Банк данных геномных последовательностей патогенных микроорганизмов и его роль в осуществлении эпидемиологического надзора

Введение

Опыт работы в условиях пандемии COVID-19 (COrona VIrus Disease 2019, коронавирусная инфекция 2019г) заставил мировое сообщество пересмотреть свои взгляды на проблему биологических угроз. Уже в 2022г Всемирная организация здравоохранения на конференции, посвященной научным стратегиям по борьбе с недавними вспышками инфекционных болезней, обозначила необходимость подготовки к появлению нового патогена "Х", определив при этом, что все инфекционные агенты, обладающие на современном этапе эпидемическим потенциалом, относятся к вирусам.

Одновременно с этим, в период высокой заболеваемости COVID-19 возросла роль отдельных хронических вирусных инфекций, тем или иным образом связанных с состоянием, которое получило название "long COVID" или постковидный синдром. В ходе проведенных исследований было установлено, что у ряда пациентов на фоне течения COVID-19 происходит реактивация хронических герпесвирусных инфекций, в перечне которых лидирующую позицию занимает инфекция, вызванная вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) [1-4], существенно утяжеляющая состояние больного и требующая глобальных материальных затрат на его лечение [5].

Это, в свою очередь, требует проведения исследований по изучению структуры и свойств вирусов — возбудителей инфекционных болезней человека, как новых, ранее не встречающихся, так и давно известных, но недостаточно изученных в силу определенных обстоятельств [6]. Для решения данной задачи необходима организация крупномасштабных мониторинговых исследований [7][8]. При этом вирусологические методы, основанные на воспроизводстве патогенов в биологических моделях или культурах клеток и позволяющие оценить фенотипические свойства возбудителей и их биологические особенности, достаточно трудоемки и требуют наличия большого временнóго ресурса. Кроме того, их применение не позволяет проследить степень генетического родства исследуемых патогенов, их изменчивость, что, в свою очередь, определяет необходимость использования иных научных подходов [9].

В последнее время интенсивно развиваются и усовершенствуются технологии секвенирования, направленные на определение нуклеотидной последовательности отдельных генов или генома в целом. Результаты таких исследований позволяют проводить филогенетический анализ путем поиска сходств и различий с ранее изученными образцами [10]. С 2020г такой подход стал неотъемлемой частью молекулярно-генетического мониторинга за циркулирующими геновариантами SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome CoronaVirus 2, коронавирус 2, вызывающий тяжелый острый респираторный дистресс-синдром), что наряду с другими исследованиями позволило соотнести определенные штаммы вируса не только с характером и тяжестью клинических проявлений болезни, но и с интенсивностью эпидемического процесса, а также составить математический прогноз его развития [6][11].

Для депонирования информации, полученной в ходе молекулярно-генетических исследований SARS-CoV-2, впервые в России был сформирован масштабный банк данных генетической информации¹ VGARus (Virus Genome Aggregator of Russia), в работу с которым во время пандемии COVID-19 были вовлечены ведущие исследовательские центры [12, 13]. В дальнейшем возможности VGARus были существенно расширены²: развернута масштабная работа по секвенированию и биоинформатическому анализу геномов не только SARS-CoV-2, но и других микроорганизмов, вызывающих заболевания человека, выявлению как известных, так и потенциально новых вариантов патогенов. К сентябрю 2024г на указанном ресурсе было размещено >365 тыс. последовательностей геномов различных патогенов, в т.ч. SARS-CoV-2, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусов гепатитов В и С, гриппа, норо- и ротавирусов, а также Varicella Zoster Virus. Сведения о геномах иных вирусов герпеса, вызывающих заболевания человека, на настоящий момент в банке генетической информации системно не представлены.

Целью работы стала оценка данных о вариабельности генетических последовательностей ВЭБ, полученных в ходе отечественных исследований, и возможности их интеграции в банк данных VGARus для последующего использования в рамках эпидемиологического надзора.

Материал и методы

Для проведения настоящего исследования был осуществлен поиск научных публикаций по следующим ключевым словам: "генетические последовательности вируса Эпштейна-Барр". Поиск проводился в библиографических базах данных PubMed, eLibrary, Cyberleninka. Глубина поиска составила 10 лет. Ограничения по территориальному признаку установлены не были.

Количество работ, найденных в ходе поиска, по ключевым словам, составило 5107, из которых по результатам оценки на соответствие цели исследования отобрано 76 резюме. Полные тексты были доступны для 33 статей, которые в последующем включены в настоящее исследование.

Результаты

ВЭБ относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Gammaherpesvirinae. Геном вируса, представленный двуцепочечной дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК), содержащей >85 генов, имеет много повторяющихся областей, что существенно затрудняет его анализ. В настоящий момент исследования сфокусированы на изучении нуклеотидных последовательностей отдельных генов ВЭБ, среди которых основной акцент сделан на EBNA2, EBNA3 и LMP1 [14].

Интерес к перечисленным генам обусловлен тем, что первые два из них определяют существование основных типов ВЭБ — 1 (А) и 2 (В), идентичность которых по гену EBNA2 составляет 51%, а EBNA3 — 71% [15]. Особое внимание к изучению гена LMP1 связано с его ролью в ассоциированном с ВЭБ канцерогенезе [16]. В зарубежной литературе приводятся сведения о наличии десяти вариантов данного гена (дикий В95-8; Аляска (Ala), Китай (Ch1) и (Ch2), Средиземноморье (Med+) и (Med-), Северная Каролина (NC), Юго-Восточная Азия 1 и 2 (SEA1 и SEA2), Аргентина (Arg)), названных по региону, где они были впервые обнаружены [17-19]. Однако это не указывает на географическую привязку выявленных геновариантов, т.к. они встречаются и в других регионах мира. Последовательности других генов ВЭБ изучены в меньшей степени, либо не исследовались совсем.

В последние годы в мире были разработаны и внедрены методы высокопроизводительного секвенирования NGS (next generation sequencing), использование которых позволило исследователям существенно продвинуться в изучении полногеномных последовательностей ВЭБ; были выделены азиатская и неазиатская группы вируса, привязанные к конкретным географическим местностям [19][20]. Несмотря на то, что указанные методы существенно нивелировали проблему считывания повторяющихся областей, отсутствие единого стандарта сборки окончательной последовательности генома ВЭБ не позволяет на современном этапе проводить эффективное сопоставление данных, полученных разными учеными [19], и возвращают исследования на этап оценки нуклеотидных последовательностей отдельных генов.

В Российской Федерации (РФ) результаты полногеномного секвенирования ВЭБ в доступной литературе не описаны. Единичные работы содержат сведения о частоте обнаружения двух основных генотипов вируса (таблица 1).

Так, в ходе исследования, проведенного в Нижнем Новгороде, установлено, что у детей 1-15 лет генотип ВЭБ 1 (А) встречался в 100% при наличии у них клинических проявлений инфекционного мононуклеоза, и в 96,6% при отсутствии данного заболевания. Частота выявления ВЭБ 2 (В) составила 0 и 3,4%, соответственно [21].

Генотипирование ВЭБ у лиц >18 лет в России проводили в группе медицинских работников столичного региона, где показатель выявления ВЭБ 1 (А) составил 95,7%, ВЭБ 2 (В) — 2,15%, еще в 2,15% случаев установлено сочетание обоих генотипов у одного человека³.

В другом исследовании у взрослого населения Московской области, имеющего славянские корни, также доминировал ВЭБ 1 (А) — 81%, при этом в 19% исследованных образцов был идентифицирован ВЭБ 2 (В). Преобладание ВЭБ 1 (А) выявлено и у коренного населения Республики Татарстан — 83% [22].

В то же время, в отдельных регионах РФ частота обнаружения генотипов ВЭБ может иметь иное соотношение. Например, в Республике Адыгея среди лиц, исторически проживающих на данной территории, ВЭБ 2 (В) был идентифицирован в 81% образцов. Показатель выявления ВЭБ 1 (А) и ВЭБ 2 (В) среди коренного населения Калмыкии составил 51 и 49%, соответственно [22]. Интересно, что в ходе изучения территориальных особенностей эпидемического процесса ВЭБ-инфекции в различных субъектах РФ, именно в Республике Калмыкия был зарегистрирован один из самых низких уровней заболеваемости инфекционным мононуклеозом на фоне высокой серопревалентности к ВЭБ детского населения, значимо превышающей таковую в других регионах и в стране в целом. Кроме того, частота выявления ДНК ВЭБ в слюне взрослого населения Калмыкии составила 77,6% и была самой высокой для данной возрастной группы из 16 анализируемых регионов страны [23]. Это дает основания для продолжения поиска, в т.ч. основанного на оценке принадлежности ВЭБ к одному из генотипов, изучения последовательностей отдельных генов, а также внедрения методов полногеномного секвенирования.

В настоящий момент большинство исследований, проведенных в РФ, сконцентрировано на изучении последовательностей LMP1 и их вероятной связи с онкогенезом [24].

Отечественными исследователями установлено, что у инфицированных ВЭБ здоровых индивидуумов, лиц, больных инфекционным мононуклеозом, и пациентов с онкологической патологией в совокупности преобладал дикий В95-8 вариант гена LMP1, на долю которого в целом пришлось 45,4%. Среди прочих геновариантов наиболее часто встречались Med+, NC и Med-. Также обнаружены единичные находки вариантов Ch1 и Ch2. Различий в частоте обнаружения вариантов гена LMP1 в зависимости от наличия патологического состояния и его характера выявлено не было [25].

Отдельный интерес представляет поиск особенностей гена LMP1 ВЭБ, выделенного от населения разных регионов нашей страны. Несмотря на то, что исследования, посвященные данному вопросу, ставят своей целью поиск связи между вариантами данного гена и частотой развития онкологических заболеваний, полученные в ходе них данные заслуживают внимания с позиции эпидемиологического надзора, т.к. могут быть использованы в качестве основы для формирования молекулярно-генетического мониторинга ВЭБ в РФ.

Так, в группе этнических татар Поволжья был обнаружен вариант LMP1 (Tat^K), содержащий две уникальные делеции 5 а.к. в кодонах 312-316 и 382-386. Данный вариант не был выявлен в образцах, изолированных от россиян других национальностей, а также в международных банках генетической информации, в результате чего авторами исследования высказано предположение о том, что вариант Tat^K сформировался в период образования в Поволжье Казанского ханства после выделения его из состава Золотой Орды [26, 27].

В то же время, сопоставление последовательностей LMP1, выделенного от татар Поволжья, с данным геном ВЭБ, изолированным от представителей адыгейцев и калмыков, показало наличие между ними генетического родства. Аналогичные сравнения LMP1 ВЭБ, полученного от поволжских татар и славян, проживающих в Москве, обнаружило большее число различий. Так, в гене LMP1 славян отсутствовали мутации в домене CTAR1, характерные для трех других этносов, а число мутаций в доменах CTAR2 и CTAR3 было увеличено [28].

Исследования, проведенные в Хабаровском крае, показали, что среди коренного населения нанайцев и мигрантов из европейской части России дикий В95-8 вариант гена LMP1 встречался в 26,2 и 25,0% исследованных образцов. Частота выявления геноварианта Med+ составила 21,1 и 17,9%; Med- — 21,1 и 14,3%; NC — 15,8 и 21,4%; Ch1 — 15,8 и 21,4%, соответственно. При этом варианты Ala и Ch2 обнаружены не были. Несмотря на существенное сходство в частоте выявления отдельных вариантов LMP1, в образцах, выделенных от нанайцев, были идентифицированы аминокислотные замены в позициях 212, 328 и 399, отсутствующие у мигрантов из европейской части России [29], что, в свою очередь, может являться следствием относительно изолированного существования коренных народов от прочего населения и определять особенности течения эпидемического процесса ВЭБ-инфекции среди них.

Подобные сопоставления представляют интерес не только с позиции поиска различий, но и установления эпидемиологических связей между группами населения и отдельными индивидуумами. Так, сопоставление последовательностей LMP1 у больных инфекционным мононуклеозом детей Нижегородской области с информацией из международных банков генетических данных позволил установить наличие общей мутации D250N с изолятами из Сербии. При этом, оценка скорости эволюции LMP1 в исследуемых образцах показала время происхождения их ближайшего общего предка — 1923г, что соотносится с периодом массовой русской эмиграции в этот регион во время гражданской войны [30].

Проведенные исследования наглядно свидетельствуют о том, что изучение распространенности основных генотипов ВЭБ и последовательностей гена LMP1 позволяют выдвинуть предположения о "географических маршрутах распространения" ВЭБ и происходящих с вирусом изменениях, включая появление новых вариантов. Однако следует отметить, что ген LMP1 участвует в реализации латентной фазы ВЭБ-инфекции, в то время как больший интерес с эпидемиологической точки зрения будет представлять информация о вариабельности генов ВЭБ, ответственных за литическую репродукцию вируса и его взаимодействие с организмом хозяина.

Единственное исследование отечественных авторов, проведенное в этом направлении, касается изучения вариабельности гена, кодирующего поверхностный гликопротеин gp350, участвующий в проникновении вируса в клетки хозяина и рассматриваемый зарубежными учеными в качестве основы для создания потенциальных вакцин против ВЭБ-инфекции. Изучение последовательностей gp350 с эпидемиологической точки зрения представляется наиболее перспективным, т.к. помимо выявления особенностей вируса, позволит в дальнейшем разработать подходы к специфической профилактике ВЭБ-инфекции. Кроме того, авторам исследования удалось установить связь между участниками эпидемического процесса. Всего было исследовано 30 образцов, соответствующих типу ВЭБ 1 (А), полученных от условно здоровых медицинских работников 4-х стоматологических клиник г. Москвы. При сопоставлении последовательностей gp350 российских образцов с данными аналогичных исследований, представленными в генетическом банке NCBI (National Center for Biotechnology Information) США, установлено, что отечественные образцы не формировали отдельной клады и равномерно распределялись по филогенетическому дереву [31].

В то же время, gp350 ВЭБ, выделенный от медицинских работников стоматологических клиник, содержал в совокупности 15 уникальных аминокислотных замен и одну делецию, отсутствующие в образцах из других регионов мира. Именно наличие уникальных мутаций позволило достоверно установить эпидемиологические связи между обследованными лицами. Все исследованные образцы были представлены 22 индивидуальными профилями gp350, из которых только три встречались одновременно у нескольких медицинских работников. Профиль № 13 имел максимальное сходство с другими образцами, информация о которых была представлена в банке генетических данных NCBI и встречался у сотрудников всех 4-х стоматологических клиник, включенных в исследование. Наибольший интерес представили профили № 5 и 6, каждый из которых встречался у двух сотрудников одной и той же клиники, работающих в паре — врач и ассистент стоматолога. И если профиль № 5 отличался от референсного штамма B95-8 (NC_007605.1) только делецией в позициях 593-613, то профиль № 6 помимо двух делеций, встречающихся в других регионах мира (del 540-560, del 593-613), имел уникальную мутацию Q853K, наличие которой стало убедительным доказательством эпидемиологической взаимосвязи и подтвердило существование риска профессионального инфицирования ВЭБ в условиях стоматологической клиники [31].

Заключение

Все приведенные в настоящем обзоре данные были извлечены из научных публикаций. Информация о геномных последовательностях ВЭБ, полученных в ходе проведенных исследований, ни в одном случае не была депонирована в российский генетический банк, что существенно осложняет научный поиск и не позволяет в полной мере сопоставить разрозненные сведения.

На настоящий момент число исследований, содержащих данные о генетических последовательностях ВЭБ в РФ, крайне мало. Однако уже сейчас результаты проанализированных работ содержат важные с позиции эпидемиологии сведения и свидетельствуют о наличии особенностей ВЭБ, циркулирующих в разных субъектах нашей страны. Установлены территориальные различия в соотношении двух генотипов ВЭБ, выявлен новый вариант гена LMP1 Tat^K у татар Поволжья, обнаружены отличия российских образцов ВЭБ по гену, кодирующему поверхностный гликопротеин gp350, от таковых из других регионов мира. Кроме того, проведенные исследования позволили проследить "пути миграции" ВЭБ и определить эпидемиологические связи между сотрудниками одного коллектива.

Депонирование информации о расшифрованных последовательностях в банк генетических данных с возможностью последующего сопоставления с другими образцами позволит заложить основу молекулярно-генетического мониторинга ВЭБ в нашей стране, изучать изменчивость вируса и ее влияние на течение эпидемического процесса, разрабатывать адекватные меры противодействия, включая специфическую иммунопрофилактику.

На современном этапе продолжается активное депонирование результатов секвенирования в VGARus, включая соответствующие метаданные. Платформа VGARus даёт возможность вести постоянный мониторинг мутационной изменчивости вирусов, предоставляя важнейшие данные для обнаружения новых геновариантов и осуществлять оперативный и ретроспективный анализ их распространённости на территории России [32][33]. Расширение возможностей банка данных VGARus путем включения информации о геномных последовательностях всех циркулирующих на территории РФ патогенных для человека микроорганизмов потребует проведения масштабной работы, учитывающей технические особенности, требования биологической и информационной безопасности. В настоящее время все научные учреждения России, занимающиеся секвенированием геномов коронавируса и зарегистрировавшиеся на портале в качестве пользователей, имеют возможность выложить изучаемые геномные последовательности в VGARus. Полученные регистрационные удостоверения позволяют её участникам использовать информацию национальной базы данных. Доступ к платформе осуществляется через портал genome.crie.ru.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.