Оптимизация протокола приготовления библиотек для секвенирования циркулирующих микроРНК плазмы и сыворотки

Введение

Малые некодирующие молекулы рибонуклеиновой кислоты (микроРНК) относятся к малым некодирующим рибонуклеиновым кислотам (РНК) (длина ~22 нуклеотида) и участвуют в регуляции экспрессии генов [1]. Циркулирующие микроРНК плазмы и сыворотки крови защищены от деградации с помощью включения в экзосомы и микровезикулы, или же связью с белковыми комплексами [2]. В настоящее время наблюдается значительный рост количества исследований, посвященных изучению потенциала циркулирующих микроРНК в качестве биомаркеров различных заболеваний [3-5].

Накопленные научные данные демонстрируют существенное влияние на профиль циркулирующих микроРНК преаналитических и аналитических факторов, таких как использование биологических образцов разных типов, различных методических подходов, а также отсутствие единых стандартов проведения исследований [6-9].

Секвенирование следующего поколения (NGS, next-generation sequencing) — метод, обеспечивающий высокую чувствительность и специфичность, а также возможность количественного определения и обнаружения новых микроРНК [10]. Этап приготовления библиотек для секвенирования микроРНК может значительно влиять на получаемые результаты, в т.ч. может отражаться на таких параметрах, как покрытие и спектр детектируемых микроРНК [11][12].

На сегодняшний день на рынке представлен ряд коммерческих наборов для подготовки библиотек микроРНК [10][11][13-17]. Среди них одним из наиболее широко используемых и цитируемых в научных публикациях является набор QIAseq miRNA UDI Library Kit (Qiagen, Германия) (далее — QIAseq), важной особенностью которого является наличие уникальных молекулярных идентификаторов (unique molecular identifiers, UMI), позволяющих детектировать дубли, возникающие в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Библиотеки, полученные с помощью набора QIAseq, характеризуются бóльшим разнообразием выявляемых микроРНК, высоким количеством сырых чтений и процентом чтений, картированных на гены микроРНК, а также относительно низким уровнем технических артефактов и более высокой корреляцией с данными количественной ПЦР [10][11][13][15-17].

Несмотря на наличие стандартизированных протоколов от производителей, исследования последних лет демонстрируют, что оптимизация отдельных этапов подготовки библиотек может существенно повысить качество и воспроизводимость данных секвенирования [12][18]. Это особенно актуально при работе с образцами из коллекций биобанков, хранившихся в течение длительного времени, поскольку их качество и степень деградации нуклеиновых кислот могут варьироваться в зависимости от условий хранения и особенностей пробоподготовки [7][8]. Таким образом, даже при использовании коммерчески доступных решений адаптация методики под конкретные исследовательские задачи остается важным аспектом получения достоверных результатов.

Цель настоящего исследования — оптимизировать протокол приготовления библиотек для секвенирования микроРНК на основе коммерческого набора QIAseq miRNA UDI Library Kit для повышения качества получаемых данных.

Материал и методы

Биообразцы. В исследование были включены биообразцы четырех пациентов категории очень высокого сердечно-сосудистого риска из коллекции биобанка ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России [19]. Забор венозной крови был проведен в 2013-2014гг. Исследование одобрено Независимым Этическим Комитетом ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России (протокол № 07-03/12 от 03.07.2012). Все участники дали письменное информированное согласие.

Для получения плазмы кровь собирали в пробирки с антикоагулянтом (K₂ЭДТА), а для сыворотки — в пробирки с разделительным гелем, после чего оставляли при комнатной температуре на 30 мин с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 1200 g при +4 ^оС, а затем отбирали плазму и сыворотку. Далее все образцы хранились в биобанке при температуре -70 ^оС.

Выделение РНК. В 2025г из образцов была выделена тотальная РНК, включая микроРНК. До выделения РНК образцы плазмы и сыворотки после разморозки были подвергнуты центрифугированию при 16000 g в течение 15 мин при +4 ^оС. Супернатант был перенесен в новые пробирки, свободные от нуклеаз. Для выделения был использован набор miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (Qiagen, Германия). Для каждого типа образца РНК была выделена параллельно дважды из одной и той же аликвоты плазмы или сыворотки — из 200 и из 300 мкл.

После выделения концентрацию микроРНК измеряли с помощью набора Qubit microRNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, США) на флуориметре Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, США).

Секвенирование следующего поколения. Из каждого из образцов РНК (плазма/сыворотка, 200 мкл/300 мкл) с помощью QIAseq miRNA UDI Library Kit (Qiagen, Германия) были приготовлены две библиотеки для секвенирования по двум вариантам протокола производителя: для 1 нг РНК с уменьшенным числом циклов ПЦР (22 цикла) и для 10 нг РНК (19 циклов ПЦР).

Для оценки качества приготовленных библиотек определяли их концентрацию на флуориметре Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, США) с помощью набора Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, США) и длину на Bioanalyzer 2100 (Agilent, США) согласно протоколам производителей. NGS было проведено на NextSeq 550 (Illumina, США) по протоколу High Output 1×75 п.н.

Биоинформатический анализ. Обработка UMI проводилась с использованием пакета UMI-tools [20]. Чтения длиной не <14 нуклеотидов были отфильтрованы программой cutadapt [21]. Одноконцевые чтения (fastq) выравнивались на референсный геном GRCh38 с помощью STAR (версия 2.7.10a_alpha_220506) [22]. Далее файлы с выравниванием сортировались и индексировались с использованием Samtools [23]. Аннотирование генов выполнялось программой featureCounts (v2.0.1) [24] с учетом цепь-специфичности и параметрами: -О--largestOverlap -s 1 -t gene -g gene_id. Использовалась аннотация ENCODE v47 [25]. Визуализация данных осуществлялась пакетом ggplot2 в среде R [26].

Статистический анализ. Статистический анализ проводился в среде R 4.2. Непрерывные параметры представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (Me [Q25; Q75]); дискретные — в виде абсолютных значений и относительных частот. Анализ главных компонент (PCA, principal component analysis) выполнялся для центрированных и нормированных данных. Оценка различий между двумя зависимыми выборками проведена при помощи критерия Вилкоксона. Поправка на множественные сравнения проведена методом Холма. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Дизайн исследования

При проведении пилотного секвенирования микроРНК с использованием биообразцов с длительным сроком хранения был выявлен ряд проблем, в т.ч. низкая концентрация получаемых библиотек, большое количество димеров адаптеров, выявляемое на этапе контроля качества библиотек, малое количество чтений на образец (<5 млн). Ранее было показано, что, увеличив исходное количество РНК при приготовлении библиотек и снизив количество циклов ПЦР для уменьшения количества димеров адаптеров, можно улучшить показатели качества при секвенировании [12]. Одним из способов увеличения количества получаемой при выделении РНК является увеличение используемого объема плазмы или сыворотки, поэтому помимо стандартного объема в 200 мкл, мы использовали объем 300 мкл, выбор которого обусловлен тем, что он не приводил к увеличению времени выделения из-за ограничения, накладываемого ёмкостью колонки.

Производитель предлагает пять версий протокола QIAseq, как для ручного, так и автоматического исполнения, различающихся между собой в зависимости от исходного количества микроРНК (500 нг, 100 нг, 10 нг, 1 нг, 5 мкл элюата для сыворотки или плазмы), по степени разбавления адаптеров и праймеров, а также по количеству циклов ПЦР. В качестве возможных альтернатив использовали модифицированный вариант для 1 нг с уменьшенным количеством циклов ПЦР: 3’ адаптер — 1:20; 5’ адаптер — 1:10; праймер — 1:20; 22 цикла, далее "протокол-1нг". Также использовали модифицированный вариант и для 10 нг: 3’ адаптер — 1:5; 5’ адаптер — 1:2,5; праймер — 1:5; 19 циклов, далее "протокол-10нг". Протокол для сыворотки/плазмы ("Serum/Plasma2), используемый изначально, отличается от версии для 10 нг только количеством циклов ПЦР (22 цикла), поэтому он не рассматривался далее для оптимизации.

Таким образом, для каждого типа образца (плазма/сыворотка) было 4 варианта оптимизации (200 мкл/300 мкл; протокол-1нг/протокол-10нг). В каждом варианте оптимизации использовались аликвоты одних и тех же образцов от 4-х человек. При приготовлении библиотек использовалось 5 мкл выделенной РНК, при этом исходное количество микроРНК варьировало от 6 до 21 нг. Дизайн исследования представлен на рисунке 1 и в таблице 1.

Димеры адаптеров

Изначально при работе с набором QIAseq был использован протокол для сыворотки/плазмы и индексы QIAseq miRNA 96 Index Kit IL UDI-A (Qiagen, Германия). При анализе качества и длины полученных библиотек с помощью капиллярного электрофореза был виден пик, соответствующий димерам адаптеров (178 п.н.). Проверка всех реагентов показала, что использование другого набора индексов — QIAseq miRNA 96 Index Kit IL UDI-B (Qiagen, Германия), привело к значительному уменьшению количества димеров адаптеров. Выявленные различия в работе индексов из разных наборов, отчасти, можно объяснить независимым от нас несоблюдением условий хранения и/или транспортировки наборов компаниями-поставщиками. Пример результатов капиллярного электрофореза для библиотек, приготовленных параллельно из одного и того же образца РНК при использовании индексов из разных наборов, приведен на рисунке 2. Несмотря на уменьшение концентрации димеров адаптеров, у некоторых образцов были выявлены другие пики (185-192 п.н. и 208 п.н.), соответствующие фрагментам РНК и другим малым РНК, включая наиболее крупный класс микроРНК (piРНК, (piwi-interacting), отличные от целевого пика (200 п.н.), что, вероятно, также может приводить к снижению количества чтений, картированных на гены микроРНК [11].

Сравнение разных вариантов оптимизации протокола

Сравнительные характеристики исследуемых групп приведены в таблицах 2 и 3, а также на рисунке 3. Статистически значимых различий между 8 группами (по 4 образца в каждой) получено не было. Это может быть объяснено небольшим размером выборки и использованием рангового теста Вилкоксона, что, на наш взгляд, оправдано в силу сложности распределения исследуемого параметра (таблица 2).

В таблице 3 представлены результаты по группам, объединенным по следующим параметрам (n=16): тип биообразца (плазма/сыворотка); объем биообразца, использовавшийся при выделении РНК (200/300 мкл); протокол приготовления библиотек (протокол-1нг/протокол-10нг). При сравнении групп сыворотки и плазмы статистически значимо различались показатели концентрации микроРНК после выделения тотальной РНК и количество тегов на млн прочтений (TPM, tags per million reads) на образец по генам человека; при сравнении групп, в которых для выделения РНК были использованы 200 и 300 мкл исходного биообразца (сыворотки или плазмы) — показатели концентрации микроРНК после выделения тотальной РНК; при сравнении групп образцов, приготовленных с использованием разных версий протокола — количество картированных чтений, попавших в границы генов, показатели TPM на образец по генам человека и по генам микроРНК, а также количества экспрессированных микроРНК.

Анализ с помощью метода главных компонент

Для определения однородности полученных данных был использован метод PCA, с помощью которого на основании данных об уровне экспрессии генов микроРНК человека (версия генома ENCODE v47) была показана относительная однородность изучаемых групп (рисунок 4).

Обсуждение

Согласно результатам ряда сравнительных исследований, набор QIAseq miRNA Library Kit обеспечивает высокое качество подготовки библиотек [10, 11, 13-17]. Однако при работе с образцами с низким содержанием микроРНК (плазма или сыворотка крови) или биообразцов с длительным сроком хранения для улучшения показателей секвенирования может потребоваться дополнительная оптимизация протокола [18]. Поиск литературы показал, что было опубликовано два исследования, направленных на оптимизацию протокола приготовления библиотек QIAseq miRNA Library Kit: Rodgers O, et al. (2025) [18] и Hasby F, et al. (2025) [12].

В исследовании Rodgers O, et al. (2025) проводили оптимизацию для образцов плазмы небольшого объема (100 мкл), используемых в педиатрии [18]. В работе было изучено влияние ряда модификаций протокола на выход библиотек: предварительное концентрирование образцов РНК, использование разных разведений адаптеров и праймеров для обратной транскрипции и количества циклов амплификации. Кроме того, были внесены изменения в этапы очистки с использованием магнитных частиц, однако их влияние сравнительной оценке не подвергалось. Наибольшая концентрация библиотек была достигнута при использовании версии протокола производителя для 1 нг РНК (1:20-1:10-1:20-24 цикла), который был выбран авторами для дальнейшего использования. Однако отсутствие данных по показателям секвенирования затрудняет сопоставление их результатов с нашими.

В работе Hasby F, et al. (2025) для 10 нг исходной микроРНК максимальные концентрации библиотек и количество сырых чтений были получены при использовании протокола с наибольшим числом циклов амплификации. В то же время для 1 нг исходной микроРНК, при увеличении числа циклов амплификации и степени разведения адаптеров, возрастала доля димеров адаптеров. Также при увеличении числа циклов амплификации и степени разведения адаптеров как при 10 нг, так и при 1 нг исходной микроРНК, возрастала доля чтений, исключаемых из анализа после дедупликации по UMI и снижалось количество детектируемых микроРНК [12].

В настоящем исследовании сравнение двух версий протокола (протокол-1нг и протокол-10нг) выявило статистически значимые различия для показателей количества картированных чтений, попавших в границы генов, TPM на образец по генам человека и по генам микроРНК, а также по количеству экспрессированных микроРНК. Наилучшие результаты были получены при использовании протокола-10нг, который предусматривал: в 4 раза более высокие концентрации адаптеров и праймеров для обратной транскрипции; на 3 цикла ПЦР меньше. Протокол производителя для 10 нг исходной РНК даже при меньшем фактическом количестве показал более высокие значения TPM, что согласуется с выводами Hasby F, et al. (2025) [12].

В этой же работе [12] показано, что с увеличением исходного количества микроРНК возрастают концентрации получаемых библиотек, снижается доля димеров адаптеров и доля чтений, элиминируемых при дедупликации, а также увеличивается число детектируемых микроРНК. Однако в этом исследовании использовался коммерческий образец тотальной РНК с 10-кратными различиями в количестве (1, 10 и 100 нг).

При работе с образцами с низким содержанием микроРНК одним из возможных подходов к увеличению исходного количества микроРНК может быть концентрирование. Однако данные о его эффективности противоречивы. Так, Rodgers O, et al. (2025) продемонстрировали, что концентрирование РНК увеличивает концентрации получаемых библиотек [18], тогда как Grieco GE, et al. (2021) не наблюдали улучшения показателей при сокращении объема с 18 мкл до 5 мкл. В их работе концентрирование не повлияло на выход библиотек малых РНК, качество секвенирования и распределение типов малых РНК [27]. Кроме того, в работе [18] не было выявлено значимых различий в результатах секвенирования между образцами, полученными из 100 и 200 мкл плазмы.

Согласно рекомендациям производителя используемого нами набора, для выделения РНК miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (Qiagen, Германия), увеличения выхода РНК можно добиться, увеличив объем плазмы или сыворотки. Однако отмечается, что увеличение объема образца нежелательно в связи с тем, что увеличение количества контаминантов может повлиять на процесс очистки.

Полученные нами результаты показали, что увеличение объема биообразцов при выделении РНК, хотя и привело к повышению концентрации выделенной микроРНК, а после секвенирования — к повышению числа TPM на образец по генам человека, в то же время не оказало влияния на значение показателя TPM на образец при анализе генов микроРНК.

Кроме того, поскольку в нашем исследовании использовались парные образцы сыворотки и плазмы крови от одних и тех же доноров, было возможно сравнить их характеристики. В результате количество РНК после выделения было выше для сыворотки, однако количество чтений и TPM на образец было выше для плазмы крови.

Заключение

Оптимизация существующих протоколов подготовки библиотек для биообразцов с низким содержанием микроРНК может значительно улучшить показатели секвенирования. В настоящем исследовании ключевым фактором, обеспечившим повышение эффективности, стало сокращение числа циклов ПЦР.