Влияние условий хранения плазмы и сыворотки на уровни циркулирующих микроРНК

Введение

Исследования циркулирующих микроРНК (малых некодирующих молекул рибонуклеиновых кислот), проведенные за последнее десятилетие, продемонстрировали их потенциал в качестве минимально инвазивных диагностических, прогностических и предиктивных биомаркеров, характеризующих широкий спектр патологических состояний [1-3]. МикроРНК представляют собой короткие (18-25 нуклеотидов), одноцепочечные, некодирующие РНК, которые участвуют в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов посредством взаимодействия с матричной РНК (мРНК), приводящего к полной деградации целевой мРНК или подавлению экспрессии генов [1][4][5].

В плазме и сыворотке крови внеклеточные микроРНК защищены от деградации с помощью включения их в микровезикулы или экзосомы, или связью с белками [6-8]. Стоит отметить, что при сравнении плазмы и сыворотки, согласно результатам различных исследований микроРНК, сопоставимых результатов получено не было, что свидетельствует о необходимости использовать один и тот же тип образца последовательно на протяжении всего исследования и четко определять, как тип образца, так и его обработку [4][5].

По мере развития исследований циркулирующих микроРНК как биомаркеров патологий человека накапливались данные, указывающие на влияние преаналитических и аналитических факторов на их уровни [3][9]. Валидация результатов исследований микроРНК затруднена отсутствием аналитической (т.е. низкой межплатформенной согласованности) и постаналитической (т.е. стратегии нормализации) стандартизации. Влияние микроРНК на принятие медицинских решений ослабляется неопределенностью относительно значения изменений в их экспрессии [10]. В связи с этим необходимость тщательного рассмотрения эффектов различных преаналитических и аналитических параметров, которые могут влиять на выделение и стабильность микроРНК, представляется актуальной задачей [6][11][12].

Цель обзора — рассмотреть современные оригинальные работы, изучающие различные условия хранения биобанкированных образцов плазмы и сыворотки крови с последующим выделением для анализа циркулирующих микроРНК.

Методологические подходы

Поиск литературных источников включал запросы в системах индексирования научных публикаций (Google Scholar, PubMed, eLIBRARY) по заголовкам, аннотациям и ключевым словам: "serum+ microRNA"/"сыворотка+микроРНК" и "plasma+ microRNA"/"плазма+микроРНК" с добавлением дополнительных переменных "preanalytical"/"pre-analytical"/"преаналитический", "storage"/"хранение", "extraction"/isolation"/"выделение". В обзор были включены только оригинальные методологические исследования тотальной циркулирующей микроРНК за последние 15 лет.

Результаты

Преаналитические факторы. На основе систематического поиска было отобрано 19 методологических исследований, в которых изучали такие преаналитические и аналитические факторы, как хранение плазмы и сыворотки крови, а также выделение и хранение микроРНК (таблица 1). Из 18 работ 13 были проведены с использованием плазмы, 2 — плазмы и сыворотки, 4 — сыворотки.

Основным ограничением большинства включенных в обзор исследований является небольшой размер выборки: в двух работах было <3 образцов [15][23], в двух были использованы пулированные образцы от разных доноров [15][17], в работе [6] отсутствует четкое описание выборки. Использование пулированных образцов или одного донора применялось для получения стандартного исходного образца [15]. В большинстве исследований размер выборки составлял от 3 до 19 человек, в двух — 60 [26] и 164 [19]. Следует отметить, что в работе Matias-Garcia PR, et al. (2020) сравнение проводилось между образцами, полученными от одних и тех же участников в разные годы [1], а в работе Balzano F, et al. (2015) сравнение образцов, хранившихся больше года, со свежими образцами были использованы образцы разных людей [20].

Ранее было показано, что на уровень микроРНК могут влиять различные факторы, такие как тип антикоагулянта крови, содержание тромбоцитов, степень гемолиза, условия хранения крови, плазмы и сыворотки, а также протокол центрифугирования [11]. Помимо рассматриваемых в данном обзоре параметров, в части исследований изучались и другие преаналитические факторы, а именно: разные антикоагулянты и типы пробирок [22, 26], влияние гемолиза эритроцитов на микроРНК плазмы и сыворотки [13], различные протоколы центрифугирования [3][13][17][23], условия хранения крови [3][17][19][22][26].

Из 15 исследований, в которых были использованы образцы плазмы, в 13 антикоагулянты были на основе этилендиаминтетрауксусной кислоты, в двух — ACD (citric acid, trisodium citrate, dextrose, лимонная кислота, тринатрийцитрат, декстроза) [15][23]. При центрифугировании образцов крови для получения плазмы и сыворотки происходит удаление таких клеточных компонентов, как тромбоциты, которые также содержат множество микроРНК [4][9]. Так, плазма, полученная после двойного центрифугирования, считается бедной тромбоцитами плазмой (platelet-poor plasma, PPP) и содержит значительно меньше тромбоцитов по сравнению с плазмой, полученной после однократного центрифугирования, которая называется богатой тромбоцитами плазмой (platelet-rich plasma, PRP) [27]. В работе Chan S-F, et al. (2023) было показано, что повторное центрифугирование плазмы, которая была заморожена после однократного центрифугирования, приводит к значимому снижению содержания тромбоцитов [3].

В 7 из 15 работ использовалась плазма или сыворотка, полученная после однократного центрифугирования (795-4000 g) [2][14][18][20][22][25][26], в 8 — после двойного (2500-15000 g) [3][6][10][13][15][17][21][23], в 4 четко описанный протокол центрифугирования [1][16][19][24] отсутствовал. Несмотря на то, что протокол двойного центрифугирования позволяет получить плазму с наименьшим содержанием тромбоцитов, в анализируемых исследованиях встречается использование плазмы как после одного, так и двух центрифугирований. В то же время стандартные протоколы приготовления плазмы в биобанках используют только одно центрифугирование, проведение после разморозки дополнительного центрифугирования приводит к снижению содержания тромбоцитов до их уровня в PPP, однако значимые различия сохраняются в уровнях микроРНК [28]. Из 19 включенных работ только в шести было указано, что использовались образцы из коллекций биобанков [1][19][20][22][25][26].

Среди методов, применяемых для анализа микроРНК, количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием обратной транскрипции (кПЦР) является золотым стандартом для измерения микроРНК [21][24]. При кПЦР для анализа полученных данных применяется метод относительной количественной оценки 2^-ΔΔCq, основанный на определении значений пороговых циклов Cq (cycle of quantification) [29]. Кроме того, используются такие методы как секвенирование следующего поколения (next generation sequencing) и микрочипы. Однако NGS постепенно становится основным подходом для глобального профилирования микроРНК, поскольку оно потенциально более чувствительно по сравнению с анализом с использованием микрочипов и имеет преимущество в отсутствии необходимости заранее знать целевые последовательности [24].

кПЦР была наиболее часто используемым методом анализа микроРНК во включенных в обзор исследованиях (n=17), в двух применялось секвенирование малых РНК [24][26], в одном — микрочипов [16]. Количество включенных в анализ микроРНК с использованием кПЦР варьировало от 2 до 384. Наиболее часто анализируемыми среди исследуемых эндогенных микроРНК были miR-16 (n=10), miR-21 (n=7), miR-24 (n=4), а среди экзогенных: cel-miR-39 (n=5) [6][13][15][21][22].

Хранение сыворотки. В обзор были включены пять исследований, в которых были проведены эксперименты по оценке влияния хранения сыворотки крови при разных температурах и длительности на уровень микроРНК (таблица 2).

Изучение влияния условий хранения сыворотки при комнатной температуре (КТ) было выполнено в 5 работах [3][13][14][22]. Хранение сыворотки при КТ в течение 1, 2 и 3 дней [13], 1 и 4 дней [22], 3 дней [3] привело к значимому снижению концентрации исследованных микроРНК по сравнению с немедленным выделением микроРНК после получения сыворотки. Снижение уровней микроРНК также наблюдалось после 10 дней хранения при КТ по сравнению с температурой -80^о C [14].

Хранение сыворотки при +4^о C было проанализировано в двух исследованиях [3][13], в результате которых было также показано значимое снижение в уровне изучаемых микроРНК по сравнению с немедленным выделением микроРНК после получения сыворотки: при хранении в течение 3 [13] и 30 дней [3]. Однако стоит заметить, что значимых различий при хранении в течение 3 и 7 дней в работе [3] отмечено не было.

Кроме того, в трех исследованиях были получены противоречивые результаты по хранению сыворотки при -20^о C [3][13][14]. В одной работе хранение в течение 3 дней также приводило к снижению уровня микроРНК по сравнению с немедленным выделением микроРНК после получения сыворотки [13], тогда как в другой [3] значимых различий не было выявлено при хранении в течение 3, 7, 30, 90, 180, 360 дней, а также после 10 дней и 20 мес. хранения при -20^о C по сравнению с -80^о C [14]. В исследовании по хранению сыворотки до 10 лет было показано, что после 2 и 4 лет хранения наблюдалась только небольшая разница в уровнях микроРНК, тогда как значимое снижение было обнаружено после 6 лет, которое продолжалось после 10 лет хранения [14].

Хранение сыворотки при -80^о C было описано в трех исследованиях [3, 14, 25]. Значимых различий не было выявлено после 10 дней и 20 мес. хранения при -80^о C по сравнению с -20^о C [14] и при при -80^о C в течение 360 дней по сравнению с немедленным выделением микроРНК после получения сыворотки [3], тогда как после хранения при температуре -80^о C в течение 14 дней только для 1 из 16 микроРНК было продемонстрировано значимое снижение в уровне микроРНК по сравнению с образцами, хранившимися при температуре +4^о C и выделенными в течение 24 ч [25].

Выявленные снижения в уровне микроРНК при хранении сыворотки вероятно могут свидетельствовать о деградации микроРНК в биообразцах [13]. Комплексный анализ 356 микроРНК продемонстрировал, что деградация коррелирует с их распространенностью, процентом GC и длиной микроРНК как в образцах сыворотки, так и в образцах PPP [3]. Однако в большинстве проанализированных работ показана высокая стабильность микроРНК в сыворотке при длительном хранении при -20^о C и -80^о C.

Хранение плазмы. В обзор были включены 10 исследований, в которых изучали влияние хранения плазмы разной длительности и при разных температурах на уровень микроРНК (таблица 3).

Хранение плазмы при КТ изучалось в 4 исследованиях [3][10][22][23]. При сравнении количества микроРНК детектируемых в плазме крови, хранившейся 24 ч при КТ и замороженной немедленно при -80^о C, были найдены значимые различия [10]. После инкубации плазмы в течение 24 ч или 4 дней [22], а также 3 и 7 дней [3] было выявлено значимое снижение уровня микроРНК по сравнению с немедленным выделением микроРНК после получения плазмы. Однако в работе Muth DC, et al. (2018) [23] значимых различий при хранении в течение 24 ч выявлено не было, что также подтверждается более ранним исследованием [30].

Изучение влияния условий хранения плазмы +4^о C было проведено в 4 работах [3][6][10][26]. Результаты двух из них демонстрируют снижение уровней эндогенных циркулирующих микроРНК при хранении образцов плазмы через 24 ч, 48 ч, 1 мес. и 4 мес. [6] и через 14 и 30 дней [3] по сравнению с немедленным выделением микроРНК после получения плазмы. Однако в работе Chan S-F, et al. (2023) значимых различий в уровне микроРНК через 3 и 7 дней хранения получено не было. Кроме того, были выявлены значимые различия в количестве микроРНК в плазме после хранения в течение 24 ч по сравнению с замороженной немедленно при -80^о C [10]. В исследовании Suzuki K, et al. (2022) [26] при хранении плазмы в течение 1, 3, 5, 7, и 30 дней значимых различий в уровне изучаемых микроРНК при сравнении с плазмой, хранившейся 1 час после центрифугирования при +4^о C, показано не было показано.

Хранение плазмы при -20^о C оценивалось в трех исследованиях [3][6][26]. Снижение уровней микроРНК при хранении образцов плазмы было продемонстрировано через 24 ч, 48 ч, 1 мес. и 4 мес. [6] и через 270 дней [3] по сравнению с немедленным выделением микроРНК после получения плазмы. Стоит отметить, что в исследовании Chan S-F, et al. (2023) [3] при хранении в течение 3, 7, 14, 30, 60, 90, 180 и 360 дней значимых различий выявлено не было. В другой работе при хранении плазмы в течение 1, 3, 5, 7, и 30 дней не было показано значимых различий в уровне изучаемых микроРНК при сравнении с плазмой, хранившейся 1 ч после центрифугирования при -20^о C [26].

Исследования по хранению плазмы при низких температурах (-70, -80, -180^о C, жидкий азот) [1][3][6][10][17][19][20][22][26] можно разделить на краткосрочные (до 1 года) [3][6][10][19][20][22][26] и долгосрочные (от 1 до 14 лет) [1][17][20].

При краткосрочном хранении по сравнению с немедленным выделением микроРНК после получения плазмы снижение уровней микроРНК плазмы было продемонстрировано через 24 ч, 48 ч, 1 мес. и 4 мес. при -70^о C [6], в то время как значимых различий в уровне микроРНК при хранении в течение 3, 7, 14, 30, 60, 90, 180, 270, 360 дней при -80^о C [3], также, как и в течение 6 мес. в жидком азоте [19] и 6 и 12 мес. при -80^о C выявлено не было [20]. При сравнении хранения при -80^о C и в жидком азоте также не было получено значимых различий [19]. В другом исследовании при сравнении хранения плазмы в течение 9 мес. при -80^о C с хранением в течение 1 дня значимых различий выявлено не было [22].

При анализе долгосрочного хранения было показано, что при сравнении с немедленным выделением микроРНК после получения плазмы хранение при -80^о C в течение 12 лет демонстрирует схожие профили микроРНК, что подчеркивает потенциал анализа хранящихся в биобанках образцов [17]. В работе [26] хранение плазмы в течение 4 и 5 лет сравнивалось c 3 годами, значимые различия были получены только при 5-летнем сроке хранения. При сравнении образцов, хранившихся 3 года, со свежими образцами не было выявлено значимых различий, однако при хранении 4, 10 и 11 лет было обнаружено значимое снижение уровня 1 из 8 микроРНК, а при хранении 14 лет значимое снижение было показано для 7 из 8 микроРНК [20]. Кроме того, не было обнаружено различий при сравнении уровней микроРНК в образцах плазмы, хранившихся в течение 2 и 9 лет при -180^о C, однако значимые различия были получены при хранении в течение 17 лет по сравнению с 2 и 9 годами [1]. Несмотря на довольно противоречивые данные о влиянии различных условий хранения на уровень микроРНК плазмы, большинство проведенных исследований показало, что наиболее стабильны микроРНК при -80^о C.

Циклы замораживания-оттаивания. Циркулирующие микроРНК обычно сохраняются путем хранения при температурах, достаточно низких для значительного снижения активности РНКазы, а не путем химической фиксации [4]. Ранее было показано, что циклы замораживания-оттаивания могут потенциально влиять на несколько аналитов [4], и что 8 циклов замораживания-оттаивания плазмы имели минимальный эффект на уровни микроРНК [30].

В обзор были включены 5 исследований, в которых изучали влияние циклов замораживания-оттаивания плазмы и сыворотки крови на уровень микроРНК (таблица 4).

В обоих исследованиях, проведенных с использованием образцов сыворотки, хранившихся при -80^о C, было выявлено снижение уровня микроРНК после 10 ежедневных циклов [14] и 4 циклов [22] замораживания-оттаивания при сравнении с образцами, хранившимися при -80^о C.

Из включенных в анализ работ, 4 были проведены с использованием образцов плазмы крови. Снижение уровней микроРНК при увеличении циклов замораживания-оттаивания было выявлено при сравнении с немедленным выделением РНК [19], а также после 4 циклов замораживания-оттаивания при сравнении с образцами, хранившимися при -80^о C [22]. При исследовании влияния множественных циклов замораживания-оттаивания образцов плазмы на уровень микроРНК, было выявлено значимое снижение уровня одной из восьми исследуемых микроРНК [1]. Тогда как в работе Muth DC, et al. (2018) [23] после 6 циклов при -80^о C при сравнении с образцами, полученными из свежей плазмы, значимых различий получено не было для PPP, тогда как для PRP однократное замораживание-оттаивание привело к снижению уровней микроРНК, а дополнительные циклы замораживания-оттаивания не имели последовательного дополнительного эффекта.

Эти результаты показывают, что в связи с противоречивыми результатами влияния циклов замораживания-оттаивания на микроРНК их следует минимизировать, а многократные измерения замороженного образца следует проводить с осторожностью для прямого сравнения результатов. Согласно результатам проведенных исследований, плазма с низким содержанием тромбоцитов менее чувствительна к замораживанию-оттаиванию, а уровни микроРНК в плазме, богатой тромбоцитами, не изменяются при дополнительных циклах замораживания-оттаивания после того, как произошло повреждение тромбоцитов.

Выделение микроРНК. Любой успешный маркер или набор маркеров должен быть достаточно стабильным во время и после процесса изоляции, чтобы обеспечить надежное обнаружение и измерение [15]. Отсутствие стандартизации является проблемой для столь необходимых сравнений исследований микроРНК. Биологические жидкости содержат небольшое количество РНК относительно клеток и тканей и, если обработка образцов не удаляет мелкие клетки и клеточные фрагменты, их микроРНК могут преобладать в любом "внеклеточном" профиле микроРНК, точно так же, как РНК из гемолизированных образцов может влиять на профилирование [13][15]. Техническим препятствием для изучения экспрессии микроРНК является отсутствие возможности надежного и эффективного выделения микроРНК из биологических образцов из-за их небольшого размера и их прикрепления к липидам и белкам, а также из-за присутствия ингибиторов ПЦР в биологических жидкостях [2][6][15]. В настоящее время для выделения доступно несколько коммерческих наборов, использование которых позволяет оптимизировать выделение малых РНК, либо в сочетании с тотальной РНК, либо в виде фракции, обогащенной малыми РНК, а экзогенные синтетические микроРНК были предложены в качестве внешних контролей для нормализации вариаций от образца к образцу в процедурах выделения РНК [6].

Из включенных в обзор исследований, сравнение наборов для выделения микроРНК из плазмы или сыворотки было проведено в 8 (таблица 5). Все исследования были проведены с помощью кПЦР, кроме двух: в исследовании Wong RKY, et al. (2019) [24] использовалось NGS, а в работе Moret I, et al. (2013) [16] — микрочипы. Кроме того, из 19 исследований, включенных в этот обзор, в одном набор для выделения микроРНК не был указан [19].

Только в двух исследованиях выделение микроРНК было выполнено из сыворотки крови, и наибольший выход микроРНК был получен с использованием наборов mirVana PARIS (Invitrogen, США) [13] и NucleoSpin miRNA Plasma (Machereye-Nagel, Германия) [18].

Сравнение наборов для выделения микроРНК из плазмы продемонстрировало, что методы на основе колонок работают лучше, чем TRIzol LS (Invitrogen, США), из-за присутствия органических и фенольных загрязняющих веществ в РНК [6][16]. Из 15 наборов, представленных во включенных в обзор исследованиях, 7 были проанализированы только в одном из сравнений. В исследовании [2] все пять наборов дали сопоставимые количества РНК с точки зрения конечных значений Cq. Среди наборов для выделения микроРНК из плазмы чаще всего в сравнения были включены mirVana PARIS (Invitrogen, США) [6][13][16][21] и miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, Германия) [2][15-17][21][24]. Каждый из этих наборов показал наилучшие результаты в трех сравнениях: mirVana PARIS (Invitrogen, США) — [6][13][21], miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, Германия) — [2][16][17]. Стоит отметить, что между собой эти наборы сравнивались только в двух исследованиях, результаты которых оказались противоречивы [16][21]: miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, Германия) показал лучший результат в работе [16], а mirVana PARIS (Invitrogen, США) — в [21].

Из всех включенных в обзор исследований набор mirVana PARIS (Invitrogen, США) использовался в 4 [6][13][16][21], а miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, Германия) — в 7 [2][15-17][20][21][24].

Наборы miRCURY RNA Isolation Kit — Biofluids (Exiqon, Дания) [2][15][21] и NucleoSpin miRNA Plasma (Machereye-Nagel, Германия) [2, 21] показали лучшие результаты во всех сравнениях, в которые были включены, в отличие от трех других наборов mirVana miRNA Isolation Kit (Invitrogen, США) [15][17], miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) [6][13] и TRIzol LS (Invitrogen, США) [6][15][16].

Только в одном из исследований методом анализа был NGS и сравнение двух наборов для выделения микроРНК проводилось в сочетании с разными наборами для приготовления библиотек [24]. Бóльшая доля прочтений, картированных на микроРНК, была получена в библиотеках, подготовленных с помощью набора MagnaZol (Bioo Scientific, США) по сравнению с набором miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, Германия) [24].

Отсутствие консенсуса относительно выделения микроРНК подчеркивает важность использования одного и того же метода выделения на протяжении всего исследования, чтобы свести к минимуму влияние искажающих переменных [4].

Для количественной оценки микроРНК доступны различные методы обнаружения (кПЦР, микрочипы, NGS), однако все они требуют нормализации для учета и коррекции вариаций между образцами. Различные методы нормализации приводят к противоречивым результатам анализа уровня экспрессии микроРНК [4]. Так, для нормализации данных кПЦР используют как добавляемые во время выделения экзогенные микроРНК "spike-in" (например, Caenorhabditis elegans: cel-miR-39, cel-miR-54, cel-miR-238), так и повсеместно экспрессируемые эндогенные РНК, например, малую ядерную РНК (мяРНК, snRNA) U6 или miR-16 [20]. В большинстве включенных в анализ исследований для нормализации использовались: cel-miR-39 [6][13][15][21][22]; cel-miR-54 [21]; miR-16 [13]. В двух работах метод нормализации данных кПЦР не описан [14][24].

Таким образом, необходимо проявлять большую осторожность при выборе подходящей микроРНК, концентрация которой практически не зависит от преаналитических переменных [4]. Включение по крайней мере одной экзогенной контрольной микроРНК или панели экзогенных контрольных микроРНК во все образцы до выделения микроРНК имеет решающее значение для компенсации различий между различными образцами [5].

Кроме того, следует отметить, что в области количественной генетики при проведении статистического анализа необходимо применение поправки на множественные сравнения [31]. В результатах исследований, проведенных без использования поправки на множественные сравнения, может быть завышение уровня значимости и нахождение большого числа ложных ассоциаций [31]. Только в 6 из 19 включенных в обзор исследований была применена поправка на множественные сравнения [1][2][10][16][24][26]. Из-за упомянутых ограничений выявленные и описанные ранее различия в преаналитических и аналитических факторах из-за неудовлетворительного статистического анализа могли быть обусловлены ложными обнаружениями.

Хранение микроРНК. Сравнение условий хранения микроРНК было проведено только в двух из проанализированных работ [6][23]. Было показано, что выделенная микроРНК стабильна при -70^о C в течение периода хранения до года. Анализ проводился с помощью количественной оценки уровней cel-miR-39 через 2, 6, 8, 9 и 12 мес. [6]. В другом исследовании была продемонстрирована стабильность микроРНК (на примере miR-16-5p) при 22^о C в течение 0, 1, 3 и 7 дней до проведения кПЦР, а незначительное увеличение среднего Cq наблюдалось только через 7 дней при КТ [23]. Приведенные исследования доказывают относительную стабильность микроРНК при хранении.

Заключение

Стандартизация преаналитических переменных представляет собой критический шаг для клинических задач и научных проблем при определении циркулирующих микроРНК. Несмотря на их стабильность, количественные измерения циркулирующих микроРНК могут быть существенно подвержены как внешним, так и внутрииндивидуальным факторам. Условия хранения сыворотки и плазмы крови перед анализом, а также методы выделения, используемые для обнаружения микроРНК, являются важными преаналитическими переменными. Для того, чтобы анализ микроРНК мог быть реализован в клинических лабораторных условиях, необходимо установить стандартизированные протоколы условий хранения образцов, выделения и нормализации, обеспечивающих воспроизводимую и точную количественную оценку уровней циркулирующей микроРНК.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.