Оценка связи между микробиотой кишечника и маркерами фиброза миокарда у пациентов с хронической сердечной недостаточностью и сохраненной фракцией выброса левого желудочка

Введение

Хроническая сердечная недостаточность с сохраненной фракцией выброса (ХСН-сФВ) левого желудочка (ЛЖ) представляет собой клинический синдром, в основе которого лежит диастолическая дисфункция ЛЖ. Ее детерминантами являются нарушение процессов расслабления и повышение ригидности ткани миокарда, что было подтверждено в инвазивном исследовании гемодинамики у этой группы больных [1]. Согласно современной парадигме развития ХСН сФВ, часто сопутствующие данному синдрому коморбидные состояния индуцируют развитие системного воспаления, в результате чего эндотелий коронарных микрососудов приобретает способность продуцировать активные формы кислорода, что снижает биодоступность оксида азота для окружающих кардиомиоцитов. Итогом этого становится рост пассивного напряжения миокарда и увеличение степени гипертрофии ЛЖ. Кроме того, воспаление коронарных микрососудов способствует субэндотелиальной миграции лейкоцитов, приводя к активации фибробластов и накоплению коллагена в экстрацеллюлярном матриксе миокарда [2]. Эндомиокардиальная биопсия демонстрирует увеличение содержания фибриллярного коллагена в популяции больных с ХСН-сФВ в сравнении с пациентами из групп артериальной гипертонии (АГ) и контроля [3]. Среди множества молекул, которые были предложены в качестве биомаркеров фиброза миокарда, большинство не продемонстрировало однозначной связи с гистологической оценкой фиброза по материалам эндомиокардиальной биопсии за исключением C-концевого пропептида проколлагена I типа (PICP) и N-концевого пропептида проколлагена III типа (PIIINP) [4]. Кроме того, повышенный сывороточный уровень PICP был связан с высокой смертностью пациентов с ХСН-сФВ [5], в то время как для PIIINP выявлена ассоциация с тяжестью [6] и исходами у лиц с ХСН независимо от ФВ ЛЖ.

Современные исследования свидетельствуют о роли кишечной микробиоты (КМ) в развитии и прогрессировании ХСН. Отмечено, что для лиц с ХСН характерны изменение микробного пейзажа или дисбаланс представителей КМ, участвующих в образовании метаболитов с протективным действием в отношении кишечного эпителия и сердечно-сосудистой системы, таких как короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК), и доказавших негативные эффекты, например, триметиламинN-оксид [7]. Стоит отметить, что в подавляющем большинстве работ группа больных ХСН была преимущественно представлена лицами с ХСН и низкой ФВ ЛЖ [8, 9]. Предполагают, что следствием снижения сердечного выброса становится периферическая вазоконстрикция и застой жидкости в тканях [10], а развивающаяся на фоне ишемии кишечника гипоксия ворсинок энтероцитов приводит к снижению барьерной функции кишечного эпителия, что потенцирует бактериальную транслокацию. Ее отражением признано увеличение концентрации липополисахарида (ЛПС). Последний способен связываться с Toll-подобными рецепторами 4-го типа с последующей инициацией сигнального каскада, итогом которого становится экспрессия широкого спектра воспалительных молекул [10].

Цель настоящей работы: изучить связь представителей родов КМ с сывороточными маркерами фиброза миокарда у пациентов с ХСН-сФВ.

Материал и методы

В исследование были включены 42 пациента обоего пола в возрасте 18-79 лет с верифицированной ХСНсФВ. Диагностика ХСН-сФВ проводилась на основании наличия у пациентов симптомов и клинических признаков ХСН, ФВ ЛЖ ≥50%, оценки отношения максимальной скорости потока в фазу раннего наполнения (Е) к максимальной скорости движения фиброзного кольца митрального клапана в раннюю диастолу (e’) (Е/е’) в ходе тканевой допплерографии, а также измерении уровня N-концевого фрагмента предшественника мозгового натрийуретического пептида (NT-proBNP). Пациентов включали в исследование при значении Е/е’ ≥13 и уровне NT-proBNP >125 пг/мл. Критериями невключения были: возраст <18 лет и ≥80 лет, индекс массы тела ≥35 мг/м², скорость клубочковой фильтрации <30 мл/мин/1,73 м² по формуле CKD-EPI, сахарный диабет, курение или отказ от курения ≤10 лет назад, хроническая обструктивная болезнь легких средней, тяжелой и крайне тяжелой ст. тяжести, бронхиальная астма средней и тяжелой ст. тяжести по данным анамнеза, диагностированные кардиомиопатии, радиационное или лекарственное поражение сердца, констриктивный перикардит, признаки нарушения локальной сократимости миокарда при эхокардиографии, постоянная форма фибрилляции предсердий (ФП), системные заболевания соединительной ткани, онкологические заболевания без радикального излечения, перенесенные острые инфекционные заболевания или обострение хронических в течение 2 нед. до включения в исследование, беременность и период лактации, воспалительные заболевания кишечника, а также прием антимикробных или пробиотических препаратов в течение последних 3 мес. Исследование прошло процедуру оценки и было одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ “Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины” Минздрава России от 07.06.2018г. Всем обследованным пациентам была проведена электрокардиография в 12 отведениях, эхокардиография с допплерографией, оценка теста 6-минутной ходьбы по стандартной методике [11] и заполнение анкеты “Шкала оценки клинического состояния пациента с ХСН” (ШОКС) [12]. Проводилась оценка питания пациентов на основании опросника The Healthy Eating Index 2015 (индекс здорового питания). Он представляет собой набор компонентов рациона, который в зависимости от соответствия стандартам для минимального и максимального балла по каждому пункту оценивается от 0 до 5 или от 0 до 10 баллов [13].

Забор крови для определения биомаркеров методом иммуноферментного анализа осуществлялся из кубитальной вены утром натощак. Оценка уровня NT-proBNP проводилась с использованием реактива (ВекторБест, Россия) на фотометре Multiscan FC (Termofisher Scientific, Финляндия). Оценка маркеров фиброза с применением анализатора “Multiskan-MS” (Thermo Labsystems, Финляндия) и реактивов Cloud-Clone Corp (США). В соответствии с протоколом участникам выдавались стерильные контейнеры для сбора кала, проводился инструктаж по его сбору и хранению до доставки в лабораторию. За 24 ч до сбора кала испытуемым было рекомендовано воздержаться от приема алкоголя, интенсивных физических нагрузок и изменений в питании. В течение 2 нед. до сбора кала пациентам было рекомендовано не использовать слабительные или ректальные свечи. После дефекации контейнер с калом герметично закрывали крышкой и передавали курьеру, который осуществлял транспортировку в холодильной камере при температуре до +8^○С до лаборатории в течение ≤2 ч. В дальнейшем в лаборатории проводили пробоподготовку, выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты и последующую подготовку библиотек секвенирования.

Фильтрация ридов и таксономическая классификация проводилась при помощи программного комплекса QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology). Результатом классификации стало число ридов, пришедшихся на операционные таксономические единицы. С целью пробоподготовки применяли метод селективного захвата регионов V3-V4 гена 16S рибосомальной рибонуклеиновой кислоты (рРНК) бактерий. Амплификация фрагментов вариабельных регионов V3-V4 гена 16S рРНК осуществлялась с использованием универсальных праймеров. Анализ V3-V4 региона 16S рРНК КМ проводился на секвенаторе Illumina MiSeq (США) методом парноконцевого чтения с суммарным покрытием ≥10000 пар ридов на образец. Метод не является количественным, но позволяет узнать структуру микробного сообщества, а именно наиболее широко представленные его элементы, что может быть использовано для анализа ассоциаций с интересующими параметрами. Результат секвенирования 16S рРНК КМ имеет вид таблицы, в которой указываются таксоны различного уровня (тип, класс, порядок, семейство и т.д.) и относительная представленность (в %) таксонов в каждом образце.

Статистическая обработка проведена с помощью языка программирования Python v3.8. Для количественных показателей определялся характер распределения (c помощью теста Шапиро-Уилка). При нормальном распределении признака вычисляли среднее (M) и стандартное отклонение (SD) и результаты представляли как M±SD. Для количественных признаков, распределение которых не соответствовало нормальному, вычисляли медиану (Ме) и интерквартильный размах (25-й процентиль; 75-й процентиль); результаты представлены как Ме [25%; 75%]. Для категориальных и качественных признаков определялись доля и абсолютное количество значений. Для оценки связи факторов между собой проведен корреляционный анализ по Спирмену с определением коэффициента rho и его значимости, а также проведен многомерный регрессионный анализ. Уровень значимости при проведении корреляционного и регрессионного анализа соответствует <0,05.

Результаты

Возраст пациентов, включенных в исследование, составил 67,0 [ 64,0; 71,5 ] лет, среди них 57,1% мужчин. Среди испытуемых преобладали мужчины в возрасте 60-69 лет и женщины возрастной категории ≥70 лет. Все обследованные пациенты имели АГ и клинические признаки ХСН; индекс массы тела составил 30,2 [ 26,7; 33,3 ] кг/м². У всех больных была одышка при физической нагрузке, у 35,7% — пастозность или отёки нижних конечностей, у 38,1% — перебои в работе сердца. Однако проявления сердечной недостаточности (СН) у этих больных имели преимущественно лёгкую степень тяжести: большинство пациентов (69,05%) имели I функциональный класс ХСН, пройденная в тесте 6-минутной ходьбы дистанция составила 434,5 [ 417,0; 441,0 ] метров, количество баллов по ШОКС при ХСН варьировало от 2 до 4 и составило 3,0 [ 2,0; 3,0 ]. Наиболее часто принимаемой группой препаратов среди пациентов с ХСН-сФВ оказались бета-адреноблокаторы (90,5%), тиазидные и тиазидоподобные диуретики (83,3%), статины (54,7%), антагонисты рецепторов ангиотензина II (52,4%), ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (45,2%) и антикоагулянты (40,5%). Среднее значение скорости клубочковой фильтрации у обследованных с ХСН-сФВ составило 76,91±13,06 мл/ мин/1,73 м².

Стоит отметить, что у пациентов отсутствовал факт проведения чрескожного коронарного вмешательства в анамнезе. Доля диагностированной ФП и катетерной аблации ФП составили 47,6 и 21,4%, соответственно. Значения систолического и диастолического артериального давления были 143,6±13,7 и 90,0 [ 80,0; 90,0 ] мм рт.ст., соответственно. Характеристика диастолической функции ЛЖ пациентов с ХСН-сФВ включала оценку пика Е, значение которого составило 76,2±13,6, пика e’, имеющего среднее значение 5,7±1,1 см/с и их отношения Е/е’, равного 13,0 [ 13,0; 14,0 ]. Концентрация NT-proBNP в группе ХСН-сФВ составила 178,0 [ 136,0; 295,0 ] пг/мл. Согласно полученным данным опроса о питании, показатель потребления пациентами фруктов имел значение 3,5 [ 3,0; 4,0 ] балла, в то время как потребление овощей и белковых продуктов составило по 3,0 [ 3,0; 4,0 ] балла при максимально возможном значении, равном 5. Медиана потребления цельнозерновых культур составила 6,0 [ 5,0; 7,0 ] баллов из максимальных 10.

По итогам секвенирования 16S рРНК, наиболее широко представленными в изученной выборке пациентов с ХСН-сФВ оказались типы Firmicutes (48,7±22,2%), Bacteroidetes (47,4±22,6%) и Proteobacteria (1,5 [ 0,5; 2,5 ]%). Содержание в крови биохимических маркёров фиброза в покое у больных ХСН-сФВ составило для PICP 918,0 [ 700,0; 1032,8 ] пг/мл и 6,2±2,7 пг/мл для PIIINP.

Корреляционный анализ выявил, что более высокой относительной представленности рода Allisonella соответствует бóльшая концентрация PICP (p=0,037), в то время как рост представленности Ruminococcus, Ruminococcaceae (unclassified) и Gemmiger ассоциирован с низким уровнем PICP (p=0,018, p=0,047 и р=0,025, соответственно). При этом большее относительное обилие Blautia (p=0,018) и Enterobacteriaceae, unclassified (p=0,041) связано с бóльшим уровнем PIIINP, а высокая представленность Bilophila ассоциирована с низким уровнем PIIINP (p=0,03) (таблица 1). Результаты многомерного регрессионного анализа (таблица 2) позволили расширить число родов, имеющих значимую ассоциацию с маркерами, отражающими механизм патогенеза ХСН-сФВ. Так, Butyricimonas (p=0,011) и Blautia (p=0,002) оказались прямо связаны с концентрацией PICP, тогда как род Intestinimonas демонстрировал обратную ассоциацию с уровнем маркера (р=0,031). Большинство родов имели обратную связь с PIIINP, например, Atopobium (p=0,03), Cellulosilyticum (p=0,002), Solobacterium (p=0,005), Turicibacter (p<0,001), Bilophila (p=0,012). Прямой характер ассоциации с уровнем PIIINP продемонстрирован для представленности родов Paraprevotella (p=0,014) и Desulfovibrio (p=0,009). Данные об относительной представленности вышеупомянутых родов приведены в таблице 3.

Обсуждение

В настоящем исследовании впервые изучена связь состава КМ на уровне родов с маркерами фиброза миокарда в группе лиц с ХСН-сФВ. Обнаруженное на основании опросника Healthy Eating Index 2015 сходное число баллов, отражающих потребление пищевых волокон и белковых продуктов, нашло отражение в отсутствии значимого дисбаланса между типами Firmicutes и Bacteroidetes. Известно, что применение петлевых диуретиков снижает концентрацию PICP у больных с СН [4], однако диуретическая терапия включенных в анализ пациентов базировалась на применении тиазидных и тиазидоподобных диуретиков. Большинство пациентов с ХСН-cФВ также принимали бета-адреноблокаторы, которые препятствуют фиброгенезу, вызванному избыточной активацией симпатической системы при ХСН [14], однако данный факт не мог повлиять на характер корреляционных связей и данные регрессии между родами бактерий и изученными маркерами фиброза миокарда.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что ряд родов КМ пациентов с ХСН-сФВ ассоциирован с фиброзом миокарда, который опосредованно отражает уровень маркеров фиброза PICP и PIIINP. Предположения о природе полученных связей могут быть построены на более детальном рассмотрении научных данных о родах бактерий, которые, согласно данным настоящего исследования, были ассоциированы с уровнями PICP и PIIINP. Представители семейства Rumonococcaceae и рода Ruminococcus принадлежат к продуцентам масляной КЦЖК, которая играет значимую роль в поддержании здоровья макроорганизма и оказывает широкий круг противовоспалительных эффектов, включая влияние на миграцию иммунных клеток, экспрессию молекул адгезии и цитокинов. Бутират признан важным источником энергии для эпителиальных клеток стенки кишечника, способен регулировать пролиферацию кишечных эпителиоцитов, восстановление поврежденной слизистой оболочки и поддержание целостности эпителиального барьера, что снижает воспалительную реакцию, вызванную бактериями и их метаболитами [15]. Ввиду того, что в основе развития ХСН-сФВ у большинства обследованных нами пациентов лежала АГ, любопытно, что выполненный другими исследователями анализ КМ у мышей с АГ показал снижение относительного обилия рода Ruminococcus [16]. Обнаруженная ассоциация высокого уровня PICP со сниженной относительной представленностью Rumonococcaceae (unclassified) и Ruminococcus может быть отражением влияния данных родов на системное воспаление и целостность кишечного барьера.

Высокую относительную представленность бактерий рода Gemmiger, которая, по результатам настоящей работы была обратно связана с уровнем PICP, некоторые авторы относят к важным характеристикам здорового кишечника [17]. Известна попытка оценить микробный состав кишечника в популяции лиц с заболеваниями, имеющими в своей основе иммунноопосредованное воспаление: было установлено, что уровень представленности рода Gemmiger у них был стабильно низким [18]. Аналогичный обратный характер ассоциации с PICP был продемонстрирован для рода Intestinimonas, для которого ранее была показана способность продуцировать кишечный бутират и пропионат [19]. В ранее проведенных исследованиях упоминается о прямой корреляционной связи Intestinimonas с противовоспалительным интерлейкином (ИЛ)-4, который продуцируется Т-хелперами [20]. Кроме того, низкая представленность Intestinimonas была характерна для мышей с АГ [21]. Таким образом, ряд научных данных [16-21] поддерживает представленные выше результаты о потенциально благоприятном влиянии большей представленности родов Ruminococcus, Gemmiger и Intestinimonas на уровень PICP, причем данный процесс предположительно может быть опосредован модификацией проницаемости кишечника и воспалительных реакций.

Род Allisonella продуцирует гистамин (через декарбоксилирование гистидина) в качестве единственного механизма получения энергии. Известно, что в сердце человека определяется некоторое количество гистамина, который помимо опосредования гиперчувствительности может вносить вклад в ремоделирование сердца [22]. Cтимуляция H2- гистаминовых рецепторов способствует активации фибробластов, продукции фибронектина и синтезу проколлагенов I и III типов. Проспективное 11-летнее наблюдение продемонстрировало, что применение антагонистов H2-рецепторов выразилось в снижении риска развития ХСН на 62%. Более того, прием антагонистов H2 рецепторов был связан с неизмененным ударным объемом, конечно-диастолическим объемом и отношением массы к объему по данным магнитно-резонансной томографии [23]. В то же время известны положительные эффекты гистамина, продуцируемого Lactobaccillus reuteri, что выражается в подавлении синтеза провоспалительного фактора некроза опухоли α [24]. Однако в одной из работ было показано, что повышение представленности Allisonella связано со снижением экспрессии белков плотных контактов в тонком кишечнике крыс и увеличением его проницаемости [25]. Эти данные могут быть полезны в понимании потенциального механизма прямой связи между представленностью Allisonella и уровнем PICP при ХСН-сФВ, установленной в настоящей работе. Однако, учитывая тот факт, что в изученной группе пациентов относительная представленность данного рода была очень незначительна, описанную связь с PICP следует трактовать с осторожностью. Последующие работы с бóльшим числом пациентов смогут подтвердить или опровергнуть впервые полученную ассоциацию в этой группе больных.

В настоящей работе обнаружено, что относительная представленность рода Blautia имела прямую ассоциацию с обоими изученными маркерами фиброза миокарда, что может предполагать его патологическую роль в развитии нарушений диастолы. Известно, что Blautia является продуцентом масляной и уксусной КЦЖК. Ранее наблюдение Luedde M, et al. (2017) продемонстрировало сниженный уровень Blautia в группе из 20 пациентов с ХСН с низкой ФВ [9]. В то же время имеются исследования, поддерживающие представленные в настоящей работе данные о возможной негативной роли Blautia. Так, в популяции пациентов Москвы и Московской области род Blautia оказался связан с повышением АД и нарушениями углеводного обмена [26]. Tuovinen E, et al. показали, что Blautia coccoides способна активировать секрецию фактора некроза опухоли α и других цитокинов, а также ИЛ-8. Примечательно, что секреция последнего активируется Blautia coccoides даже в большей степени, чем ЛПС [27]. Неожиданной находкой стала прямая связь продуцента масляной кислоты Butyricimonas с PICP [28]. Однако это может быть объяснено тем, что, по меньшей мере, один из ныне известных видов этого рода, Butyricimonas virosa, обладает патогенными свойствами и ассоциирован с развитием инфекций и бактериемии [29].

Семейство Enterobacteriaceae, неклассифицированный род которого продемонстрировал в настоящей работе прямую корреляционную связь с уровнем PIIINP, включает более тысячи видов и самую широкую группу патогенов, ассоциированных с кишечными инфекциями (среди которых хорошо известны Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Pseudomonas и др.). Их факторы патогенности включают ЛПС, образование капсулы, фимбрии и жгутики, а также специфичные антигены [30], что дает им возможность оказывать негативное влияние на локальное и системное воспаление [31]. Установленная авторами ассоциация позволяет предполагать, что обилие патогенных микроорганизмов из данного семейства может быть потенциально неблагоприятно связано с фиброзом миокарда.

Paraprevotella и Desulfovibrio продемонстрировали прямую связь с концентрацией PIIINP и известны как роды с потенциально неблагоприятными эффектами. Так, показана способность Desulfovibrio к транслокации через слизистую оболочку кишечника и развитию генерализованных инфекций [32]. Кроме того, предполагается роль данного рода как источника ЛПС при развитии системного вялотекущего воспаления [33]. Любопытное исследование поддерживает наши данные о потенциально негативном влиянии рода Paraprevotella на ремоделирование миокарда при СН, а именно: была обнаружена прямая связь этого рода с гипертрофией миокарда и обратная — с фракцией укорочения волокон миокарда [21]. Известно, что Paraprevotella способны продуцировать янтарную кислоту, которая участвует в индукции воспаления, опосредованного ИЛ-1β. Интенсивная продукция янтарной кислоты ранее наблюдалась на мышиных моделях АГ и метаболических воспалительных заболеваний [34].

Согласно полученным нами данным, роды Bilophila и Atopobium обратно связаны с уровнем PIIINP. Примечательно, что они имеют сходства в метаболической активности, а именно: относятся к продуцентам сероводорода в кишечнике [35], который известен как потенциальный триггер воспаления с цитотоксическим эффектом и повреждением кишечного барьера [36]. В свете подобных данных о продуцентах сероводорода обнаруженные более низкие концентрации PIIINP при низкой представленности обоих родов видятся неожиданной находкой. Однако ранее в работе, включившей пациентов с ФП, было продемонстрировано снижение содержания Bilophila, что отчасти согласуется с полученными нами результатами [37]. Также следует принимать во внимание очень низкое относительное обилие данного рода у изученных нами пациентов с ХСН-сФВ, ограничивающее интерпретацию данных. Дальнейшие работы с углубленным изучением проницаемости кишечной стенки и метаболизма бактерий могут пролить свет на природу описанных выше связей.

Для родов Cellulosilyticum и Solobacterium в настоящем исследовании обнаружена обратную связь с PIIINP, что, безусловно, дополняет крайне ограниченные данные, имеющиеся в научной литературе об этих бактериях. Отмечается способность Cellulosilyticum разлагать целлюлозу [38], а также положительная корреляция с числом бокаловидных клеток кишечника и секрецией слизи [39]. Solobacterium известен как анаэроб, продуцирующий широкий круг метаболитов, клиническое значение которого, в первую очередь, определяется участием в развитии галитоза [40]. Обнаруженная обратная связь между представленностью Turicibacter и уровнем PIIINP находит подтверждение в работах, описывающих иммуномодулирующие свойства этого рода бактерий [41]. Имеются данные и о предполагаемой роли Turicibacter в развитии воспалительных заболеваний кишечника [42], что свидетельствует об отсутствии единого мнения относительно роли данного рода в организме человека. Стоит упомянуть, что представленность этой пары родов в настоящем исследовании также была низкой, что накладывает ограничения на интерпретацию данных и может быть уточнено в ходе последующих работ в этом направлении.

Заключение

Представленные результаты описывают роды бактерий, которые могут иметь потенциальное благоприятное или негативное влияние на развитие фиброза миокарда. Анализ характеристик вышеописанных представителей КМ дает основания полагать, что в основе ассоциаций между родами бактерий и фиброзом миокарда могут лежать пути, опосредованные эффектами КЦЖК, гистамина и провоспалительными соединениями. Результаты углубляют представления о связи между КМ и патогенетическими механизмами развития ХСНсФВ, что может стать одним из шагов к пониманию роли КМ в прогрессировании диастолической дисфункции ЛЖ.