Сравнительный анализ наборов для выделения нуклеиновых кислот из образцов крови и тканей животных

Введение

Молекулярно-генетические исследования требуют качественного выделения нуклеиновых кислот (НК), что является критически важным этапом любого анализа. Выбор оптимального метода экстракции зависит от множества факторов, в т.ч. простоты, скорости, возможности автоматизации и стоимости процедуры [1].

Современные наборы для выделения НК представлены широким ассортиментом, различающимися по составу реактивов, протоколам обработки материалов и эффективностью выделения [2]. На выход НК влияет принцип работы и качество реактивов самого набора, тип ткани, из которого происходит экстракция, а также условия отбора биологического материала [1][3].

Помимо вышеуказанных причин, на концентрацию и качество выделенных НК влияет постмортальный интервал (ПМИ) — период времени между наступлением смерти и моментом, когда проводится исследование или консервация биоматериала. После смерти дезоксирибонуклеиновая (ДНК) и рибонуклеиновая (РНК) кислоты разрушаются нуклеазами, присутствующими в клетках организма или во внешних источниках (бактерии или другие загрязнители окружающей среды) [4]. В зависимости от органа, из которого выделяются НК, скорость деградации различается, например, в поджелудочной железе и печени из-за повышенного содержания рибонуклеазы деградация РНК происходит быстрее, чем в мозге, где наблюдается высокая стабильность РНК после смерти [5]. В живом организме деградация НК контролируется механизмами репарации, которые останавливаются после смерти [6], таким образом для планирования преаналитического этапа исследования следует четко регламентировать ПМИ, в течение которого необходимо заложить биоматериал на хранение или начать экстракцию НК.

Настоящее исследование направлено на проведение сравнительного анализа эффективности коммерческих наборов для выделения ДНК из крови и тканей, а также РНК из тканей мышей, и оценить влияние ПМИ на качество и количество извлекаемых НК.

Материал и методы

Сбор биоматериала. Для отбора образцов использовали 12 мышей, самцов линии Balb/C, возрастом 7-9 нед. В виварии мышей содержали в системах индивидуально вентилируемых клеток на стандартном рационе, в контролируемом микроклимате.

Животных разделили на 2 группы по 6 голов в каждой. Эвтаназия проводилась методом цервикальной дислокации. Отбор биологического материала проводили сразу после эвтаназии (0 часов) и спустя сутки (24 ч). В течении суток тушки животных хранились при комнатной температуре (+20 … +22 ^оС), что позволяет воссоздать условия внезапной гибели экспериментального животного, от которого необходимо провести забор материала.

Для отбора образцов крови проводили декапитацию. Кровь собирали в вакутейнеры с К₂-ЭДТА, аликвотировали в криопробирки и помещали на хранение при -20 ^оC. НК выделяли из печени, сердца, почек, легких, скелетных мышц, мозга, семенников. Часть тканей помещали в пустые маркированные криопробирки, которые сразу помещали в жидкий азот на долгосрочное хранение для дальнейшего выделения ДНК, остальную часть тканей помещали в криопробирки, содержащие раствор РНК-стабилизатора RNA-protect Tissue Reagent (Qiagen, Германия), после чего инкубировали при температуре +4 ^оC в течение 20 ч, удаляли раствор, а затем криопробирку с тканью помещали в жидкий азот для долгосрочного хранения.

Работу с лабораторными животными проводили в соответствии с Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Минздрава России от 23.08.2010г № 706н) и правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей ETS № 123 (Страсбург, 18.03.1986г).

Выделение НК. Для сравнительного анализа проводили выделение ДНК из образцов крови, выделение ДНК и РНК из образцов тканей мышей. Для выделения ДНК были протестированы 10 коммерческих российских и зарубежных наборов, для выделения РНК из образцов тканей использовали только набор RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) (таблица 1). В каждом случае выделение НК проводили вручную согласно протоколу производителя с обязательным контролем качества после завершения процедуры.

Контроль качества выделенных НК. Концентрацию ДНК измеряли флуориметрически на приборе Quantus (Promega Corporation, США) с помощью набора реагентов Quantifluor ONE dsDNA System (Thermo Fisher Scientific Inc., США), концентрацию РНК — на флуориметре Qubit (Thermo Fisher Scientific Inc., США) с помощью набора реагентов Qubit RNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Оценку показателей чистоты А260/А230 и А260/А280 проводили на приборе NanoDrop 8000 (Thermo Fisher Scientific, США). Оценку показателей целостности НК (DIN — степень деградации ДНК, RIN — степень деградации РНК) выполняли с помощью системы автоматического электрофореза 4200 TapeStation (Agilent Technologies, США), с использованием наборов реагентов Genomic DNA Reagents (Agilent Technologies, США), High Sensitivity D5000 Reagents (Agilent Technologies, США) для ДНК и набора реагентов RNA ScreenTape Assay (Agilent Technologies, США) для РНК.

Статистическая обработка. Статистический анализ полученных данных проводили при помощи R 4.5.1 используя оболочку RStudio (Version: 2025.05.01 Build 513 | Released: 2025-06-01, Posit Software, PBC). Для сравнения групп применяли непараметрический критерий Вилкоксона для независимых выборок и однофакторный дисперсионный анализ с поправкой на множественные сравнения. Для визуализации полученных данных применяли пакет ggplot2.

Результаты

Выделение ДНК из образцов крови

Проведенный сравнительный анализ 7 коммерческих наборов для выделения ДНК из крови животных позволил выявить различия по ключевым параметрам контроля качества (таблица 2). Следует отметить, что ДНК, выделенная с использованием 3 наборов — PrepFiler Forensic DNA Extraction Kit (Applied Biosystems, США), М-Сорб (Синтол, Россия) и MagMAX DNA Multi-Sample Kit (Thermo Fisher Scientific, США), имела крайне низкие значения концентрации (<1 нг/мкл), что не позволило получить достоверные результаты для соотношений А260/230 и А260/280. Данные по качеству, полученные с использованием этих наборов, в дальнейшем сравнении не использовались.

Наборы D-Blood-5 (Биолабмикс, Россия) и QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Германия) продемонстрировали высокие показатели концентрации ДНК, незначительно превышая показатели, полученные для остальных наборов (рисунок 1). Также отметим, что для всех 4 наборов, при использовании которых концентрация всех выделенных образцов ДНК была >1 нг/мкл, получено оптимальное значение соотношения А260/280, находящееся в диапазоне ~1,8 [7]. Однако низкие показатели, полученные для соотношения А260/230, можно объяснить, с одной стороны, низкими значениями полученных концентраций, а с другой, — наличием дополнительных примесей различных органических соединений.

Для ряда образцов крови была проведена оценка показателя степени деградации ДНК (DIN) на представленных электрофореграммах образцов (рисунок 2). Отметим, что в результате выделения получены образцы высокомолекулярной ДНК с невысокой степенью деградации, что позволяет использовать полученную ДНК для проведения различных молекулярно-генетических анализов.

Особое внимание заслуживает параметр продолжительности выделения (таблица 1). Набор MagAttract HMW DNA Kit (Qiagen, Германия) показал наименьшее время обработки, что делает его предпочтительным для выполнения срочных исследований. Наибольшее время обработки потребовалось для выделения наборами PrepFile Forensic DNA Extraction Kit (Applied Biosystems, США) и MagMAX DNA Multi-Sample Kit (Thermo Fisher Scientific, США), при этом полученная ДНК отличается крайне низкими значениями концентрации.

Выделение ДНК из образцов тканей

Выделение ДНК проводилось из контрольных (0 ч после эвтаназии) и опытных образцов тканей (24 ч после эвтаназии).

Для работы были использованы 3 коммерческих набора QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Германия), GM Tissue (Raissol Bio, Россия) и Tissue M (Raissol Bio, Россия). Согласно инструкции производителя набор Tissue M позволяет проводить выделения путем сорбции на магнитных частицах, а набор GM Tissue — классическим методом тотального спиртового осаждения НК. Набор от фирмы Qiagen предполагает проведение процедуры выделения с использованием спин-колонок.

В случае работы с тканями животных наибольшие выходы концентрации ДНК получены при использовании наборов GM Tissue (Raissol Bio, Россия) и Tissue M (Raissol Bio, Россия) для тканей сердца и скелетных мышц. Для остальных органов полученные значения для всех трёх наборов не имеют достоверных различий. Также видно, что в течение 24 ч произошло значительное уменьшение количества ДНК в тканях сердца, почек, печени и мышц при использовании набора Tissue M (Raissol Bio, Россия). Наименьшие различия концентрации в зависимости от времени эвтаназии животного получены при использовании набора QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Германия) для образцов тканей мозга, печени и почек (рисунок 3 А).

Наиболее близкие к оптимальным показателям соотношения А260/280 и А260/230 получены при использовании набора QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Германия), которые также сходятся для разных технических повторностей (рисунок 3 Б).

Значительные изменения в степени деградации ДНК получены при сравнении с контрольными образцами для тканей мозга, сердца, легких и скелетных мышц при использовании набора Tissue M (Raissol Bio, Россия) (рисунок 4).

Выделение РНК из образцов тканей

РНК выделяли из контрольных (0 ч после эвтаназии) и опытных образцов тканей (24 ч после эвтаназии). Для выделения образцов РНК из тканей также был использован только набор Qiagen RNEasy Mini kit (Qiagen, Германия), который позволил провести сравнительную оценку выхода РНК в зависимости от вида ткани животного и ПМИ.

Отметим, что наиболее высокие показатели концентрации РНК получены для таких тканей как печень и почки, наименьшие — для скелетных мышц. В зависимости от ПМИ, концентрация выделенной РНК закономерно снижалась во всех видах ткани, кроме половых органов (рисунок 5 А). В среднем, концентрация РНК в образцах при взятии органов через 24 ч после эвтаназии снизилась на 50%.

Аналогично снижается показатель степени деградации РНК (RIN — RNA integrity number,) в зависимости от ПМИ (рисунок 5 Б). Наименьшие различия между показателями RIN для контрольных и опытных образцов получены для тканей мозга и семенников, а наибольшей деградации подверглась РНК, выделенная из почек и скелетных мышц (таблица 3, рисунок 6). Показатель RIN является важным для оценки пригодности выделенной РНК для дальнейших исследований, особенно для анализов, когда важно наличие высокомолекулярной РНК (такие как секвенирование следующего поколения, NGS-секвенирование).

Обсуждение

Экстракция НК, полученных от модельных организмов, представляет собой критически значимый этап в проведении молекулярно-генетических исследований. В связи с этим важное значение приобретает оптимальный выбор реагентов и протоколов, обеспечивающих получение НК с высокими качественно-количественными показателями. В работе проведен сравнительный анализ эффективности коммерческих наборов для выделения геномной ДНК из образцов крови, также наборов для выделения ДНК или РНК из образцов различных типов ткани непосредственно после эвтаназии животного и спустя 24 ч автолизной деградации при комнатной температуре.

Полученные результаты свидетельствуют, что при выборе оптимального метода выделения следует учитывать несколько факторов: тип биоматериала, требуемое количество и чистоту НК, продолжительность работ.

Для выбора оптимального набора для выделения ДНК ключевым фактором является показатель концентрации [8]. Наилучшие значения при выделении ДНК из образцов крови животных были получены с использованием коммерческих наборов на основе спин-колонок, которые позволяли получить наибольший выход НК и оптимальные соотношения показателей чистоты. Следует отметить, что такие наборы требуют дополнительных финансовых расходов при организации единой приборной линии для автоматизированного выделения, по сравнению с наборами на основе магнитных частиц [2].

Анализ влияния времени хранения образцов (0 ч и 24 ч после эвтаназии) выявил закономерное снижение во времени концентрации выделяемых НК. Наиболее выраженное уменьшение выхода наблюдалось для печени и скелетных мышц, что согласуется с предыдущими исследованиями влияния ПМИ на количественный выход ДНК [8].

Сравнение методов выделения по принципу действия показало, что сорбция на магнитные частицы (наборы GM Tissue и Tissue M, Raissol Bio, Россия) обеспечивает наибольший выход ДНК из тканей, но требует значительного времени. Колоночные методы (QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen, Германия) демонстрируют более быстрое выделение НК, но с меньшей концентрацией. Продолжительность выделения для тканей оказалась значительно больше, чем для крови, достигая 22 ч для набора GM Tissue (Raissol Bio, Россия) из-за необходимости длительного лизиса, что, вероятно, положительно сказалось на выходе ДНК.

Набор GM Tissue (Raissol Bio, Россия) демонстрирует стабильно высокую эффективность при выделении ДНК из различных органов. В свежих образцах (0 ч) его преимущество обусловлено мощными ингибиторами нуклеаз, предотвращающими деградацию ДНК. Выделенная ДНК из тканей органов через 24 ч после эвтаназии, несмотря на начавшийся автолиз, имеет более высокие показатели контроля качества по сравнению с органами 0 ч после эвтаназии благодаря оптимизированному составу набора, эффективно работающему с частично разрушенными тканями. Особый случай представляют скелетные мышцы, где все наборы, включая GM Tissue (Raissol Bio, Россия), показывают классическую динамику — максимальный выход ДНК в свежих образцах [9]. Это объясняется устойчивой структурой мышечной ткани и низкой активностью нуклеаз. Этот результат подтверждает, что превосходство GM Tissue (Raissol Bio, Россия) для выделения ДНК и других органов отражает его реальные преимущества, а не методические погрешности.

Результаты исследования демонстрируют существенное влияние как типа ткани, так и продолжительности ПМИ на количественные и качественные показатели выделенной РНК. При сравнительном анализе характеристик выделения РНК из различных типов тканей, выявили, что наибольшая концентрация РНК характерна для образцов печени, а наименьшая для образцов мышц и сердца; полученные данные ожидаемы и соотносятся с результатами работ Walker DG, et al. (2016) [10] и Yamamoto T, et al. (2012) [11]. Высокая концентрация РНК из тканей печени и почек связана с тем, что это наиболее метаболически активные ткани, которые характеризуются высоким уровнем транскрипции. В свою очередь, низкая концентрация в образцах мышечных тканей может быть связана с более низкой плотностью ядер [10].

Во всех исследованных тканях наблюдалось снижение концентрации и значения RIN при увеличении ПМИ до 24 ч, исключением являются образцы семенников, где падение концентрации и значения RIN было незначительным. В среднем, потеря концентрации составила ~50%, что указывает на сохранение активности нуклеаз после прекращения жизнедеятельности организма. Наиболее выраженная деградация наблюдалась в тканях почек и скелетных мышц, где значения RIN упали до критически низких значений — 2,5 и 2,8, соответственно, что делает полученные образцы РНК малопригодными для большинства молекулярно-генетических исследований [12]. Особый интерес представляет стабильность РНК в тканях мозга и семенниках, что, скорее всего, связано с наличием ингибиторов рибонуклеаз, уникальным составом тканей или специфической упаковкой матричной РНК в рибонуклеопротеиновые комплексы [13][14].

Полученные данные имеют важное значение для выбора оптимального набора в зависимости от типа биоматериала, определения допустимых сроков хранения и транспортировки биоматериала, а также интерпретации результатов при работе с архивными образцами и разработке протоколов для особо чувствительных к изменению условий хранения тканей. Перспективным направлением представляется дальнейшая оптимизация российских наборов для сокращения времени выделения без потери эффективности, что позволит создать конкурентоспособные продукты, превосходящие зарубежные аналоги по всем ключевым параметрам, а также разработка специализированных консервирующих растворов для различных типов тканей, позволяющих минимизировать процесс деградации НК при хранении.

Заключение

Таким образом, настоящее исследование позволило провести сравнительный анализ различных коммерческих наборов для выделения ДНК из крови и тканей животных, включая оценку динамики деградации НК (DIN) в зависимости от времени хранения биоматериала. Результаты демонстрируют значительную вариабельность эффективности методов в зависимости от типа биоматериала, принципа выделения и производителя реагентов. Оценка влияния ПМИ на выход и степень деградации РНК позволит исследователям выбрать наиболее подходящий коммерческий набор для проведения первичного этапа молекулярно-генетического исследования.

Полученные данные имеют важное практическое значение для планирования сроков транспортировки образцов в лабораторию, выбора оптимального метода забора биоматериала и выделения НК.