах, полученных с использованием цитрата натрия и фторида натрия, и отдают предпочтение ЭДТА в качестве антикоагулянта [31].

Кроме того, в одном из исследований использовали 2 типа пробирок с K₂ЭДТА в качестве антикоагулянта: с разделительным гелем и без него. При немедленной заморозке плазмы на -80^о C, количество обнаруженных микроРНК в плазме, собранной в пробирки без разделительного геля, было значительно меньше (96) по сравнению с плазмой в пробирках с разделительным гелем (161) [29].

В двух исследованиях [27][28] проводилось сравнение использования пробирок для долгосрочного хранения крови, разработанных для предотвращения лизиса клеток и увеличения продолжительности хранения плазмы для анализа микроРНК. Более низкие уровни гемолиза были детектированы в образцах в Cell-Free DNA BCT (Streck) пробирках по сравнению с пробирками, содержащими ЭДТА, — гемолиз в них не был детектирован до 7 дня, тогда как в образцах с ЭДТА гемолиз был обнаружен в течение часа [27]. В исследовании Ward Gahlawat A, et al. (2019) в образцах плазмы, полученных из крови, хранившейся в пробирках Cell-Free DNA BCT (Streck) значимое повышение уровня гемолиза, оцененного с помощью микроРНК miR-451a было детектировано после 5 дней хранения, в пробирках Cell-Free DNA Collection Tube (Roche Diagnostics) — после 7 дней, в пробирках PAXgene Blood ccfDNA Tube (PreAnalytiX) и cf-DNA/cf-RNA Preservative tubes (Norgen Biotek Corp) не было детектировано после 7 дней [28].

Несмотря на то, что результаты некоторых исследований указывают на то, что ЭДТА может быть не лучшим выбором антикоагулянта для анализа циркулирующих микроРНК [30][32], он остается одним из самых распространенных — из 13 исследований, включенных в настоящий обзор и не направленных на изучение влияния антикоагулянтов или типов используемых пробирок, антикоагулянты на основе ЭДТА были использованы в 12, в одном был использован ACD [26].

Хранение крови. Известно, что значительные изменения в концентрациях многих измеряемых аналитов может вызывать отложенная обработка биоматериала [1]. При проведении исследований может потребоваться кратковременное хранение и транспортировка образцов крови из места сбора в лабораторию. Высвобождение микроРНК клеток крови во время хранения крови может влиять на уровень исследуемых микроРНК в плазме и сыворотке [33].

В таблице 3 представлены 12 исследований, в которых проводилось сравнение разных условий хранения (длительность и температурный режим) и/или транспортировки крови. Во всех 12 работах кровь была собрана в пробирки для получения плазмы, в 3 из них также анализировали кровь в пробирках для получения сыворотки [24][25][34]. Значения КТ, при которых были проведены исследования, приведены в трех публикациях [23][24][33].

Исследуемые условия хранения крови можно разделить на краткосрочные (до одного дня) [8][10][22-24][30][33] и на долгосрочные (от 3 до 14 дней) [25][27][28][31].

В двух исследованиях изучалось влияние длительности хранения крови при КТ до получения сыворотки [25][34]: значимых различий в уровне экспрессии 823 различных микроРНК при хранении в течение 3 ч обнаружено не было в работе [34], но в исследовании [25] уровень miR-21 был стабилен только в течение 24 ч, тогда как уровень miR-1 был стабилен в течение 4 дней.

В ряде работ изучали, как влияет на стабильность микроРНК длительность хранения при КТ до получения плазмы (ЭДТА) [22][23][25][27][28][33][34]. Было показано, что хранение крови с ЭДТА до центрифугирования при КТ значимо изменяло уровни экспрессии анализируемых микроРНК: при сравнении результатов хранения при 2 ч и 6 ч [22], а также при хранении в течение 3 ч [34], 2 ч, 6 ч, 24 ч [30], 6 ч и 24 ч [33], 18 ч [23], 3 и 4 дней [25], и, наконец, а также в течение 14 дней [27] по сравнению с немедленным центрифугированием. В исследовании [28] было выявлено различие в уровнях экспрессии микроРНК после 18 ч хранения по сравнению с 4 ч [28]. Однако в исследовании [25] при хранении крови (ЭДТА) при КТ концентрации микроРНК не изменялись в течение 24 ч.

В двух исследованиях оценивали влияние на хранение крови типа пробирок для длительного хранения разных производителей [27, 28]. Один тип пробирок совпадал между исследованиями Cell-Free DNA (Streck), однако в работе [27] было показано увеличение уровней микроРНК с увеличением длительности хранения (0, 2, 4, 7, 10, 14 дней), в то время как в работе [28] общее содержание микроРНК оставалось стабильным в крови, хранящейся до 1 нед.

В ряде исследований оценивали, как влияет длительность хранения крови (ЭДТА) при 4^о C [8][10][28][30][31][33] на стабильность микроРНК. В большинстве работ показано, что при увеличении времени хранения крови при 4^о C в течение 2 ч, 6 ч, 24 ч [8][30], 24 ч [33], после 1 дня [31] при сравнении с немедленным центрифугированием наблюдалось изменение уровней экспрессии микроРНК, в работе Kim SH, et al. (2021) также показано значимое повышение гемолиза с увеличением времени хранения [8]. Однако в работе [28] значимых различий получено не было при хранении в 12 и 18 ч при сравнении с хранением в течение 4 ч.

Кроме того, было проведено изучение влияния хранения крови до получения плазмы на льду или при КТ до 7 ч [10], в результате которого было показано, что в образцах, хранившихся на льду, относительный уровень связанных с эритроцитами микроРНК, использовавшийся как индикатор гемолиза, был значимо выше, чем в образцах, хранившихся при КТ, в которых не было обнаружено значимых различий с образцами, обработанными немедленно. Как было показано ранее, хранение цельной крови на льду приводит к изменению качества плазмы и повреждению целостности мембраны тромбоцитов [36].

Лишь в одном из исследований было проведено хранение крови (ЭДТА) в течение 9 мес. при -80^о C, которое показало увеличение уровней экспрессии микроРНК по сравнению с длительностью хранения в течение 1 дня [25].

Таким образом, результаты большинства обсуждаемых исследований продемонстрировали, что уровни микроРНК значимо меняются уже после нескольких часов хранения крови как при КТ, так и при 4^о C, и обработка образцов должна проводиться как можно быстрее после получения.

Транспортировка. Несмотря на то, что транспортировка биообразцов также является преаналитическим фактором, исследований, проводивших сравнение условий транспортировки, немного. В реальных клинических условиях многие диагностические тесты проводятся на аутсорсинге, и образцы крови необходимо отправлять до места проведения анализа [28]. Только в двух из включенных в обзор исследований проводилась оценка влияния транспортировки на биообразцы [24][25]. В одном из них кровь в пробирках для получения сыворотки или с ЭДТА, а также плазма и сыворотка были помещены в шейкер при КТ на 1 или 8 ч, после чего оценивали концентрацию hsa-miR-1 и hsa-miR-21 [25]. В результате было показано, что после 8 ч экспрессия обеих микроРНК значимо снизилась в плазме, а miR-1 — в сыворотке цельной крови, тогда как после 1 ч воздействия никаких изменений не наблюдалось. Экспрессия микроРНК в обработанной ЭДТА цельной крови была стабильной после 1 или 8 ч воздействия. Образцы цельной крови вероятно являются более устойчивыми, чем разделенные фракции в условиях физического стресса, но они также демонстрируют схожую тенденцию к снижению уровней микроРНК с течением времени [25]. В другом исследовании кровь в пробирках для получения сыворотки и плазмы с разными антикоагулянтами была транспортирована до 9 ч при 2-8^о C или КТ [24]. В результате было показано, что на выход микроРНК сыворотки метод хранения существенно не влиял, в то время как статистически значимый эффект хранения был обнаружен для плазмы ЭДТА и ACD-B [24].

Центрифугирование. Во время подготовки сыворотки и плазмы удаление клеточных компонентов обычно достигается путем центрифугирования. Конечная фракция плазмы может различаться по количеству остаточных тромбоцитов и микровезикул, в зависимости от скорости центрифугирования [32]. Тромбоциты содержат множество микроРНК, а условия подготовки плазмы могут вызывать активацию тромбоцитов и высвобождение микровезикул тромбоцитов (platelet-derived microvesicles, PMV), которые содержат специфические сигнатуры микроРНК. PMV составляют основную фракцию всех микровезикул в плазме. Даже следовые количества тромбоцитов или микрочастиц будут искусственно повышать уровни микроРНК и потенциально изменять профили экспрессии микроРНК, связанные с заболеванием, поскольку концентрации микроРНК в клетках крови намного выше, чем в плазме или сыворотке [1]. Поэтому минимизация активации тромбоцитов in vitro является важным аспектом исследования циркулирующих микроРНК [32].

Исследования, направленные на изучение влияния протоколов центрифугирования образцов и установление оптимального протокола центрифугирования, приведены в таблице 4.

Анализ уровней трех микроРНК в плазме после трех последовательных центрифугирований показал, что более высокая концентрация исследованных микроРНК в плазме обусловлена клеточной контаминацией, а дополнительное ультрацентрифугирование при 355000 g привело лишь к незначительному снижению концентрации микроРНК; это указывает на то, что вклад экзосом и везикул в концентрацию исследованных микроРНК минимален [15].

В работе Cheng HH, et al. (2013) были оценены уровни циркулирующих микроРНК, остаточное количество тромбоцитов и содержание микрочастиц в плазме и сыворотке, подвергшихся разным способам обработки. После однократного центрифугирования при 3400 g, содержание тромбоцитов в плазме составило 28 тыс./мкл, повторное центрифугирование, в результате которого была получена бедная тромбоцитами плазма (platelet-poor plasma, PPP) снизило содержание тромбоцитов на 80-90%, а плазма, полученная с помощью центрифугирования при 600 g — богатая тромбоцитами плазма (platelet-rich plasma, PRP), содержала в 13-19 раз больше тромбоцитов. При сравнении PPP после фильтрации через 0,22 мкм фильтр и тромбоцитарного концентрата (ресуспендированый осадок, образовавшийся после получения PPP) уровни 71% детектированных микроРНК (199/282) различались [20].

В других исследованиях также было показано снижение общего выхода микроРНК [24], количества детектируемых микроРНК [29], концентрации отдельных микроРНК [26][27], в т.ч. ассоциированных с тромбоцитами [29], при двойном центрифугировании плазмы по сравнению с однократным.

При этом, двойное центрифугирование оказывало гораздо меньший эффект на образцы сыворотки, чем плазмы [15], результаты, полученные Basso D, et al. (2017) при сравнении образцов сыворотки после одного или двух центрифугирований, показали, что профили экспрессии зависели преимущественно от температуры, а не от протокола центрифугирования [24].

Page K, et al. (2013) показали, что скорость второго центрифугирования плазмы влияет на количество детектированных микроРНК, которое составило 195 при 1000 g, 187 при 2000 g и 138 при 10000 g. Также было показано снижение уровня ассоциированных с тромбоцитами микроРНК (hsa-miR-24, hsa-miR-191, hsa-miR-197, hsa-miR-223) при центрифугировании при 10000 g [22]. Однако в работе Chan S-F, et al. (2023) в плазме, полученной после второго центрифугирования при наибольшей из исследованных скоростей (5000 g), относительный уровень ассоциированных с тромбоцитами микроРНК был значимо повышен по сравнению с плазмой, полученной после второго центрифугирования при 1500 g, при этом при повышении скорости второго центрифугирования от 1500 g до 3000 g наблюдался тренд к понижению относительной концентрации тромбоцитарных микроРНК [10].

Были также изучены другие способы получения PPP: тройное центрифугирование [26] и продолжительное одиночное центрифугирование [9].

В ряде исследований, включенных в настоящий обзор и не направленных на изучение условий центрифугирования, была использована плазма, полученная после однократного центрифугирования (условия центрифугирования варьировали от 1200 g в течение 10 мин до 2500 g в течение 20 мин) [19][25][31][34], в других — полученная после двойного (скорость второго центрифугирования варьировала от 2500 g до 12000 g) [8][28][30][32][33]. В двух исследованиях из первой группы были использованы образцы биобанков [25][31]. Возможность получения PPP из замороженных образцов плазмы была проанализирована в ряде исследований [10][12][20].

Было показано, что при повторном центрифугировании плазмы, замороженной после однократного центрифугирования, происходит значимое снижение содержания тромбоцитов [20]. При двух последовательных центрифугированиях размороженной плазмы при 3000 g в течение 15 мин было показано снижение содержания тромбоцитов до значений, достигнутых в PPP, во всех десяти исследованных образцах, при одном центрифугировании при 3000 g в течение 30 мин — в шести образцах из десяти [12], также было показано снижение относительного уровня ассоциированных с тромбоцитами микроРНК по сравнению с плазмой, полученной при однократном центрифугировании и не подвергавшейся заморозке [10]. Однако в работе Binderup HG, et al. (2016) уровни всех или большинства (в зависимости от использованной нормализации) исследованных микроРНК были значимо выше, чем в PPP [12].

Таким образом, хотя частота использования плазмы, полученной после одного и двух центрифугирований сопоставима, протоколы центрифугирования, позволяющие получить плазму с наименьшим содержанием тромбоцитов и наименьшей контаминацией тромбоцитарными микроРНК, включают два последовательных центрифугирования непосредственно после забора крови. При этом, актуальным остается вопрос использования образцов из коллекций биобанков. Стандартные протоколы приготовления плазмы, используемые в биобанках, включают одно центрифугирование, а проведение дополнительных центрифугирований после разморозки позволяет снизить до уровня PPP содержание тромбоцитов, но остаются значимые различия в уровнях микроРНК.

Заключение

Результаты исследований показывают, что различия в обработке образцов на каждом этапе пробоподготовки могут приводить к статистически значимым различиям в уровнях исследуемых микроРНК, и подтверждают необходимость унификации процессов пробоподготовки. Биобанки, использующие единые протоколы для всех образцов, позволяют решить эту задачу. В то же время, некоторые данные указывают на возможную неоптимальность наиболее распространенных практик, в т.ч. тех, которые применяются к образцам в коллекциях биобанков, что может потребовать разработки дополнительных протоколов обработки и анализа таких образцов. Для этого, а также для уточнения уже полученных противоречивых результатов необходимы дополнительные исследования.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.