Анализ сывороточных концентраций каспаз-1, -8 и адипоцитокинов у больных с хронической сердечной недостаточностью с различной фракцией выброса

Введение

Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) — это гетерогенное заболевание, являющееся конечной стадией большинства сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ); в основе ХСН лежат структурные и функциональные нарушения миокарда, обусловленные различными этиопатогенетическими механизмами. ХСН по праву можно назвать пандемией XXIв [1]. В связи с ростом и старением населения, несмотря на появление новых стратегий медикаментозного лечения и улучшение показателей выживаемости, частота ХСН по-прежнему продолжает расти: за период наблюдения с 2002 по 2017гг установлено увеличение доли пациентов с ХСН с 6,1 до 8,2% [2]. ХСН сосуществует с другими хроническими неинфекционными заболеваниями, среди которых в большинстве случаев встречаются артериальная гипертензия (АГ), фибрилляция предсердий, ишемическая болезнь сердца, сахарный диабет 2 типа (СД2) и ожирение [3].

Согласно современным представлениям, в патогенезе ХСН ключевую роль играет хроническое воспаление, приводя к непосредственному повреждению кардиомиоцитов, что в итоге запускает уже вторичный каскад гемодинамических и воспалительных нарушений на системном уровне [4]. Классическим механизмом запуска воспалительной реакции при ХСН является гиперсекреция провоспалительных цитокинов, среди которых наиболее изученным является интерлейкин-6 (ИЛ-6), экспрессирующийся кардиомиоцитами, макрофагами, адипоцитами и фибробластами [5]. ИЛ-6 оказывает плейотропные воздействия на различные типы клеток, приводя к гипертрофии кардиомиоцитов через сигнальный путь gp130/STAT3 и оказывая инотропный эффект, а также на фибробласты, приводя к усилению их пролиферации и стимулируя синтез внеклеточного матрикса [6][7]. В ряде экспериментальных исследований показана взаимосвязь ИЛ-6 с лептином: так, ИЛ-6 может повышать чувствительность к лептину, при этом лептин может индуцировать экспрессию ИЛ-6 [8][9]. Активно изучается роль ИЛ-6 в программируемой клеточной гибели (ПКГ); показано что этот цитокин в комплексе с фактором некроза опухоли альфа способен индуцировать ПКГ посредством активации сигнального пути TRAIL/Apo2L, модулирующего действие каспазы-8, регулирующей активность других каспаз, включая каспазу-1 [10].

В современных исследованиях отмечается значимая роль ПКГ в развитии и прогрессировании ХСН. Существует несколько механизмов ПКГ, к которым относятся: апоптоз — невоспалительная форма ПКГ, которая характеризуется фрагментацией клеточного ядра и формированием апоптотических телец; одним из его ключевых белков является каспаза-8; пироптоз — воспалительная форма ПКГ, которая сопровождается разрывом клеточной мембраны и высвобождением провоспалительных цитокинов и белков инфламмасомного комплекса, включая ИЛ-1β, ИЛ-18, структурный белок инфламмасомы NLRP3 (nucleotide-binding leucine-rich repeat receptor pyrin domain-containing-3) и каспазу-1, которая играет ключевую роль в активации инфламмасомы; некроптоз — воспалительная форма ПКГ, сопровождающаяся разрывом мембраны клетки и выходом ее содержимого наружу; сочетает в себе черты апоптоза и некроза, но в отличие от последнего является регулируемым процессом, к ключевым белкам которого относятся RIPK1 и RIPK3 (receptor-interacting protein kinases) и MLKL (mixed lineage kinase domain like pseudokinase); и ферроптоз — ("окислительная" гибель клетки), молекулярные механизмы которого включают множество путей, регулирующих метаболизм железа, перекисное окисление липидов и систему антиоксидантной защиты [11]. Нарушение баланса между процессами ПКГ в миокарде приводит к повреждению сердечной мышцы и, в конечном итоге, становится одной из причин развития ХСН [12]. Согласно современным представлениям, повреждение кардиомиоцитов при ХСН посредством механизмов ПКГ является одним из ключевых факторов прогрессирования заболевания, способствуя неблагоприятным структурно-функциональным нарушениям в миокарде [13].

В клинической практике для постановки диагноза ХСН из лабораторных методов исследования используются количественное определение N-концевого промозгового натрийуретического пептида, однако из-за низкой отрицательной прогностической ценности натрийуретических пептидов при ХСН [14], главным образом у пациентов с ожирением или почечной дисфункцией, возникают трудности в постановке диагноза, в связи с чем существует необходимость в поиске новых биохимических маркеров. Идентификация соединений, участвующих в биохимическом каскаде, который сопровождается хроническим низкоинтенсивным воспалением и/или ПКГ кардиомиоцитов с дальнейшим ремоделированием миокарда и исходом в ХСН, является актуальной задачей в современной кардиологии как для понимания механизмов развития ХСН, так и для диагностики, прогнозирования и поиска мишеней терапевтического воздействия. Сложность патогенеза ХСН, обусловленная одновременным участием множества биологических механизмов, не может быть полностью отражена одним показателем.

Выбор исследуемых аналитов в текущей работе продиктован задачей изучить циркулирующие маркеры, ассоциированные с различными уровнями и патогенетическими звеньями хронического воспаления, включая классический цитокиновый механизм (ИЛ-6), секреторную активность жировой ткани, влияющую на провоспалительный/противовоспалительный баланс (адипокины: лептин и адипонектин), а также пироптоз, как разновидность ПКГ, связанной с воспалением (каспаза-1 и каспаза-8).

Цель исследования — провести сравнительный анализ комплекса биомаркеров ПКГ — каспаз-1, -8, адипоцитокинов — лептина, адипонектина и ИЛ-6 — у пациентов с ХСН и у лиц без данного заболевания.

Материал и методы

В исследование в качестве основной группы включены 54 пациента с диагнозом ХСН в возрасте от 59 до 72 лет, группу контроля составили 100 пациентов без ХСН в возрасте от 59 до 69 лет. Больные с ХСН распределились по фенотипам согласно фракции выброса (ФВ) левого желудочка (ЛЖ) следующим образом: 33 пациента с ХСН с сохраненной ФВ ЛЖ (ХСНсФВ) (ФВ ≥50%), 7 пациентов с ХСН с умеренно сниженной ФВ ЛЖ (ХСНунФВ) (ФВ 41-49%), 14 пациентов с ХСН с низкой ФВ ЛЖ (ХСНнФВ) (ФВ ≤40%). Анализируемые группы не различались по возрасту, полу и индексу массы тела. Взятие крови проводилось до назначения лечения в стационаре, данные по предшествующей амбулаторной терапия приведены в таблице 1.

Все пациенты были госпитализированы в ФГБУ "НМИЦ терапии и профилактической медицины" (далее "НМИЦ ТПМ") Минздрава России в период с 01.10.2023 по 01.04.2025. Исследование проводилось в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации, и получило одобрение локального этического комитета ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России (протокол № 04-05/23 от 18.09.2023). Все пациенты подписывали информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии включения: возраст 55-75 лет, для основной группы — наличие подтвержденного диагноза ХСН в соответствии с уровнем систолической дисфункции ХСНнФВ ≤40%, ХСНунФВ 40-49% и ХСНсФВ >50%, согласно критериям, представленным в клинических рекомендациях, наличие симптомов и признаков сердечной недостаточности, структурные и/или функциональные изменения, свидетельствующие о наличии диастолической дисфункции [15][16].

Критерии невключения: наличие острых инфекционных заболеваний на момент госпитализации, злокачественные новообразования и проведенная химиотерапия, лучевая терапия, заболевания, которые сопровождаются симптомами, сходными с таковыми при сердечной недостаточности (хроническая обструктивная болезнь легких, бронхиальная астма), острое нарушение мозгового кровообращения в течение последних 3 мес., тяжелые пороки клапанов сердца, тяжелые нарушения ритма и проводимости, требующие электрокардиостимуляции. Всем пациентам при поступлении проводилась трансторакальная эхокардиография по стандартному протоколу.

С целью изучения биохимических маркеров образцы венозной крови были получены из кубитальной вены у пациентов натощак, до выполнения каких-либо инвазивных процедур. Кровь собирали в вакуумные пробирки, содержащие активатор свертывания. После центрифугирования при 3000 g в течение 10 мин при +4 ^оС, полученную сыворотку аликвотировали в криопробирки. Биообразцы хранили в лаборатории "Банк биологического материала" ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России при -70 ^оС.

В рамках исследования были определены уровни каспазы-1, каспазы-8, ИЛ-6, лептина и адипонектина в образцах сыворотки крови. Для всех анализов использовался иммуноферментный анализ (ИФА), проводимый на планшетном ридере Multiscan FC (Thermo Scientific) под управлением программного обеспечения SkanIt RE 7.0.2. Для количественного определения каспазы-1 в неразбавленной сыворотке крови использовался стандартизированный набор для ИФА Quantikine ELISA Human Caspase-1 Immunoassay (Biotechne/R&D Systems, США). Минимальный порог обнаружения составил 0,68 пг/мл с калибровочным диапазоном от 0 до 400 пг/мл. Уровень каспазы-8 определяли с помощью сэндвич-ИФА, используя набор Human Caspase-8 ELISA Kit (производства Ray-Biotech, США). Минимальный порог обнаружения составил 14,5 пг/мл, а диапазон измерений от 0 до 4000 пг/мл. Сыворотка крови для анализа каспазы-8 была предварительно разведена в соотношении 1:1 в соответствии с рекомендациями производителя набора. Содержание ИЛ-6 в неразбавленной сыворотке измерялось с помощью стандартизированного набора реактивов "Интерлейкин-6 ИФА-БЕСТ, комплект 1" (Вектор-Бест, Россия). Минимальный порог − 0,5 пг/мл, а диапазон измерений − 0-300 пг/мл. Количественное определение лептина проводилось в неразбавленной сыворотке с использованием набора для ИФА "Leptin ELISA" (DBC, Канада). Минимальный порог обнаружения составил 0,5 нг/мл, а диапазон измерений от 0 до 100 нг/мл. Уровень адипонектина определялся методом конкурентного ИФА с применением реактивов "Human Adiponectn ELISA" (Biovendor, Чехия). Минимальный порог обнаружения для этого аналита составил 26 нг/мл, а диапазон измерений от 0,1 до 10 мкг/мл. Сыворотка крови для анализа адипонектина была предварительно разведена согласно инструкции производителя.

Статистический анализ выполнялся в программном пакете IBM SPSS Statistics (версия 22, IBM, США). В качестве методов непараметрической статистики применялись: U-критерий Манна-Уитни (для сравнения непрерывных переменных между группами) и точный 2-сторонний критерий Фишера (для анализа категориальных данных). Корреляционный анализ проводился с использованием непараметрического критерия Спирмена. Данные представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q25-Q75). Для оценки диагностической эффективности аналитов был проведен ROC-анализ (receiver operating characteristic analysis). Для всех показателей и их соотношений была расcчитана площадь под кривой (AUC − area under curve), а также проводился расчет пороговых уровней (точек отсечения, cut-off) с учетом максимального коэффициента Юдена. Для оценки ассоциаций исследуемых факторов применялся логистический регрессионный анализ с расчетом отношения шансов (OR, odds ratio) и 95% доверительным интервалом (ДИ) с поправкой на возраст исследуемых больных. Уровень статистической значимости при проверке гипотез был принят <0,05.

Результаты

Согласно результатам проведенного сравнительного анализа, у больных с ХСН выявлены статистически значимо более высокие уровни каспазы-1 (p=0,04) и ИЛ-6 (p=0,01) относительно группы контроля. В основной группе концентрация каспазы-1 составила 87,3 пг/мл что в 1,2 раза превышало Me уровня данного фермента в группе контроля, тогда как Me ИЛ-6 у больных ХСН была в 1,3 раза выше — 4,6 vs 3,5 пг/мл. Анализ концентраций каспазы-8, лептина и адипонектина не выявил статистически значимых различий концентраций данных аналитов между группой больных ХСН и группой контроля (таблица 2).

С целью подтверждения потенциальной диагностической эффективности исследуемых биомаркеров был проведен ROC-анализ, который показал, что при сравнении группы ХСН c группой контроля наиболее высокие площади под кривой были характерны для каспазы-1 (AUC=0,598, p=0,046) и ИЛ-6 (AUC=0,617, p=0,017), тогда как для каспазы-8, лептина и адипонектина AUC была достаточно низкий, а различия не достигли статистической значимости (рисунок 1).

Для показателей, статистически различающихся между анализируемыми группами, были рассчитаны пороговые уровни (точки отсечения). Для каспазы-1 пороговый уровень составил 93,4 пг/мл, которому соответствовала диагностическая чувствительность 44,0%, при диагностической специ­фичности 70,0%, максимальный индекс Юдена — 0,14). Для ИЛ-6 был получен пороговый уровень 6,02 пг/мл, при котором диагностическая чувствительность и специфичность составили, соответственно — 46,3 и 74,0%, при индексе Юдена 0,203).

В связи с неоднородностью выборки и необходимостью оценки связи сопутствующих заболеваний с концентрациями исследуемых аналитов, был проведен дополнительный регрессионный ­анализ ­факторов, ассоциированных с гиперсекрецией кас­пазы-1 и ИЛ-6 (таблица 3), который показал ста­тис­тически значимые ассоциации с наличием ХСН — для каспазы-1: OR 2,330; 95% ДИ: 1,056-5,144 (p=0,036), для ИЛ-6 — 2,181; 95% ДИ: 1,009-4,714 (p=0,047).

При анализе корреляций между ФВ ЛЖ и сывороточными концентрациями исследуемых маркеров была выявлена статистически значимая отрицательная корреляционная связь между уровнем каспазы-8 и ФВ ЛЖ, R=-0,28 (p=0,04), таким образом, чем ниже ФВ, тем выше уровень каспазы-8. Дополнительно был проведен сравнительный анализ уровней данного фермента в группах пациентов с различными фенотипами ХСН по ФВ ЛЖ. Согласно полученным данным, Me [ Q25-Q75] уровня каспазы-8 при ХСНнФВ составила 422,2 пг/мл [ 139,7-1246,2], что было статистически значимо (p=0,008) в 3 раза выше, чем в группе больных с ХСНсФВ: 126,8 [ 46,8-293,5] пг/мл (рисунок 2). Для других анализируемых соединений статистически значимых различий в зависимости от фенотипа ХСН получено не было.

Проведенный ROC-анализ при сравнении уровней каспазы-8 между группой больных с ХСНнФВ относительно больных без ХСНнФВ показал AUC=0,735 (95% ДИ: 0,62-0,85), асимптотическое значение p=0,004. Нами был рассчитан пороговый уровень для каспазы-8, составивший 344 пг/мл, при котором диагностическая чувствительность составила 64,3%, специфичность 77,1%, максимальный индекс Юдена — 0,414. Далее был проведен дополнительный регрессионный анализ факторов, ассоциированных с наличием ХСНнФВ в качестве зависимой переменной, а также клинико-анамнестическими факторами и наличием гиперсекреции каспазы-8 в качестве ковариат (таблица 4). Выявлена статистически значимая ассоциация наличия в анамнезе ХСНнФВ и гиперсекреции каспазы-8: OR 4,994; 95% ДИ: 1,457-17,120 (p=0,011).

Обсуждение

Анализ комплекса биомаркеров у пациентов с ХСН, выполненный в настоящем исследовании, продемонстрировал статистически значимо более высокие уровни каспазы-1 и ИЛ-6 у этих больных относительно лиц без ХСН. Современная научная литература, включая работы российских и зарубежных авторов, охватывает обширный круг исследований, посвященных анализу различных биохимических маркеров и их комбинаций при ХСН. Полученные нами данные о статистически значимом повышении концентраций ИЛ-6 при ХСН согласуются с результатами более ранних отечественных и зарубежных исследований, в соответствии с которыми уровни этого цитокина ассоциированы с наличием в анамнезе данной нозологии [17-19]. Кроме того, ИЛ-6 рассматривается как фактор, связанный с неблагоприятным прогнозом у больных ХСН [20-22].

Следует отметить, что в литературе практически не приводятся данные об изучении каспазы-1 в сыворотке крови больных с ХСН. Ближайшие по тематике работе посвящены анализу белкового комплекса, связанного с каспазой-1, а именно инфламмасомы NLRP3 (nucleotide-binding leucine-rich repeat receptor pyrin domain-containing-3). Так, на сегодняшний день описано несколько экспериментальных исследований, в которых был изучен уровень цитокинов, образующихся в ходе фермент-субстратного взаимодействия каспазы-1 и предшественников провоспалительных цитокинов (про-ИЛ-1β и про-ИЛ-18); следовательно, уровень зрелых форм (ИЛ-1β и ИЛ-18) косвенно отражает активность кас­пазы-1. Так, в эксперименте Deng Y, et al. было показано, что у мышей с ХСН в миокарде в избытке образуются ИЛ-1β и ИЛ-18 [23]. Согласно исследованию Zeng Z, et al. на мышиных моделях дилатационной кардиомиопатии в сердечной ткани была обнаружена гиперактивация инфламмасомы NLRP3, ведущая к пироптозу кардиомиоцитов [24]. Полученные в настоящем исследовании данные о статистически значимо более высоких концентрациях кас­пазы-1 у больных ХСН косвенно согласуются с результатами экспериментальных исследований других авторов, показавших, что гиперсекреция белков инфламмасомы NLRP3 является фактором, связанным со структурно-функциональными нарушениями в миокарде [23].

Несмотря на малое количество исследований, посвященных изучению каспаз у больных с ХСН, в современной научной литературе приведен ряд результатов по их изучению у пациентов с другими ССЗ, которые могут приводить к развитию ХСН. Одним из распространенных сопутствующих состояний, приводящих к формированию фенотипа ХСНнФВ, является ишемическая болезнь сердца. Так, в клиническом исследовании Логаткиной А. В. и др. уровень каспазы-1 у пациентов со стенокардией напряжения II-III функциональных классов по сравнению с практически здоровыми лицами был, в среднем, снижен на 35,8% (р=0,44), а в группе с нестабильной стенокардией — на 51,4% (р=0,001) [25]. В исследовании Shi X, et al. (2015), в атеросклеротических бляшках сонных артерий была обнаружена повышенная экспрессия компонентов инфламмасомы NLRP3 − ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing CARD), каспазы-1, ИЛ-1β, ИЛ-18, чего не отмечалось в здоровых брыжеечных артериях. При анализе экспрессии матричной рибонуклеиновой кислоты и исследуемых белков, было установлено, что нестабильные бляшки характеризуются более выраженной экспрессией ASC, каспазы-1, ИЛ-1β, ИЛ-18 по сравнению со стабильными [26]. В работе Попова С. С. и др. (2017) у пациентов с неалкогольным жировым стеатогепатитом, развившимся на фоне СД2 типа, который часто сопутствует ХСН, была выявлена более высокая активность каспазы-1 − 19,84±0,44 по сравнению с контрольной группой − 5,68±0,32 пмоль/мин/мг белка (p<0,05); в свою очередь, активность каспазы-3 в основной группе составила 10,26±0,51, в группе контроля − 5,72±0,29 пмоль/мин/мг белка (p<0,05), что указывает на повышение апоптотической и пироптотической активности при СД2 [27]. Результаты крупного исследования Zhang Y, et al. (2025) охватившего 41 499 участников, показали, что у 11,7% из них в течение 13,6 лет наблюдения развились различные ССЗ, риск которых был статистически значимо связан с более высоким уровнем каспазы-1 в плазме крови: отношение рисков (HR, hazard ratio) =1,11, 95% ДИ: 1,04-1,19 [28].

В настоящем исследовании статистически значимых различий в уровнях лептина, адипонектина и каспазы-8 в зависимости от наличия ХСН получено не было. В то же время, в исследовании, проведенном Драпкиной О. М. и др., была выявлена ассоциация между уровнем каспазы-8 и степенью ожирения [29], которое является одним из самых распространенных сопутствующих состояний для ХСН. В исследовании Горшуновой Н. К. и др. было показано, что у больных АГ наблюдается статистически значимое увеличение концентраций каспазы-8 и каспазы-3 по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о выраженной активации апоптоза в эндотелиальных клетках при АГ [30], которая является еще одним из распространенных сопутствующих заболеваний при ХСН.

Обращают на себя внимание результаты настоящего исследования, показавшие статистически значимые более высокие концентрации каспазы-8 у больных с ХСНнФВ. Согласно исследованию Olivetti G, et al., отмечено усиление процессов апоптоза после повреждения миокарда вследствие ишемии, реперфузии и инфаркта [31]. Каспаза-8 способна приводить к ПКГ как по механизму апоптоза, так и пироптоза вследствие расщепления белка гасдермина D каспазой-8 [32]. Каспаза-8 также является одним из ключевых регуляторов инфламмасомы NLRP3, запуская ее активацию [33][34]. Гиперсекреция каспазы-8 у пациентов с ХСНнФВ запускает преимущественно апоптотическую гибель клетки, но нельзя исключить ее влияние и на процесс пироптоза, запуск которого реализуется посредством инфламмасомы NLRP3, однако, по мнению авторов исследования, вопрос, каким образом каспаза-8 запускает инфламмасомный путь активации пироптоза, остается открытым [35].

Суммируя результаты настоящего исследования и работы отечественных и зарубежных авторов, можно предположить, что ферменты класса каспаз, регулирующие процессы апоптоза и пироптоза, могут быть ассоциированы с патогенезом ХСН. Потенциальная диагностическая информативность повышенного уровня каспазы-1 и ИЛ-6 при ХСН различных фенотипов достаточно низкая (AUC<0,7), в то же время для каспазы-8, получена более высокая AUC=0,735 относительно группы больных с ХСНнФВ, однако данные результаты получены на относительно небольшой выборке больных и требуют подтверждения в дальнейших исследованиях.

Ограничения исследования. Ограничением исследования является относительно небольшой объем выборки, который не позволил провести всесторонний анализ клинико-анамнестических факторов, способных оказывать влияние на концентрации анализируемых соединений. Неоднородный характер выборки больных с ХСН, куда вошли различные фенотипы, с одной стороны, позволил провести дополнительный анализ различий между группами с различной ФВ, но с другой стороны, является ограничением текущего исследования.

Еще одним ограничением текущего исследования являлся неоднородный состав контрольной группы, которая в то же время сопоставима с основной группой по возрастно-половому признаку, что соответствует критериям для сравнения лабораторных показателей. Для оценки влияния клинической неоднородности выборки нами предпринят дополнительный многофакторный анализ, который, хотя и позволил построить статистически-значимые модели, также попадает под ограничения, связанные с относительно небольшим объемом выборки.

Заключение

В ходе настоящего исследования выявлена связь повышенных сывороточных концентраций каспазы-1 и ИЛ-6 с наличием ХСН, при этом концентрация каспазы-8 ассоциировалась со сниженной ФВ ЛЖ и была статистически значимо более высокой в подгруппе с ХСНнФВ, чем при других фенотипах. Полученные результаты могут косвенно свидетельствовать о повышенной активности процессов ПКГ при ХСН, что требует дальнейшего изучения и валидации.

Отношения и деятельность. Исследование проводилось в рамках государственного задания "Разработка информационно-аналитической системы для прогнозирования и улучшения исходов путем оптимизации подходов к ведению пациентов с декомпенсированной сердечной недостаточностью с сохраненной фракцией выброса с использованием мультимаркерной стратегии и методов искусственного интеллекта" (2025-2027гг, регистрационный номер И125011901994-4).