Подходы к автоматизации преаналитического этапа крупномасштабных научных исследований в биобанке ФГБУ «НМИЦ ТПМ» Минздрава России

Введение

С каждым годом биобанкирование играет все более важную роль в развитии современных биомедицинских технологий и проведении научно-исследовательских работ, обеспечивая исследователей биоматериалом надлежащего качества в необходимом количестве. Одним из подходов, позволяющих гарантировать соблюдение регламента проведения пробоподготовки биообразцов и при этом минимизировать количество ошибок, связанных с влиянием человеческого фактора, является оснащение биобанков автоматическими роботизированными станциями, предназначенными для раскапывания жидких биообразцов (аликвотирования). Универсальность автоматизированных систем аликвотирования позволяет использовать их в работе с различными типами образцов биологических жидкостей в условиях, когда аликвотирование требует высокой точности [1]. Автоматизированные станции при снабжении их соответствующими модулями могут широко применяться при выделении дезоксирибонуклеиновой кислоты/рибонуклеиновой кислоты (ДНК/РНК), постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР), пробоподготовке для геномного секвенирования, проведении иммуноферментного анализа (ИФА), для рассева жидких культур на чашки Петри, а также для выделения мононуклеарных клеток периферической крови [1-5].

Одной из наиболее широко используемых в биобанках станций является автоматизированная станция Freedom EVO марки Tecan — это модульная роботизированная платформа, осуществляющая дозирование жидких образцов и реагентов.

Биобанк ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России (далее — НМИЦ ТПМ), основанный в 2014г, непрерывно расширяется и требует усовершенствования способов обработки и хранения биологического материала. Растет количество и масштаб научных проектов, связанных с использованием биоматериала и технологий биобанкирования [6]. Одной из актуальных и наиболее крупных научно-исследовательских работ НМИЦ ТПМ с неотъемлемым участием биобанка является "Разработка интегрированных систем прогнозирования в персонализированной медицине". В рамках этого проекта запланирована разработка систем прогнозирования развития и прогрессирования хронических неинфекционных заболеваний (артериальная гипертензия, атеросклероз и его осложнения, сердечная недостаточность, ожирение, неалкогольная жировая болезнь печени, сахарный диабет, онкологические заболевания и др.) на основании комплексного исследования клинических, омиксных данных и факторов внешней среды за счет анализа больших массивов данных, а также современных алгоритмов персонифицированного подхода к диагностике, лечению и профилактике редких и хронических неинфекционных заболеваний, включающего полноценный комплексный анализ потенциальной генетической предрасположенности.

Для реализации проекта будет создана коллекция биообразцов цельной крови, сыворотки и плазмы крови от пациентов, госпитализированных в НМИЦ ТПМ; для повышения репрезентативности выборки будет использован метод сплошного набора. Ключевой задачей проекта является создание обширной единой базы данных, совмещенной с электронной историей болезни и содержащей полную информацию об образцах и пациентах-участниках исследования (клиниколабораторные, социально-демографические, поведенческие, психологические данные), в т.ч. динамичную информацию о клинических показателях и данные, полученные с помощью омиксных технологий с использованием сохраненных в биобанке биообразцов.

Проведение первого этапа исследования, предполагающего биобанкирование 60 тыс. аликвот сыворотки и плазмы крови от 5000 участников в течение 1,5 лет в рамках непрерывного сбора биоматериала, потребовало специальной подготовки. Для оптимизации хранения планируемого количества аликвот возникла потребность в использовании криопробирок объемом 1 мл. Использование таких криопробирок при ручном раскапывании образцов затруднено из-за их маленького размера (узкого горла), потому целесообразно применять автоматическое раскапывание с помощью робота-аликвотера. Кроме того, необходимость автоматизировать процесс аликвотирования образцов сыворотки и плазмы крови была продиктована планируемым большим ежедневным потоком биоматериала от участников исследования.

Биобанк НМИЦ ТПМ оснащен роботизированной станцией аликвотирования Tecan Freedom EVO 150. В рамках подготовки к проведению исследования было необходимо создать протокол автоматизированного аликвотирования биоматериала на роботе-аликвотере в соответствии с задачами научного проекта и валидировать разработанную методику путем проведения сравнительной оценки разработанного протокола с традиционным ручным методом обработки биообразцов. На начальном этапе были сформулированы требования, предъявляемые к разрабатываемой методике: исключение ошибок, связанных с влиянием человеческого фактора, сокращение времени аликвотирования, экономия места в морозильных камерах, получение биоматериала надлежащего качества. Таким образом, целью настоящего исследования было создание и валидация алгоритма автоматического аликвотирования образцов сыворотки и плазмы крови для биобанкирования в рамках широкомасштабного научного исследования.

Материал и методы

Дизайн исследования в рамках научного проекта "Разработка интегрированных систем прогнозирования в персонализированной медицине" предполагает сбор образцов венозной крови в суммарном объеме 20,5 мл от каждого участника с целью получения и хранения образцов цельной крови, сыворотки и двух видов плазмы. В набор первичных пробирок включили: пробирку с цельной кровью с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) объемом 4 мл от каждого участника для генетических исследований (не аликвотируется), одну пробирку-вакутейнер с желтой крышкой объемом 8 мл, для получения 6 аликвот сыворотки крови по 0,5 мл, одну пробирку с фиолетовой крышкой объемом 4 мл для получения 3 аликвот плазмы-ЭДТА по 0,5 мл и одну пробирку с голубой крышкой объемом 4,5 мл для получения 3 аликвот по 0,5 мл плазмы с цитратом натрия. Количество проб биоматериала для хранения от каждого участника было рассчитано таким образом, чтобы обеспечить возможность проведения в дальнейшем широкого спектра исследований на полученном биоматериале: исходя из вида и количества запланированных по проекту анализов и потенциальных будущих исследований, а также из необходимости соблюдения условия однократного использования биообразца без повторения циклов замораживания/оттаивания [7].

Стандартная пробоподготовка крови в рамках биобанкирования представляет собой последовательное выполнение следующих этапов: центрифугирование, аликвотирование, замораживание и внесение информации, ассоциированной с биообразцом, в базу данных биобанка. Перед центрифугированием первичные пробирки со взятой кровью для получения сыворотки выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре, а для получения плазмы — <30 мин, затем центрифугируют в течение 15 мин при 4° C со скоростью 1900 g (3260 об./мин). После центрифугирования проводят визуальный контроль биоматериала на наличие гемолиза и хилеза. Качественные образцы раскапывают по аликвотам.

Автоматическое аликвотирование проводили на роботе-аликвотере. Автоматизированная станция аликвотирования в биобанке НМИЦ ТПМ представлена модульным рабочим столом Freedom EVO 150, оснащенным автоматическим пипетирующим манипулятором (LiHa) для 4 наконечников (с фильтром или без фильтра), системой анализа фракций TubeEye и сканером шрихкодов.

Результаты и обсуждение

1. Создание протокола (программы, скрипта) автоматического аликвотирования

Дизайн запланированного исследования предполагает получение образцов крови от одного участника в 3 типа пробирок-вакутейнеров. Для отработки метода под каждый тип пробирок в специальном программном обеспечении (ПО) прибора EVOware Standart была написана индивидуальная программа аликвотирования. Чтобы обеспечить весь процесс автоматического аликвотирования, в программе последовательно описывали каждый шаг, который необходимо проделать роботу-аликвотеру, включая смену наконечников при переходе от одного типа биоматериала к другому. Программный интерфейс EVOware содержит: панель доступных команд для манипуляторов и встроенных устройств, библиотеки классов жидкостей, штативов и лабораторного пластика, а также области для создания протокола и виртуального рабочего стола. Написание рабочей программы начинают с конфигурации виртуального рабочего стола станции.

Перед написанием скрипта для каждого проекта необходимо провести калибровку всех используемых расходных материалов (штативы, наконечники, пробирки) и внести данные калибровки в память прибора, затем разместить их на виртуальном рабочем столе в ПО робота-аликвотера (рисунок 1). Для этого в поле виртуального рабочего стола манипулятором "мышь" расставляют штативы и лабораторный пластик в соответствии с поставленной задачей. Фактическая конфигурация рабочего стола выстраивается в соответствии с виртуальной. Порядок расположения пробирок на виртуальном и реальном столах робота-аликвотера должны совпадать [8].

После создания виртуального рабочего стола приступают к написанию программы аликвотирования. При работе с жидкостями основными являются команды управления пипетирующим манипулятором (LiHa) по надеванию одноразовых наконечников (Get DiTi), забору жидкости (Aspirate), внесению жидкости (Dispense), сбросу наконечников (Drop DiTi). С помощью манипулятора "мышь" из панели доступных команд программного интерфейса EVOware Standart соответствующие команды переносятся в поле написания скрипта. При этом открывается диалоговое окно для задания дополнительных параметров, таких как количество используемых наконечников, необходимый объем, класс жидкости, позиция на виртуальном рабочем столе, параметры циклов и другие. Выполнение команд программы происходит последовательно — строка за строкой. Помимо этого, можно формировать циклы, которые содержат как одну строку команды, так и группы строк. Программирование в EVOware Standart устроено по принципу петель, т.е. для процесса "забора-аликвотирования" прописывается количество повторений, которое необходимо сделать для раскапывания одной пробирки, и шаг (переход), который делает робот при смене пробирок [2]. В рамках планируемого проекта при создании "петли" для аликвотирования сыворотки было прописано 6 повторений, а для обоих типов плазмы — по 3, что соответствует количеству аликвот, которое необходимо получить, с шагом в один ряд криопробирок для смены наконечника. При запуске программы такие параметры, как количество образцов, объемы дозирования, временные интервалы и др. можно варьировать.

Важной составляющей корректного выполнения задач по аликвотированию и дозированию является правильное указание класса жидкости в поле дополнительных параметров [3]. В зависимости от указанного класса жидкости пипетирующий манипулятор определяет, как работать с тем или иным материалом. При выборе класса жидкости указываются также позиции наконечников при заборе и внесении жидкости, параметры детектирования уровня жидкости, скорости аспирации и внесения образца.

В рамках исследования для оптимального дозирования каждой жидкости были подобраны индивидуальные параметры. Поскольку прибор оснащен автоматическим дозатором для 4 наконечников, аликвотирование образцов проводилось одновременно из 4 первичных пробирок одного типа. Смену наконечников осуществляли после аликвотирования каждого вида биоматериала. Таким образом, за один запуск (полный цикл) получали последовательно аликвоты сыворотки от 4-х пациентов-участников исследования, затем — плазмы с ЭДТА и плазмы с цитратом натрия.

Для того чтобы сыворотку и плазму крови аликвотировать в чистом виде, не захватывая клеточный осадок, использовали дополнительный модуль робота-аликвотера — камеру TubeEye, для которой в специальном ПО написали программу, позволяющую калибровать камеру и анализировать фракции в отцентрифугированных пробиркахвакутейнерах. При калибровке вакутейнеров для TubeEye учитывали количество фаз, высоту и диаметр пробирки. Камеру TubeEye откалибровали таким образом, чтобы наконечник не опускался ниже 1 мм от фазы осадка в пробирках с плазмой крови и не захватывал слой лейкоцитарной пленки. В результате в ПО прибора были созданы профили для оценки фракций в пробирках разного объема. Интерфейс программы TubeEye представлен на рисунке 2. Розовая полоска маркирует разделение фаз.

Робот-аликвотер оснащен сканером штрихкодов. С использованием соответствующей команды в скрипте осуществляли автоматическое сканирование штрихкодов, нанесенных на первичные пробирки. QR-коды на дне криопробирок сканировали целым штативом на сканере IntelliCode, ПО которого создает экспортный файл с информацией о штрихкодах криопробирок и их расположении в штативе. Строка Export Data в программе аликвотера генерирует экспортный файл в формате CSV с полной информацией о том, из какой пробирки в какую перемещалась жидкость. Компиляция экспортных файлов является завершающим этапом выполнения программы аликвотирования, в результате чего в специальном формате создается файл, содержащий информацию о штрихкодах первичных пробирок, QR-кодах криопробирок, позиции криопробирок в штативе, типе и объеме образца для дальнейшего импорта в программу хранения FreezerPRO.

2. Автоматическое аликвотирование образцов крови в соответствии с написанной программой (скриптом)

Подготовку биоматериала к автоматизированному аликвотированию сыворотки и плазмы крови проводили по стандартной методике, описанной в разделе "Материалы и методы". После центрифугирования пробирки-вакутейнеры с сывороткой и плазмой крови, предназначенные для автоматического аликвотирования, переносили в соответствующие стойки для первичных пробирок робота-аликвотера в точном соответствии с расположением на виртуальном столе в программе прибора. Штативы с криопробирками также расставляли на рабочем столе прибора в соответствии с виртуальной схемой. После сканирования штрихкодов первичных пробирок-вакутейнеров и криопробирок начинали аликвотирование в соответствии с написанной программой.

Для учета и дальнейшей идентификации образцов информацию о полученных аликвотах вносили в программу хранения данных, сопровождающих биообразцы, — FreezerPRO. Для загрузки данных в программу FreezerPRO использовали соответствующий проведенному запуску файл, сформированный прибором в формате CSV, в котором есть идентификационный номер пациента-участника исследования (штрихкод с первичных пробирок), штрихкоды криопробирок с полученными аликвотами, тип каждого образца, объем полученных аликвот, в который дополнительно вносили дату и время забора образца, время центрифугирования и заморозки. Также в загрузочном файле для FreezerPRO прописывали расположение штатива в морозильной камере (номер морозильника, полки, стеллажа и штрихкод штатива). После завершения цикла раскапывания готовые аликвоты сыворотки крови, плазмы с ЭДТА и плазмы с цитратом натрия размещали в морозильных камерах в соответствии с прописанным расположением в FreezerPRO и замораживали при -70° C, а цельную кровь — при температуре -30° C.

3. Валидация и сравнение методов ручного и автоматизированного аликвотирования

В соответствии с определением, представленным в стандарте ГОСТ Р ИСО 9000-2015, валидация — это подтверждение на основе представления объективных свидетельств того, что требования, предназначенные для конкретного использования или применения, выполнены.

На первом этапе валидации метода было проведено 8 тестовых запусков прибора и, соответственно, полных циклов работы робота-аликвотера для 64 участников. Продолжительность одного цикла аликвотирования биообразцов от 8 участников по разработанной методике составила от 15 до 20 мин. Таким образом, было установлено, что подготовка и проведение автоматического раскапывания для 32 человек (ожидаемый ежедневный поток участников в исследовании), т.е. предварительная подготовка и 4 запуска робота-аликвотера, длится суммарно <1,5 ч.

На втором этапе эксперимента сравнивали автоматизированный и ручной методы раскапывания. Для этого биоматериал от 64 участников разделили на две равных группы для дальнейшего аликвотирования. Пробирки-вакутейнеры с сывороткой и плазмой от 32 участников аликвотировали на роботе-аликвотере и параллельно начинали ручное раскапывание биообразцов второй группы. Эксперимент показал, что при раскапывании в ручном режиме для получения аликвот сыворотки и плазмы крови от 32 участников потребовалось >2 ч. При этом исполнитель испытывал напряжение и дискомфорт, сложность в безошибочном попадании в маленькие криопробирки с узким горлом, плотно прилегающие друг к другу в криоштативе, что значительно повышало влияние человеческого фактора на точность аликвотирования. Таким образом, в ходе сравнительного эксперимента было показано, что применение автоматизированного метода аликвотирования образцов сыворотки и плазмы крови позволяет сократить временные затраты на 25% и полностью исключить ошибки, связанные с влиянием человеческого фактора.

Валидация метода автоматического аликвотирования образцов сыворотки и плазмы крови в биобанке НМИЦ ТПМ подтвердила соответствие разработанной методики требованиям запланированного крупномасштабного исследования и показала, что применение автоматического раскапывания биообразцов имеет ряд существенных преимущества перед ручным. Данная методика позволяет повысить качество и эффективность проведения пробоподготовки (преаналитического этапа), в т.ч. сократить на 25% время и увеличить точность аликвотирования биоматериала, а также в 2 раза уменьшить занимаемое биоматериалом место в морозильных камерах долговременного хранения в связи с возможностью использования формата криопробирок с узким горлом.

По результатам проведенных экспериментов было показано, что оптимальный вариант использования ресурсов для запланированного исследования достигается при однократной загрузке робота-аликвотера 24 пробирками с биообразцами от 8 участников, что при запланированных в исследовании 3-х первичных пробирках и 12 аликвотах от одного участника, позволяет обеспечить полную загрузку криоштатива на 96 криопробирок по 1 мл за один цикл автоматического аликвотирования.

На финальном этапе была разработана стандартная операционная процедура (СОП) автоматизированного метода аликвотирования с использованием станции Tecan Freedom EVO при проведении преаналитического этапа крупномасштабного исследования. Этот документ содержит подробное последовательное описание всех действий, связанных с автоматическим аликвотированием в рамках данного проекта и позволяет не только контролировать качество выполняемой работы, но и проводить обучение сотрудников-исполнителей.

СОП "Инструкция по автоматическому аликвотированию сыворотки крови, плазмы с ЭДТА и плазмы с цитратом натрия от 8 участников по 12 аликвот" состоит из стандартных разделов: назначение, используемое оборудование и материалы, перечень документов, применяемых при работе и описание процедуры. Назначением данной СОП является установление правил и последовательности работы при аликвотировании биоматериала на автоматическом модульном анализаторе Tecan Freedom EVO с модулем для анализа фракций крови в биобанке по специально написанным программам для данного проекта. Перечень необходимых материалов и оборудования включает: автоматический модульный анализатор с модулем для анализа фракций крови; персональный компьютер; программное обеспечение EVOware, TubeEye; программу информационного сопровождения биобанкирования FreezerPRO; сканер QR-кодов IntelliCode; криопробирки на 1 мл с нанесённым 2D штрихкодом 96-луночного формата в штативах и наконечники для автоматического аликвотирования объемом 1000 мкл. СОП подробно описывает правила включения прибора и его подготовки к работе. Далее последовательно описано, как в соответствии с программой, используя опции маски ввода ПО, провести запуск и полный цикл аликвотирования образцов сыворотки, плазмы с ЭДТА и цитратной плазмы. Для каждого типа биоматериала СОП содержит правила расстановки и количество первичных пробирок и криопробирок, проведения процедуры анализа фракций и манипуляций, которые необходимо провести оператору прибора с помощью интерфейса ПО для осуществления полного цикла автоматического аликвотирования. Заключительным разделом СОП является описание процедуры формирования файла в CSV-формате с информацией о полученных аликвотах (идентификационный номер и QR-код участника исследования, вид и объем биоматериала) и этапа загрузки этой информации в программу FreezerPRO, а также правил выключения прибора.

Заключение

Разработан и валидирован алгоритм автоматического аликвотирования образцов сыворотки и плазмы крови для биобанкирования в рамках широкомасштабного научного исследования.

Подготовка к работе с роботом-аликвотером требует времени, внимательного подбора параметров аликвотирования, расчета оптимального количества пробирок с первичным биоматериалом и криопробирок для получения и дальнейшего хранения аликвот и, главное, написания протокола (программы), включающего все этапы аликвотирования, с использованием ПО робота-аликвотера. Кроме того, важно провести пробные запуски в необходимом количестве для валидации метода. Несмотря на сложность подготовки, дальнейшее применение метода автоматического аликвотирования в широкомасштабном научном исследовании не только облегчает процесс пробоподготовки, но и повышает его эффективность и качество полученных биообразцов.

Автоматическое раскапывание имеет существенные преимущества перед ручным: позволяет осуществить широкомасштабное биобанкирование, повысить качество и эффективность проведения пробоподготовки (преаналитического этапа), в частности, сократить время и увеличить точность аликвотирования биоматериала, исключив влияние человеческого фактора, а также сэкономить место в морозильных камерах длительного хранения благодаря формату используемых криопробирок.

Разработанный алгоритм написания программ аликвотирования и проведения расчетов оптимального использования расходных материалов является основой для использования в других проектах.

Благодарности. Авторы выражают признательность Александру Лосковичу, руководителю направления "Молекулярная генетика и автоматизация" ООО "Квадрос-Био" за техническую поддержку и консультативную помощь.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.