Биоресурсная коллекция клеточных линий и первичных опухолей ФГБУ НМИЦ онкологии Минздрава России

Введение

В настоящее время по мнению ведущего Международного общества биологических и экологических репозиториев ISBER (International Society for Biological and Environment Repositories), сформированного в 1999г, биобанк определяется как официально физически или виртуально существующее учреждение, которое может собирать, обрабатывать, хранить и распространять биологические образцы, а также ассоциированную с ними клиническую информацию [1]. Деятельность более тысячи биобанков во всем мире координируется международными, региональными и национальными организациями. В свою очередь, сами коллекции биологических образцов разделяют по типу биоматериала, популяции, стадии и степени всевозможных заболеваний на основе клинических данных пациентов [2].

Например, в Европе находится одна из ведущих организаций в области биобанкирования — EPMA (European Association for Predictive, Preventive & Personalised Medicine), которая представлена в 54 странах мира и активно продвигает проекты по персонализированной медицине [3][4]. Известно, что самое большое количество — 636 биобанков — располагается на территории США [5]. В то же время в Европе работает сеть биобанков BBMRI-ERIC (Biobanking and BioMolecular resources Research Infrastructure — European Research Infrastructure Consortium), которая включает 325 биобанков из 20 стран Европы, а также организация EuroBioBank (eurobiobank.org), которая объединяет 22 биобанка. В Азии находится Национальный биобанк Кореи (NBK — National Biobank of Korea), который интегрирован с 17 региональными корейскими биобанками. В России создана Национальная Ассоциация Биобанков и Специалистов по биобанкированию (НАСБИО, nasbio.ru), которая насчитывает >30 биобанков, среди которых и биобанк ФГБУ "НМИЦ онкологии" Минздрава России.

Биобанк ФГБУ "НМИЦ онкологии" Минздрава России работает в соответствии с рекомендациями по организации структуры биорепозиториев и этическими требованиями последнего издания "Передовых практик ISBER" и на основе стандарта ISO 9001 [6][7] (рисунок 1). Таким образом, биобанк ФГБУ "НМИЦ онкологии" Минздрава России представляет собой отдельную инфраструктуру с большими сложными коллекциями биологических образцов, дополненных обширными и хорошо аннотированными клиническими и патологическими данными о пациентах, включая медицинские изображения, патологическую гистологию и молекулярный анализ биообразцов. Коллекции образцов криохранилища формируются в зависимости от задач и проектов ФГБУ "НМИЦ онкологии" Минздрава России [8].

В настоящее время в Биобанке ФГБУ "НМИЦ онкологии" Минздрава России хранится ~15 тыс. образцов различного биоматериала, в т.ч. постоянные и первичные клеточные культуры, образцы свежезамороженных первичных опухолей рака, кровь и микробиота от пациентов с опухолями различной нозологии.

Все клеточные линии, которые содержатся в нашем биобанке свободны от контаминантов и культивируются без антибиотиков. В коллекцию входит 26 постоянных клеточных линий человеческого происхождения различных нозологий (рисунок 2), а также некоторые первичные клеточные линии.

Для создания первичных культур лаборатория клеточных технологий получает от клинических подразделений послеоперационный материал, отобранный в ходе удаления опухоли, с соблюдением следующих условий: доля опухолевых клеток в образце не <20%; соблюдение временно́го интервала заморозки образца в жидком азоте не более 20 мин с момента экстракции образца в операционной. В зависимости от патологии применяют либо метод первичных эксплантатов, либо ферментативной диссоциации или механической дезагрегации [9] (рисунок 3).

Наряду с этим мы депонировали для коллекции первичных опухолей гистологически верифицированные парные образцы замороженных биоптатов рака молочной железы, колоректального рака, рака желудка, поджелудочной железы, пищевода, легкого, а также редкие коллекции миеломы и детских солидных опухолей различной локализации [8].

Кроме того, благодаря совместной работе клинических и научных подразделений, собраны редкие коллекция биообразцов микробиоты у пациентов с диагнозом рак легкого и коллекция периферической крови у женщин с множественной миеломой [10] для изучения патогенетических механизмов канцерогенеза и поиска новых молекулярно-генетических предикторов.

Таким образом, на основе собранных коллекций в ФГБУ "НМИЦ онкологии" Минздрава России были проведены научные исследования в области биомедицины и клеточных технологий, некоторые результаты которых описаны ниже.

Проекты, выполненные на базе биобанка ФГБУ "НМИЦ онкологии" Минздрава России

На базе фонда коллекций первичных клеточных линий исследовали энергетический фенотип клеток линий рака молочной железы. В качестве материала для исследования использовали природное соединение берберин из корней растений рода Berberis sp. и клеточные линии рака молочной железы BT20, BT474 и MDA-MB-453. Клетки выращивали в питательной среде DMEM (Gibco, США) с добавлением 10% фетальной сыворотки коров (ФСК) (HyClone, США) при 37° C и 5% СО₂. Исследование энергетического фенотипа проводили на анализаторе внеклеточных потоков Seahorse XFp Analyzer (Agilent, США) с использованием набора Seahorse XFp Cell Energy Phenotype Test (Agilent, США) согласно протоколу производителя. В результате исследования впервые было обнаружено, что помимо угнетения клеточного дыхания берберин вызывает снижение гликолитического резерва клеток рака молочной железы. Исходя из этого, берберин способствует формированию низкоэнергетического фенотипа с пониженной способностью сопротивляться стрессовым воздействиям, что делает это соединение перспективным адъювантом в химиотерапии рака молочной железы [11].

Еще одним направлением явилось изучение цитотоксического действия онколитических неклассифицированных ротавирусов группы К на культуры клеток T98G и U87MG in vitro. В исследовании были использованы штаммы ротавирусов, ранее выделенные в Ростовском институте микробиологии и паразитологии, получившие рабочее название ротавирусы группы К (RVK). Штаммы были охарактеризованы как ротавирусные с помощью электронно-микроскопических, серологических и генетических методов, аттенуированы и в настоящее время являются апатогенными [12]. Онколитическое действие RVK штаммов № 100 и № 228 определяли в цитотоксическом тесте с МТТ на двух клеточных линиях глиом U87MG и T98G. Результаты анализа уровня апоптоза в культуре клеток U87MG в контроле и после воздействия RVK показали, что в концентрации вирусных частиц 107 частиц/мл доля клеток на поздней стадии апоптоза увеличивалась в 1,9 раза по сравнению с контролем (23,3 и 12,4%, соответственно). В ходе настоящего исследования была обнаружена разная чувствительность культур глиом к исследованным ротавирусным штаммам, а также разная активность этих штаммов с более выраженным литическим действием RVK на клетки U87MG. В связи с этим мы отметили онколитический эффект штаммов RVK на клетки U87MG [13].

Наряду с этим исследовали микросателлитную нестабильность первичных клеточных линий низкодифференцированных глиальных опухолей на разных пассажах. Микросателлитный анализ был выполнен на первичных культурах анапластической астроцитомы и глиобластомы с использованием следующих маркеров: D17S250, D2S123, D5S346, NR21, NR24, NR27, BAT25, BAT26 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). В первичной культуре клеток анапластической астроцитомы после 6-го пассажа наблюдалось изменение в локусе D17S250 (148-148/148-152) по сравнению с первичным материалом опухолевой ткани пациента. Было показано, что первичные клеточные линии глиобластомы являются генетически более стабильными в сравнении с первичными клеточными линиями анапластической астроцитомы [14].

Кроме того, в рамках проекта по созданию персонифицированной 3D модели микроокружения опухоли были протестированы методы висячей капли и 3D принтинга. В первом случае оценивали возможность применения покрытия из силиконового эластомера (СИЭЛ) 159-330 (Россия) для модификации метода висячей капли. Для этого изучили цитотоксические свойства покрытия СИЭЛ 159-330 и его влияние на процесс формирования клеточных сфероидов в висячей капле, а материалом для исследования были клетки культуры рака молочной железы BT-474. В результате эксперимента было показано, что в процессе образования клеточного сфероида в висячей капле покрытие СИЭЛ 159-330 по сравнению с полистиролом способствует ускоренной агрегации клеток в нижней части капли. Кроме того, образующиеся на покрытии из СИЭЛ 159-330 сфероиды обладают более компактной структурой и механической прочностью, что делает их более устойчивыми к манипуляциям и дает возможность использовать СИЭЛ 159-330 в 3D-культурах клеток редких и малочисленных клеточных популяций, например, стволовых клеток опухоли или минорных субпопуляций лимфоцитов [15].

Для создания 3D моделей микроокружения опухоли рака молочной железы тестировали условия и режимы печати конструктов, состоящих из инкапсулированных опухолевых клеток постоянных клеточных линий рака молочной железы BT-20 и MDA-MDB474. В настоящем исследовании использовали метод экструзионной 3D печати на биопринтере BIO X (Cellink, США) с биочернилами на основе альгината и метакрилата желатина GelMa. Напечатанные конструкты полимеризировали двумя способами: химическим или фотоотверждением. В результате удалось спроектировать квадратные, 3-слойные конструкты с инкапсулированными клетками рака молочной железы из биочернил GelMa с помощью фотоотверждения, которое способствовало сохранению клеточной морфологии, приближенной к наблюдаемой in vivo [16].

Перспективы

В качестве ближайших планов — создание конструктов микроокружения опухоли с использованием первичных клеточных линий различных нозологий. Кроме того, есть стремление к созданию гетерогенных конструктов с использованием различных типов клеток в зависимости от патологии.

В перспективе планируется создание in vivo подобной тест-системы для оценки эффективности противоопухолевых лекарственных препаратов, обладающей свойствами опухоли, за счёт воспроизведения in vitro взаимодействий первичных клеточных культур рака и клеток микроокружения опухоли (рисунок 4).

В таких моделях, наряду с повторением клеточного состава первичной опухоли, воспроизводятся и химические градиенты, играющие важную роль в процессах устойчивости клеток опухоли к лекарственной терапии, а также взаимодействие с локальным и системным иммунитетом. Тест-системы на основе таких моделей могут быть востребованы как в доклинических исследованиях, так и в персонализированном подборе лекарственной терапии.

Заключение

Таким образом, отработанный алгоритм работы клинических и научных подразделений ФГБУ "НМИЦ онкологии" Минздрава России обеспечивает базу для проведения исследований и гарантирует высокое качество биообразцов, надежное долговременное хранение и тщательно проверенную информацию по каждому образцу.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.