Изучение роли свободных нуклеотидов при хронической сердечной недостаточности

Введение

Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) остается одной из наиболее значимых проблем здравоохранения ввиду выраженного социального и экономического ущерба, причиняемого данной патологией [1]. Высокий уровень инвалидизации и смертности пациентов с ХСН сравним с аналогичными показателями при злокачественных новообразованиях [2], при этом степень выраженности нарушения кровообращения оказывает непосредственное влияние на прогноз больного. Известно, что пациенты с низкой фракцией выброса (ФВ) и/или с тяжелой стадией ХСН, а также с частыми декомпенсациями, относятся к прогностически наиболее неблагоприятным группам [3]. Отдельного внимания заслуживает изучение влияния сопутствующей патологии, т.к. в силу возраста наиболее частыми представителями среди пациентов с ХСН являются коморбидные больные [4][5].

Согласно клиническим рекомендациям, как Российского, так и Европейского обществ кардиологов, основной лабораторный показатель, определяемый с целью верификации ХСН — это уровень N-концевого промозгового натрийуретического пептида (NT-proBNP) [6][7]. В то же время известно, что увеличение концентрации NT-proBNP в крови не является абсолютно специфичным в диагностике ХСН, и существуют иные, как кардиальные, так и некардиальные причины его повышения [8].

С учетом имеющихся сведений о роли иммуновоспалительной теории в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний, перспективным направлением представляется дальнейшее изучение маркеров системного повреждения тканей. Отдельного внимания требует исследование этих маркеров у пациентов с различными фенотипами сердечной недостаточности, что также может расширить имеющиеся сведения о подходах к лечению. Одними из таких биомолекул являются свободные нуклеотиды в плазме крови, являющиеся универсальными показателями стрессовых реакций и имеющие научное обоснование для изучения в качестве перспективных биомаркеров при сердечно-сосудистых заболеваниях [9]. Выполняя структурную, ферментативную, сигнальную, энергетическую функции, нуклеотиды обеспечивают нормальное течение биохимических процессов [10]. Помимо нуклеотидов, входящих в состав нуклеиновых кислот, в организме присутствует немалое количество свободных нуклеотидов. Основной нуклеотидный пул на 90% формируется в результате синтеза, незначительная часть образуется в результате частичного гидролиза нуклеиновых кислот [11]. Влияние стрессового агента (высокая/низкая температура, гипоксия, патология любой системы и др.) приводит к изменению метаболизма пуриновых нуклеотидов, нарушению соотношения компонентов гуаниновой — ГМФ (гуанозинмонофосфат), ГДФ (гуанозиндифосфат), ГТФ (гуанозинтрифосфат) и адениновой — АМФ (аденозинмонофосфат), АДФ (аденозиндифосфат), АТФ (аденозинтрифосфат) систем, что связано с адаптационными потребностями организма и может рассматриваться в качестве индикатора клеточных нарушений [12].

В связи с этим дальнейший поиск и изучение диагностического и терапевтического потенциала свободных нуклеотидов являются актуальными. С целью повышения диагностической и прогностической точности этих показателей, как потенциальных маркеров ХСН, необходимы исследования, основанные на комплексной оценке индивидуальных особенностей пациента.

Цель настоящего исследования — изучить возможность оценки уровня свободных нуклеотидов в плазме крови в качестве потенциальных дополнительных биомаркеров ХСН с учетом ФВ, функционального класса (ФК), наличия сахарного диабета 2 типа (СД), а также проанализировать изменение их концентраций на фоне проводимой терапии у больных со сниженной ФВ.

Материал и методы

В работу были включены: 67 человек с подтвержденным клинико-лабораторными и инструментальными методами диагнозом ХСН, находящихся под диспансерным наблюдением кардиолога амбулаторно-поликлинического звена; 23 здоровых добровольца (Контроль) аналогичного возраста и пола, без установленных хронических заболеваний, которые обратились для проведения профилактических мероприятий.

Критерии включения: пациенты с установленным диагнозом ХСН, возраст 40-85 лет, подписанное информированное добровольное согласие пациента на участие в исследовании. Для лиц контрольной группы — отсутствие документированных сведений о хронических заболеваниях, клиническое благополучие на момент исследования, подписанное информированное добровольное согласие на участие в исследовании. Проведение исследования одобрено Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО ВГМУ (заседание № 5 от 18.10.2022).

Критерии невключения: злокачественное новообразование вне зависимости от стадии и локализации, включая наличие в анамнезе, ХСН IV ФК по Нью-Йоркской классификации (NYHA — New York Heart Association (Functional Classification)), ХСН III стадии по классификации Н. Д. Стражеско и В. Х. Василенко (согласно российским клиническим рекомендациям по ведению пациентов с ХСН 2020 года), ожирение ≥2 ст. (индекс массы тела (ИМТ) >35 кг/м²), дефицит массы тела (ИМТ <18,5 кг/м²), наличие острого нарушения мозгового кровообращения или транзиторной ишемической атаки в анамнезе давностью <6 мес., наличие острого инфаркта миокарда в анамнезе давностью <1 мес., СД 1 типа, хроническая болезнь почек ≥С4 стадии.

Общая характеристика пациентов представлена в таблице 1.

Клинико-лабораторное и инструментальное обследование пациентов с ХСН включало физикальный осмотр, общий анализ крови, биохимический анализ крови с определением показателей липидного профиля, уровней глюкозы, креатинина, NT-proBNP, а также электрокардиографию, эхокардиографию, ультразвуковое исследование органов брюшной полости, рентгенографию органов грудной клетки, тест с 6-мин. ходьбой для определения ФК ХСН. На этапе включения в исследование оценивалась схема ранее получаемой пациентами медикаментозной терапии, и при необходимости проводилась коррекция согласно алгоритмам, представленным в Российских клинических рекомендациях по ведению пациентов с ХСН, 2020. Повторный забор крови проведен через 6±0,2 мес. в группе пациентов со сниженной ФВ (n=18).

Содержание свободных нуклеотидов в плазме крови анализировали хроматографическим методом на автоматизированной системе FPLS^® System (Швеция) с использованием колонки размером 10×200 мм с Q Sepharose Fast Flow. К 600 мкл отцентрифугированной плазмы крови добавляли дважды по 200 мкл охлажденной хлорной кислоты, раствор тщательно перемешивали и в течение 5 мин центрифугировали. После осаждения нуклеопротеидного комплекса 600 мкл надосадочной жидкости подщелачивали 1 N раствором охлажденного KOH для нейтрализации pH, центрифугировали 2-3 мин. Далее 100 мкл плазмы крови наносили на колонку. Предварительно удаляли неорганические соли из ионообменника, промывку системы проводили дистиллированной водой, затем 1 N раствором HCl. Уравновешивали буферным раствором, начинали элюирование со скоростью потока 1,5 мл/мин при длине волны 260 нм. В качестве буфера использовали ступенчатый градиент, состоящий из двух компонентов: А — 0,05 N HCl; Б — 0,1 N HCl + 0,5 М NaCl. Время выхода буфера А составляло с 0 по 8 мин, буфера Б — с 9 по 31 мин. Для идентификации нуклеотидного состава плазмы крови использовали хроматографическое разделение известных нуклеотидов, которые сопоставлялись с выделенными нуклеотидными фракциями. Количество выделенных нуклеотидов определяли путем измерения площади элюированных пиков (в мм²).

Статистическая обработка результатов исследования проведена с помощью программ Microsoft Office Excel (2007) и Statistica SPSS SPSS 17. Нормальность распределения вариационных рядов оценивали с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. По большинству критериев преобладало нормальное распределение, поэтому проверку статистических гипотез проводили с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для несвязанных выборок или парного t-критерия для связанных выборок. Данные представлены как среднеарифметическое значение и ошибка среднего (М±m). Различия считали статистически значимыми при уровне значимости p<0,05.

Результаты

Основные показатели биохимического анализа крови пациентов с ХСН представлены в таблице 2. Средние значения глюкозы, общего холестерина (ХС), ХС липопротеинов низкой плотности находятся выше референтных границ и свидетельствуют о нарушении углеводного и липидного обмена в целом в исследуемой группе. Концентрация NT-proBNP, многократно превосходящая установленное нормальное значение, также указывает на наличие структурных изменений миокарда.

Экскреция свободных (кислоторастворимых) нуклеотидов у практически здоровых лиц происходила в виде 6 пиков: аденозина (А), АМФ, АДФ, ГДФ, АТФ, ГТФ. В то же время у всех больных с ХСН постоянно выделялись только 4 пика: А, АМФ, АДФ и ГДФ. Выделение АТФ наблюдалось только у 50% пациентов, ГТФ — у 3-13% пациентов. Примеры типичных хроматограмм у практически здоровых лиц и пациентов с ХСН представлены на рисунках 1, 2.

Количественный анализ выделяемых нуклеотидов, проведенный у больных с ХСН, и контрольной группы обнаружил более низкие уровни А — 30,45±2,61 vs 56,68±3,99 мм² (p=0,001), АМФ — 278,60±18,60 vs 391,68±39,86 мм² (p=0,022), ГДФ — 500,27±22,83 vs 901,63±51,09 мм² (p=0,001), АТФ — 49,25±8,89 vs 145,18±18,80 мм² (p=0,001), ГТФ — 32±8,25 vs 92,40±27,07 мм² (p=0,041). Уровень АДФ (690,10±57,41 мм²) был достоверно выше у пациентов с ХСН по сравнению с контрольной группой (392,09±32,63 мм²) (p=0,002).

Согласно результатам определения содержания свободных нуклеотидов в плазме крови в зависимости от фракции выброса (классификация Российских клинических рекомендаций 2020 — группы с ФВ ≥50%, n=24, ФВ =40-49%, n=25, ФВ <40%, n=18), обнаружено более низкое содержание А, ГДФ и АТФ, более высокие уровни АДФ в каждой из исследуемых групп по сравнению с контрольной группой (t_расч.>t_крит., p<0,05). Кроме того, выявлен более низкий уровень АМФ по сравнению с контролем в группах с ФВ =40-49% (t_расч.>t_крит., p=0,024) и ФВ <40% (t_расч.>t_крит., p=0,001) (таблица 3).

Анализ уровня свободных нуклеотидов в плазме крови больных с ХСН в зависимости от ФК (I, n=16, II, n=30, III, n=21) характеризуется аналогичными результатами, а именно более низким содержанием А, АМФ, ГДФ и АТФ, более высоким уровнем АДФ по сравнению с контрольной группой (t_расч.>t_крит., p<0,05) в группах ФК II, ФК III. В группе пациентов с ФК I присутствуют такие же закономерности, за исключением содержания АМФ (таблица 4).

В работе, проведенной нами ранее, была рассчитана средняя концентрация NT-proBNP у больных с ХСН и различными ФВ и ФК (таблицы 3, 4). Полученные данные свидетельствуют также о наличии достоверной разницы уровня NT-proBNP с контрольной группой (t_расч.>t_крит., p<0,05), а статически значимые межгрупповые отличия наблюдаются между пациентами с ФВ ≥50% и ФВ <40% (p=0,001), ФВ =40-49% и ФВ <40% (p=0,013) и между группами ФК I и ФК III (p=0,001).

Наиболее часто встречающейся сопутствующей патологией в исследуемой группе пациентов был СД 2 типа, поэтому был проведен анализ 28 пациентов с сочетанием ХСН и СД 2 типа (ХСН+СД 2 типа). Свободные нуклеотиды у пациентов ХСН+СД 2 типа в 100% случаев элюируют виде 4 пиков: А, АМФ, АДФ, и ГДФ. Выделение АТФ происходит только у 12 (54,55%) человек, ГТФ — у 2 (9,09%). Статистически значимых различий уровней свободных нуклеотидов между пациентами с ХСН с СД 2 типа и без него выявлено не было. Количественный анализ содержания свободных нуклеотидов у пациентов с ХСН+СД 2 типа и контрольной группы обнаруживает более низкие уровни А — 37,98±5,10 мм² (p=0,001), АМФ — 280,73±22,00 мм² (p=0,021), ГДФ — 489,77±32,18 мм² (p=0,003) и АТФ — 54,5±16,59 мм² (p=0,000), увеличение уровня АДФ — 705,64±76,16 мм² (p=0,001).

На этапе включения в исследование был проведен анализ принимаемой пациентами терапии на предмет наличия основных классов препаратов для лечения ХСН (ингибиторы ренин-ангиотензиновой системы/антагонисты ангиотензиновых рецепторов и неприлизина, β-блокаторы, антагонисты минералокортикоидных рецепторов, ингибиторы натрий-глюкозного котранспортера 2-го типа, диуретики) и целевых дозировок, указанных в Российских клинических рекомендациях. Полученные сведения представлены на рисунке 3. Все пациенты получали β-блокаторы, ингибиторы ренин-ангиотензиновой системы, с небольшим преобладанием ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента (55%) над блокаторами ангиотензиновых рецепторов (40%), 5% больных принимали препарат валсартан+сакубитрил, 4% получали дапаглифлозин/эмпаглифлозин, а 73% больных получали антагонисты минералокортикоидных рецепторов. При этом достижение пациентами целевых дозировок на старте исследования составляло в среднем ~60%. За период, составивший 2-3 мес., была проведена работа по коррекции схемы терапии: замена препарата, включение ранее неиспользуемой группы, титрация дозы до рекомендованной. Исходя из рисунка 3 основные изменения через 6±0,2 мес. выглядят следующим образом: значимо увеличилась доля пациентов, принимающих валсартан+сакубитрил (18%), дапаглифлозин/эмпаглифлозин (48%), кроме того, на фоне диуретической терапии достигнуто состояние эуволемии, а количество пациентов, находящихся на целевых дозах лекарств, составило ~80%.

Для оценки возможных изменений на фоне проводимой медикаментозной терапии повторно исследован уровень свободных нуклеотидов в группе больных c ХСН со сниженной ФВ (ФВ <40%). Образцы нуклеотидного профиля пациентов данной группы на этапе включения и через 6±0,2 мес. представлены на рисунках 4, 5, соответственно. Полученные результаты отражают значительные изменения содержания свободных нуклеотидов в крови пациентов со сниженной ФВ по сравнению с уровнями на этапе включения: у всех обследованных (в 100%) появляются фракции АТФ и ГТФ, чего не наблюдалось при первоначальном обследовании, содержание АДФ в плазме крови достоверно снижается и составляет 307±26,08 мм² (р=0,001), фракция ГДФ статистически значимо возрастает (650,47±58,10 мм², р=0,020), но остается значительно сниженной по сравнению с контролем.

Обсуждение

Используемый в настоящей работе хроматографический метод выделения свободных нуклеотидов позволил выявить следующие особенности нуклеотидного профиля у пациентов с ХСН: поскольку последовательность образования нуклеотидов и нуклеозидов — это единый процесс, то нарушение на одном этапе приведет к изменениям последующих звеньев. Более низкий уровень АТФ в крови пациентов с ХСН, а в некоторых случаях и вовсе отсутствие этого свободного нуклеотида в плазме, является отправной точкой дальнейших нарушений биохимических процессов. В условиях длительной гипоксии переключение энергообмена с аэробного на анаэробный приводит к дефициту образования АТФ [13], при этом происходит значительное увеличение концентрации свободного АДФ [14]. Данные отклонения мы и наблюдаем при анализе пациентов с ХСН. Дальнейшие этапы расщепления или дефосфорилирования приведут к образованию меньшего количества АМФ и А, причем данные отличия от контрольной группы также являлись достоверными. А является мощным вазодилататором, поэтому дефицит этого вещества провоцирует повышение тонуса сосудов, приводя к патологическим изменениям [15].

Уменьшение площади пиков ГТФ и ГДФ у пациентов с ХСН также имеет определенную функциональную обоснованность. Трансмембранная передача сигнала между рецепторами и эффекторными белками осуществляется с помощью универсальных посредников — G-белков (ГТФ-связывающих белков). Взаимодействие с α-субъединицей G- белка приводит к образованию активной формы α-ГТФ, дефосфорилирование данной молекулы сопровождается образованием неактивной α-ГДФ-формы [16]. Повторяющиеся этапы активации и дезактивации обеспечивают функционирование сигнально-рецепторной системы. Однако любая патология, вызывая нарушения на клеточном уровне, приводит к сбою в данной системе [17].

Выявленные нарушения сохранялись и при анализе с учетом критериев "фракция выброса" и "функциональный класс". Дополнительно был проанализирован уровень NT-proBNP в этих группах, также выявивший достоверную разницу с группой сравнения, кроме того убедительные межгрупповые отличия были представлены у пациентов с сохраненной и сниженной ФВ, с промежуточной и сниженной ФВ, с ФК I и III. Полученные результаты согласуются с мнением экспертов о взаимосвязи уровня натрийуретического пептида с объективным состоянием пациента, а именно нарушение сократительной способности миокарда или снижение толерантности к физической нагрузке сопровождается увеличением концентрации данного биомаркера в крови пациента [18][19].

По данным статистического анализа с позиции сопутствующей патологии, а именно: наличия СД 2 типа, не было выявлено достоверных отличий нуклеотидного профиля между больными СД 2 типа и без такового. Однако при количественном анализе уровней свободных нуклеотидов, проведенный в группе пациентов с ХСН и СД 2 типа, были обнаружены убедительные отличия содержания этих биохимических показателей по сравнению с контрольной группой. Возможным объяснением данного обстоятельства может быть как ограниченный размер выборки, так и тот факт, что основным и, очевидно, более значимым критерием является наличие ХСН, а не сопутствующая патология.

Повторный анализ свободных нуклеотидов у пациентов со сниженной ФВ свидетельствует о положительных изменениях на фоне проводимой терапии. Нуклеотидный профиль у пациентов данной группы, в динамике претерпевает изменения, демонстрируя тенденцию к нормализации биохимических процессов.

Ограничения исследования. К ограничениям исследования следует отнести малый размер выборки. Увеличение количества случаев вероятно повлияет на результаты и позволит выявить новые закономерности.

Заключение

Таким образом, проведенные клинические и лабораторно-инструментальные исследования выявили достоверные отличия уровней свободных нуклеотидов в плазме крови пациентов с ХСН от контрольной группы, при этом данная разница сохраняется вне зависимости от степени выраженности клинико-инструментальных нарушений и наличия сопутствующей патологии. Кроме того, исходя из результатов повторного анализа в группе пациентов со сниженной ФВ, исследуемый показатель подвержен динамическим изменениям, следовательно, может рассматриваться в качестве потенциального дополнительного биомаркера для оценки эффективности проводимых лечебных мероприятий.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.