Поиск новых биомаркеров для создания технологий в прогнозировании перинатального исхода беременности, осложненной гестационным диабетом

Введение

Гестационный сахарный диабет (ГСД) — наиболее распространенное нарушение метаболизма во время беременности, характеризующееся впервые возникшей гипергликемией и нарушением толерантности к глюкозе. Его общая мировая стандартизированная распространенность достигает 14,0% [1]. ГСД ассоциирован с повышенным риском целого ряда осложнений, включая преждевременные роды, преждевременный разрыв плодных оболочек, макросомию и дистресс плода. Макросомия, в свою очередь, повышает риск родового травматизма как для плода (дистоция плечиков), так и для матери (травмы родовых путей, кровопотери), а также увеличивает вероятность оперативного родоразрешения. В отдаленном периоде женщины, перенесшие ГСД, более подвержены риску развития сахарного диабета (СД) 2 типа, ожирения и сердечно-сосудистых заболеваний [1].

Стандартные диагностические тесты на ГСД, такие как определение уровня гликемии и пероральный глюкозотолерантный тест на 24-28 нед. беременности, хотя и снижают риск осложнений при своевременном назначении диеты, не являются гарантией нормогликемии и отсутствия диабетической фетопатии (ДФ) на более поздних сроках [1]. В связи с этим актуальным является поиск ранних и более точных предикторов негативных исходов.

Современные методы диагностики, включая устройства непрерывного мониторинга глюкозы и омиксные технологии, открывают новые возможности для прогнозирования перинатальных исходов у пациенток с ГСД [2][3]. В частности, успехи, достигнутые с применением мультиомных подходов (геномика, транскриптомика, протеомика, метаболомика) трансформируют методы раннего выявления ГСД и оценки рисков [4]. Исследования в этой области сосредоточены на идентификации биомаркеров в разные триместры: прогностических молекул на ранних сроках и маркеров диагностики и исходов — на поздних [4].

Ключевым этапом для построения адекватной прогностической модели является валидация качественных и количественных показателей лабораторных и клинических маркеров ГСД и ДФ. Для создания такой модели необходимо формирование банка биологического материала с сопутствующей детальной клинико-анамнестической информацией, начиная с первого триместра беременности. Логика настоящего исследования заключалась в следующем: на первом этапе поиск ключевых метаболитов и маркеров был проведен в материале, полученном в доношенном сроке при известном перинатальном исходе. Результаты исследований первого этапа представлены в настоящей работе. На следующем этапе планируется измерение найденных маркерных показателей в биологическом материале первого триместра с целью создания ранней диагностической панели.

Материал и методы

В исследование были включено 83 женщины в возрасте 18-45 лет, в сроке беременности 34 нед. 1 день — 41 нед. 6 дней.

Критериями включения в основную группу (ГСД+) являлось наличие ГСД, в группу сравнения (ГСД-) включались практически здоровые беременные с нормовесными плодами.

Из 47 женщин с ГСД в 21 случае зарегистрирована макросомия новорожденного (ГСД+М+), в 26 случаях — нормосомия (ГСД+М-). Масса новорожденных от матерей без ГСД не превышала 90 процентиля.

Критериями невключения в исследование являлись хронические заболевания в стадии декомпенсации, острые инфекционные заболевания и заболевания в стадии обострения, многоплодная беременность, психические расстройства, наличие СД 1 и 2 типов, а также отказ пациентки от участия в исследовании.

Клиническое исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом (протокол № 9417 от 27.03.2023). Все пациенты подписали информированное согласие на исследование.

С целью выполнения исследований были сформированы коллекции образцов плазмы и лейкоцитарной фракции крови беременных, амниотической жидкости, плазмы крови пуповинного остатка. Для получения плазмы крови и лейкоцитарной фракции цельная венозная кровь роженицы и пуповинная кровь забирались в пробирку с антикоагулянтом (К₃-ЭДТА), амниотическая жидкость — в коническую пробирку. В банке биологического материала выполнялись аликвотирование амниотической жидкости и пробоподготовка цельной крови. Плазму крови и лейкоцитарную фракцию получали путем центрифугирования при 2000 g в течение 15 мин (центрифуга LMC-4200R, BioSan, Латвия), последовательного отбора лейкоцитарной фракции и плазмы, аликвотирования в криопробирки. Полученные образцы биоматериала немедленно замораживали и хранили при температуре не >-80 ^оС.

Проведены иммуноферментный, молекулярно-генетический, масс-спектрометрический анализ образцов крови матери и пуповинной крови и амниотической жидкости. В материнской плазме исследованы концентрации 6 белков методом иммуноферментного анализа. Использовали соответствующие диагностические тест-системы производства компаний "BlueGene Biotech", "Cloud-Clone Corp." (Китай) для определения уровня ингибитора активатора плазминогена 1 типа (PAI-1), рецептора растворимого эндотелиального фактора роста сосудов (sVEGFR1), гомоцистеина, кисспептина 1 (KISS1), плацентарного фактора роста (PGLF) и тканевого активатора плазминогена (tPA) в соответствии с инструкцией производителя.

Кроме того, в материнской плазме определены уровни естественных регуляторных аутоантител класса IgG, связывающихся с двуспиральной дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК), Fc фрагментом иммуноглобулина (ревматоидный фактор), коллагеном, хорионическим гонадотропином человека (ХГЧ), тиреоглобулином, инсулином, белком S100, β2-гликопротеином, мембранным антигеном сперматозоидов SPR, белком паренхимы почек и белком мембран тромбоцитов с использованием набора иммунореагентов ЭЛИ-П-Комплекс (производитель МИЦ "Иммункулус", г. Москва) согласно инструкции.

Для выделения ДНК из лейкоцитарной фракции использовали набор реагентов "ПРОБА-РАПИД-ГЕНЕТИКА" (ООО "ДНК-технология ТС", г. Москва) согласно инструкции. Полиморфизм генов F2, F5, F7, F13, FGB, PAI1, ITGA2, ITGB3, ассоциированных с нарушениями свертывающей системы крови, выявляли в крови матери при помощи набора реагентов "Генетика гемостаза" (ООО "ДНК-технология ТС", г. Москва) методом полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени и анализе кривых плавления.

В плазме материнской и пуповинной крови, амниотической жидкости проведен масс-спектрометрический анализ метаболитов сыворотки крови в лаборатории трансляционной медицины на тандемном квадрупольном масс-спектрометре Waters Xevo TQ-S Micro в комплекте с ВЭЖХ Acquity UPLC H-Class, Waters Corporation, США, 2023. Использовалось встроенное программное обеспечение MassLynx V4.2 IntelliStart™. Масс-спектрометрические данные были обработаны с использованием многофакторного (OPLS-DA) анализа. Анализ на масс-спектрометре проводился в режиме мониторинга множественных реакций (MRM), который заключается в выделении иона-предшественника целевого соединения, его распаде в коллизионной ячейке и фильтрации полученных ионов-продуктов, которые попадают в детектор. Единицей измерения в масс-спектрометрии является отношение массы к зарядовому числу (m/z).

Статистическую обработку полученных результатов выполняли с использованием пакета прикладных программ Statistica 12.0. Для описания качественных данных использованы абсолютные и относительные частоты, количественных данных — описательный анализ. Для сравнения качественных данных использовали критерий χ² с поправкой Йейтса. Для сравнения непараметрически-распределенных количественных данных применяли критерий Манна-Уитни. Уровень значимости p<0,05.

Результаты

Общая схема исследования и анализ биоматериала были направлены на комплексную оценку молекулярных нарушений при ГСД по трем основным направлениям: 1) оценка общесоматического статуса и генетической предрасположенности; 2) анализ системы гемостаза и регуляторных белков; 3) изучение метаболомного профиля матери и плода. Такой многоуровневый подход позволяет выявить взаимосвязанные патогенетические звенья, ассоциированные с развитием макросомии и других осложнений ГСД.

При анализе клинико-анамнестических данных было установлено, что индекс массы тела (ИМТ) был значимо выше в общей группе родильниц с диагнозом ГСД+ по сравнению с контрольной группой (ГСД-) (таблица 1). Аналогичные различия были отмечены для плазменных концентраций глюкозы и фибриногена. При этом молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов системы гемостаза в исследованной выборке не выявил наличия мутаций высокого тромбогенного риска в генах F5 и F2. Ключевой находкой стала ассоциация полиморфизма гена фибриногена (FGB-455 G/A) не только с развитием ГСД (р=0,008), но и с необходимостью назначения инсулинотерапии для достижения нормогликемии (р=0,03).

При сравнении подгрупп с наличием (ГСД+М+) и отсутствием (ГСД+М-) макросомии на фоне ГСД были обнаружены достоверные различия по степени плацентомегалии (р=0,011), предполагаемой массе плода (р=0,001) и массе новорожденного (р=0,023).

Анализ концентрации регуляторных белков в материнской плазме не показал значимых межгрупповых различий в балансе плацентарного фактора роста (PGLF) и его растворимого рецептора (sVEGFR1), а также в уровнях KISS1 и гомоцистеина (таблица 2). При исследовании фибринолитического баланса было выявлено, что нормосомия при ГСД ассоциирована достоверно более низкой концентрацией tPA в материнской плазме по сравнению со здоровым контролем (р=0,001). При этом уровень tPA у матерей, родивших новорожденных с макросомией, практически не отличался от показателей контрольной группы. Концентрация ингибитора PAI-1 оставалась относительно стабильной во всех группах.

С помощью иммуноферментного анализа были обнаружены различия в профиле "эмбриотропных" аутоантител в зависимости от метаболического статуса. Аномальный уровень аутоантител к ХГЧ был зарегистрирован в общей группе ГСД+. Кроме того, макросомия плода в данной выборке ассоциировалась с изменением титра антител к тромбоцитам и белку S100 (таблица 3). При сравнении подгрупп внутри группы ГСД+ было выявлено, что у рожениц с более тяжелым течением ГСД, потребовавшим назначения инсулинотерапии, достоверно изменялись уровни антител к ХГЧ (р=0,02), двухцепочечной ДНК (р=0,03), инсулину (р=0,03) и S100 (р=0,04).

Масс-спектрометрический количественный анализ аминокислот был проведен в биологической жидкости трех типов: плазме материнской крови, пуповинной крови и амниотической жидкости. В плазме крови рожениц с ГСД были зарегистрированы статистически значимо более низкие концентрации триптофана и γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) по сравнению с контрольной группой (таблица 4). Детальный анализ показал, что степень снижения концентрации ГАМК имела прямую зависимость как от наличия ГСД у матери в сочетании с макросомией у ребенка (р=0,025), так и от превышения матерью порога ИМТ >25 кг/м² (р=0,011). Схожая зависимость от ИМТ матери была выявлена и для концентрации триптофана (р=0,023).

Масс-спектрометрический анализ пуповинной плазмы выявил значимые различия в концентрации аминокислот как при сравнении групп с ГСД и нормогликемией, так и внутри группы ГСД в зависимости от наличия макросомии (таблица 5). В пуповинной крови новорожденных от матерей с ГСД были зарегистрированы более низкие концентрации метионина. Макросомия ассоциировалась с увеличением концентраций таких аминокислот, как изолейцин, цитруллин, серин и треонин. Исследованные аналиты могут рассматриваться в качестве потенциальных маркеров ДФ.

Анализ амниотической жидкости показал, что при ГСД у матери в ней содержится значимо бóльшая концентрация аминокислот валина и лейцина. Макросомия плода была ассоциирована со снижением уровня лизина в околоплодных водах (таблица 6).

Обсуждение

Выявленные в настоящем исследовании различия метаболического статуса, гемостаза, характера аутоиммунных реакций и концентрации регуляторных белков в целом укладываются в современную концепцию ГСД. Можно предположить, что маркерами супрафизиологической инсулинорезистентности беременности и последующего развития ДФ будут метаболиты, ассоциированные с девиацией иммунного ответа в сторону провоспалительных реакций, дисфункцией эндотелия, гиперкоагуляцией и гипофибринолизом.

Так, аналогично нашим данным, в опубликованных исследованиях небольших выборок при ГСД зарегистрировано снижение концентрации триптофана в материнской крови. При СД 2 типа подобный эффект достаточно исследован и связывается, как правило, с активацией индоламин-2,3-диоксигеназы и триптофан-2,3-диоксигеназы за счет провоспалительных цитокинов, повышенным катаболизмом триптофана вследствие активации кинуренинового пути. Один из метаболитов — ксантуреновая кислота — нарушает продукцию и рецепцию инсулина β-клетками поджелудочной железы [5][6].

В исследованной выборке уровень триптофана отрицательно коррелировал с ИМТ матери. Повышенная потребность в синтезе белка при патологическом увеличении массы тела матери и плода замыкают порочный круг дефицита триптофана и усиления инсулинорезистентности. Дефицит таких производных триптофана, как серотонин и мелатонин, в свою очередь приводит к накоплению активных форм кислорода и цитокинов Th1 профиля. Можно надеяться на клиническую эффективность раннего выявления сниженной концентрации триптофана относительно референсных значений, поскольку экспериментально доказано, что дотация мелатонина позитивно влияет уже на первые этапы эмбриогенеза [7].

Зарегистрированная нами более низкая концентрация ГАМК в материнской плазме с прямой зависимостью степени снижения как от наличия ГСД у матери при макросомии у ребенка, так и от превышения ИМТ матери порога 25 кг/м² также имеет значение в патогенезе метаболических нарушений. ГАМК является важным нейротрансмиттером, который играет ключевую роль в регуляции деятельности нервной системы и метаболических процессов. Крупная молекула не проходит через плаценту, но А-рецептор ГАМК, связываясь с аллопрегнанолоном, модулирует плацентарный ионный транспорт и сосудистый тонус, регулируя обменные процессы матери и плода [8]. Во время беременности, осложненной ГСД, гипергликемия может нарушить ГАМК-ергическую систему в префронтальной коре головного мозга, включая синтез нейротрансмиттеров ГАМК и количество нейронов, использующих ГАМК. Последствием нарушений будет дальнейшее подавление секреции инсулина β-клетками поджелудочной железы, нарушение миграции и жизнеспособности трофобласта, долгосрочные изменения в гиппокампе, гипоталамусе и неокортексе плода [9].

В качестве обоснования того, что найденные изменения аминокислотного состава материнской крови можно будет зарегистрировать и в первом триместре для использования в качестве ранних биомаркеров, исследованы основные звенья патогенеза. Так, повышение коагуляционного потенциала, включая накопление фибриногена, характерно в норме для поздних сроков беременности, но при ожирении супрафизиологическая гиперкоагуляция является звеном общего патогенеза и обусловлена взаимосвязанными механизмами, включающими дисбаланс факторов свертывания, нарушение фибринолиза, гиперактивность тромбоцитов, эндотелиальную дисфункцию и воспаление [10]. К примеру, одной из причин повышения уровня фибриногена является зарегистрированная в данной выборке значительная доля носительства аллеля А в гене фибриногена FGB-455. Данная генетическая вариация сопряжена с резким увеличением плазменной концентрации первого коагуляционного фактора [11]. Повышенный титр антитромбоцитарных антител, найденный в группе беременных с ГСД, является еще одним свидетельством претромботической готовности вследствие дисфункции эндотелия.

Дисбаланс системы фибринолиза присутствует при нарушении углеводного обмена вне и во время беременности. Опубликованы данные о значительном увеличении уровня PAI-1, который подавляет активность tPA. Это приводит к состоянию гипофибринолиза, повышая риск тромботических осложнений [12]. Физиологически концентрации tPA и PAI-1 растут со сроком беременности до родов [13]. В данной выборке минимальная концентрация тканевого активатора была в группе "компенсированного" ГСД без макросомии. Учитывая ассоциацию дисбаланса фибринолиза в сторону PAI-1 с плацентарной дисфункцией, подтверждение его в группе с наименьшей массой тела новорожденного можно рассматривать не как отсутствие фетопатии, а как ограничение роста плода. В этой связи целесообразно будет проследить дальнейшее развитие "нормовесных" при рождении детей и провести подобное исследование в группе новорожденных с задержкой роста плода и малых к сроку гестации. Также целесообразна одновременная оценка концентрации tPA и его активности.

Измененный профиль аутоиммунных антител в крови родильниц находит объяснение в патогенезе ГСД и его осложнений. Обнаруженное в изучаемой выборке изменение титра регуляторных аутоантител к ХГЧ было ассоциировано с развитием ГСД и необходимостью инсулинотерапии для достижения нормогликемии. В исследовании Liu Y, et al. показано, что более высокие концентрации ХГЧ на ранних сроках беременности связаны со снижением риска развития ГСД, а далее коррелируют с более низким постпрандиальным уровнем глюкозы во время перорального теста на толерантность к глюкозе [14]. Поддерживая иммунологическую толерантность при беременности, ХГЧ увеличивает присутствие регуляторных Т-клеток, усиливает продукцию интерлейкина-2 и VEGF наивными NK-клетками и за счет противовоспалительного действия снижает вероятность развития и прогрессирования метаболических нарушений [15]. Таким образом, блок рецепции ХГЧ ассоциирован с усилением синтеза провоспалительных цитокинов с последующим окислительным стрессом и усилением апоптоза.

Супрафизиологическому апоптозу соответствует и изменение уровня антител к нативной ДНК и белку S100. Белок S100, который кроме глиальных клеток нервной ткани содержится в адипоцитах, рассматривается как один из маркеров повреждения нервной ткани в отсроченной на 3-5 лет перспективе для детей от матерей с ГСД¹.

Накопление контринсулярных антител второго порядка (АТ2) в материнском кровотоке и их трансплацентарный перенос чаще обсуждается при СД 1 типа, но может быть значимым звеном патогенеза и для ГСД, поскольку данные иммуноглобулины способны специфически связываться с инсулиновыми рецепторами, имитируя действие гормона или блокируя его. Их избыток может повышать толерантность к глюкозе в краткосрочной перспективе, ингибировать нормальное взаимодействие инсулина с рецепторами, что приводит к инсулинорезистентности. Доказано, что дисбаланс между контринсулярными антителами первого и второго порядка с накоплением АТ2 коррелирует с более тяжелым течением диабета у матери и проявлениями ДФ у плода [16].

Неоднозначные результаты дал анализ баланса регуляторных протеинов материнской крови. В качестве ключевых молекул взяты плацентарный фактор роста PLGF и его растворимый рецептор sFlt, регулирующие основные функции эндотелия микрососудистого русла плацентарного ложа, и кисспептин KISS1 как связующее звено между репродуктивной системой, ангиогенезом и углеводным обменом. В исследованной выборке отсутствовали значимые различия в концентрациях PLGF и sFlt между здоровыми и имеющими диагноз ГСД. Gul Kara SM, et al. опубликовали аналогичные результаты, объясняющие сохранение нормального баланса sFlt/PLGF усиленным при ГСД ангиогенезом [17]. Данный факт подтверждает сформированное при изучении преэклампсии мнение некоторых авторов, что при несомненном наличии эндотелиальной дисфункции и системного воспаления в патогенезе обоих состояний, гипергликемия несколько нивелирует дисфункцию эндотелия, замедляя прогрессирование преэклампсии [18]. Существует и противоположное мнение о выраженном изменении баланса при СД 1 типа и уже развившейся преэклампсии [19][20]. Вероятно, мультифакториальный характер ГСД делает про- и антиангиогенный баланс sFlt/PLGF менее чувствительным к метаболическим изменениям в организме матери и плода.

Отсутствие значимых различий в концентрации KISS1в плазме матери, скорее всего, свидетельствует о сравнимом состоянии синцитиотрофобласта в группах. Исследователи расходятся во мнениях по данному вопросу: опубликованы как сходные результаты подобных исследований [21], так и противоположные данные [22]. Также доказана возможность усиления плацентарной экспрессии KISS1и его рецептора при низком уровне гормона в крови для поддержания функциональной активности [23].

Таким образом, на данном этапе нельзя утверждать, что регуляторные белки могут быть использованы в качестве биомаркеров последующего развития ГСД. Достоверные различия, вероятно, будут найдены в первом триместре, а также в группах критических состояний — задержка роста плода, кардиомиопатия и т.д.

Наличие достоверных межгрупповых различий в метаболоме пуповинной крови и амниотической жидкости подтверждает адекватность подбора групп и позволяет выделить основные пути патогенеза ДФ. По нашим данным наличие макросомии прямо коррелирует с более высокими концентрациями таких аминокислот как изолейцин, цитруллин, серин и треонин. Связь между метаболитами аминокислот, включая ароматические аминокислоты и аминокислоты с разветвленной цепью, и риском ожирения, инсулинорезистентности и СД была установлена >40 лет назад [24]. Патогенез нарушений, связанных с аминокислотами с разветвленной цепью, ассоциирован с накоплением их окисленных метаболитов и прогрессированием инсулинорезистентности. Ключевую роль в этом играет сигнальный путь PTEN/AKT/mTOR (компонентами которого являются фосфоинозитид-3-киназа, киназы AKT и mTOR), регулирующий в т.ч. процессы использования энергетических субстратов и аутофагии [25]. Следует отметить, что достоверных изменений концентрации данных аминокислот в материнской крови перед родами в нашей выборке не обнаружено, хотя доказано, что повышение концентрации этих аминокислот в материнской крови может быть фактором риска развития ГСД [26-28].

В то же время в плазме пуповинной крови новорожденных от матерей с ГСД нами были зарегистрированы более низкие, чем у здоровых, концентрации метионина. Недостаток метионина может приводить к ограничению продукции S-аденозилметионина с последствиями гипометилирования в виде эпигенетических нарушений, к накоплению гомоцистеина с последующей дисфункцией эндотелия и тромбозами. Основными причинами низкого уровня метионина считаются ограничение трансплацентарного переноса материнской аминокислоты плоду и повышенное потребление матерью и плодом. Доказано, что данные процессы опосредованы плацентарными транспортерами глюкозы (например, LAT 1) и регуляторными белками пути mTOR [29]. Низкая концентрация метионина у плода в сочетании с найденным в околоплодных водах дефицитом лизина может служить базой для нарушения белкового синтеза у плода, как одного из проявлений ДФ. Схожие результаты получены несколькими группами ученых [30][31].

Заключение

Негативное влияние метаболических нарушений на течение беременности, а также на состояние новорожденного и дальнейшее развитие ребенка доказано. В настоящем исследовании нашли подтверждение факты того, что развитие ГСД, формирование макросомии плода опосредованы генетическими особенностями, девиацией аутоиммунных реакций и изменением метаболома матери и плода. Найденные факты соответствуют основным патологическим механизмами ГСД — повышению коагуляционного потенциала, смещению баланса в сторону провоспалительной реакции, усилению липолиза и апоптоза, тканевой гипоксии, нарушению синтеза белка и эпигенетической регуляции. Зарегистрированные изменения могут служить ориентиром для поиска предикторов негативного перинатального исхода. Сочетание точного дифференцированного прогноза на основании клинических параметров и систем их постоянного мониторинга, данных омиксных технологий с применением современных методов биоинформатики открывают новые возможности профилактики и терапии. Практически тотальное биобанкирование большой выборки материала с ранних сроков беременности является необходимым условием для такой работы как на этапе исследования, так и при дальнейшей практической работе, поскольку решение о включении в исследование или о необходимости специфической терапии может быть принято позднее. Наличие доступного для анализа биологического материала с ранних сроков беременности до родов позволяет решать научно-практические задачи по поиску новых маркеров метаболических нарушений у матери и плода.