Сравнительный анализ сывороточных уровней галанина у больных ишемической болезнью сердца с наличием и отсутствием сердечной недостаточности со сниженной фракцией выброса и у лиц без сердечно-сосудистых заболеваний

Введение

Галанин — эндогенный низкомолекулярный пептид, состоящий из 30 аминокислотных остатков, впервые выделенный из кишечника и поджелудочной железы свиньи в 1983г [1]. Своё название он получил по первой и последней аминокислотам в последовательности (глицин и аланин).

Биологическая активность галанина определяется его взаимодействием со специализированными галаниновыми рецепторами, связанными с G-белком. Известны три типа рецепторов галанина: GalR1, GalR2 и GalR3, которые различаются фармакологией, сигнализацией и распределением в организме [2]. GalR1 и GalR2 преимущественно локализуются в мозге, мышцах, жировой ткани и желудке [3], в то время как GalR3 экспрессируется в легких и почках [4]. Рецепторы всех трех типов также обнаружены в сердце [2][5], однако их экспрессия в разных отделах сердца изучена недостаточно [6].

За связывание с рецепторами отвечает N-концевой фрагмент пептида, первые 15 аминокислот которого консервативны у большинства видов [5]. Каждый из рецепторов имеет свою локализацию и специфические клеточные эффекты. GalR1 и GalR3 активируют Gi/o белки, что приводит к ингибированию аденилатциклазы, снижению уровня циклического аденозинмонофосфата и открытию калиевых каналов. Рецептор GalR2, взаимодействующий с белком Gq/11, активирует фосфолипазу C, регулируя гомеостаз кальция и улучшая инотропные свойства сердца [2].

Экспрессия рецепторов галанина повышена в тканях с высокой утилизацией глюкозы, таких как скелетные мышцы, сердце, жировая ткань и клетки панкреатических островков поджелудочной железы [7]. Галанин участвует в регуляции энергетического гомеостаза, восприятия боли, сна, пищевого поведения и функций нейроэндокринной системы и сосудодвигательного центра [8]. Многообразие биологических эффектов галанина указывает на его значительную роль в активации защитных реакций организма. Изначально галанин изучался как нейропротектор, однако недавние исследования показали его кардиопротекторные свойства [9][10].

Галанин, один из ко-трансмиттеров с коротким периодом полувыведения, выделяется из постганглионарных нейронов симпатических волокон вместе с норадреналином и нейропептидом Y [4]. В отличие от классических нейротрансмиттеров, ко-трансмиттеры медленно диффундируют и действуют как нейромодуляторы, их секреция зависит от силы стимуляции нейронов [5]. Галанин участвует в центральной регуляции сердечно-сосудистой деятельности на уровне продолговатого мозга [6] и может напрямую влиять на кардиомиоциты через активацию GalR1-3, которые экспрессируются в миокарде [8]. Галаниновые рецепторы широко представлены в ядре солитарного тракта и нейронах звездчатого ганглия [7]. Внутрицистернальное введение экзогенного галанина в ростральный вентролатеральный отдел ствола головного мозга у крыс приводило к транзиторному повышению среднего артериального давления с последующим резким снижением, а также вызывало выраженную тахикардию [11].

Данные литературы свидетельствуют, что активация галанинергической системы усиливает защитные механизмы кардиомиоцитов на ранних стадиях повреждения миокарда [12-14]. Было показано, что галанинергические каскады влияют на ремоделирование миокарда, включая гипертрофию, фиброз кардиомиоцитов и их гибель [15]. В условиях стресса галанин и его производные улучшают углеводный обмен в кардиомиоцитах, снижают окислительный стресс и гиперпродукцию активных форм кислорода митохондриями [15]. Кроме того, галанинергические каскады препятствуют развитию гипертрофии кардиомицитов, подавляя экспрессию некоторых генов.

Ранее концентрация галанина оценивалась преимущественно у пациентов с различными неврологическими заболеваниями, сахарным диабетом и ожирением [16][17]. На сегодняшний день опубликованы результаты преимущественно экспериментальных работ, посвященных изучению роли галанина на моделях сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) у животных [18], однако в качестве диагностического маркера ССЗ у людей галанин не изучался. В настоящей работе уровень галанина у пациентов с ишемической болезни сердца (ИБС) исследуется впервые.

Целью настоящей работы было сравнить сывороточные уровни галанина у больных ИБС в зависимости от наличия хронической сердечной недостаточности со сниженной фракцией выброса (ФВ) (ХСНнФВ), а также у лиц без ССЗ.

Материал и методы

Настоящее кросс-секционное исследование выполнено на базе ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России. Научный проект проводился в соответствии с Хельсинкской декларацией и последующими поправками к ней и был одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России (протокол № 04-05/18 от 07.06.2018г, протокол № 03-02/19 от 11.04.2019г). Выборка пациентов для участия в исследовании составила 80 пациентов мужского пола, из них 30 больных ИБС с ХСНнФВ, 30 больных ИБС без ХСНнФВ и 20 лиц без ССЗ (контрольная группа).

Критерии включения и невключения. Критериями включения для группы ИБС с наличием ХСНнФВ считались: наличие признаков и симптомов ХСН, выявленных по данным эхокардиографии, ФВ левого желудочка ≤40%; подтвержденный ишемический генез ХСН (чрескожное коронарное вмешательство (ЧКВ)/аортокоронарное шунтирование (АКШ)/перенесенный инфаркт миокарда (ИМ) в анамнезе).

Критериями включения для группы ИБС без ХСНнФВ служили: наличие верифицированного обструктивного поражения коронарных артерий (ЧКВ/АКШ/перенесенный ИМ в анамнезе); отсутствие симптомов и признаков ХСН.

Критерии включения для группы контроля: отсутствие ССЗ и других установленных заболеваний по данным анамнеза и предоставленной медицинской документации. Допускалось наличие у пациентов контролируемой артериальной гипертензии (АГ) I ст. и гиперлипидемии (уровень холестерина (ХС) липопротеинов низкой плотности (ЛНП) >3 ммоль/л, уровень триглицеридов (ТГ) >1,7 ммоль/л) которые рассматривались в качестве факторов риска, а не самостоятельных заболеваний.

Критерии невключения: отказ от подписания информированного согласия/участия в исследовании, индекс массы тела (ИМТ) ≥35 кг/м², скорость клубочковой фильтрации <30 мл/мин/1,73 м² по формуле CKD-EPI, курение или отказ от курения ≤10 лет назад, хроническая обструктивная болезнь легких/бронхиальная астма средней, тяжелой и крайне тяжелой степени в анамнезе, системные заболевания соединительной ткани, онкологические заболевания без радикального излечения, перенесенные острые инфекционные заболевания или обострение хронических в течение 2 нед. до включения в исследование, беременность и период лактации, воспалительные заболевания кишечника, а также прием системных глюкокортикостероидов, иммуносупрессоров в течение последних 3 мес. до включения в исследование. Дополнительными критериями невключения в группу ИБС без ХСНнФВ были значения >5 баллов по шкале HFA-PEFF (Heart Failure Association (P) — Pretest assessment (анализ симптомов, анамнеза, факторов риска), (E) — Echocardiographic (ЭхоКГ и анализ натрийуретических пептидов), (F1) — Functional testing (стресс-ЭхоКГ, инвазивная оценка гемодинамики), (F2) — Final aetiology (лучевые методы диагностики, генетический анализ, анализ биомаркеров), чтобы исключить попадание в данную группу пациентов с ХСН с сохраненной ФВ. Также в исследование не были включены больные ИБС без обструктивного поражения коронарных артерий.

Концентрацию галанина определяли в сыворотке крови, взятой натощак из кубитальной вены в утренние часы. Обработку образцов цельной крови проводили методом центрифугирования при 3000 об./мин при 20° С, полученную сыворотку аликвотировали и хранили при -70-80° С в "Банке биологического материала" ФГБУ "НМИЦ ТМП" Минздрава России. Количественное определение галанина в сыворотке крови проводилось методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (competitive ELISA) с использованием стандартизированной тест-системы ELISA kit for Galanin Human (Cloud-Clone Corp, КНР/США). Для инкубации микропланшет применялся шейкер-термостат PST-60HL (Biosan/ВекторБест, Латвия/РФ) c поддержанием температурного режима 37,0° С согласно инструкции производителя тест-систем. Промывка микропланшет осуществлялась с использованием автоматического промывателя Anthos Washer Fluido (Biochrom, Великобритания). Детекцию оптической плотности (адсорбции) проводили с использованием микропланшетного фотометра Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США) на длине волны 450 нм с референсной длиной волны 620 нм. Построение калибровочных кривых и расчет концентраций проводили с применением программного обеспечения SkanIt RE 7.0.2 (Thermo Fisher Scientific, США).

Статистический анализ проводился в программах Statistica 10 (Statsoft) и SPSS (IBM). Полученные результаты анализировали с применением стандартных алгоритмов вариационной статистики: для количественных показателей определялись медиана (Me) и интерквартильный размах [ Q25;Q75]. Для качественных показателей определялась частота выявления показателя (%). Для сравнения статистической значимости различий между группами использовались непараметрические критерии Манна-Уитни и Краскелла-Уоллиса. Различия групп по качественным показателям оценивались с помощью критерия χ². Образцы были отфильтрованы по этим параметрам для формирования сближенных выборок. Проводилась фильтрация следующих пар выборок: ИБС без ХСНнФВ и контроль, ИБС с ХСНнФВ и контроль, ИБС с наличием и отсутствием ХСНнФВ. Межгрупповые и иные отличия с р<0,05 рассматривались как статистически значимые. Анализ диагностической эффективности и расчет пороговых уровней проводился методом ROC-анализа (Receiver Operating Characteristic Analysis), выбор оптимального порогового уровня осуществлялся путем расчета максимального индекса Юдена (Jmax).

Результаты

В таблице 1 представлены основные клинические характеристики изучаемой выборки. Исследуемые группы были сопоставимы по ИМТ. Me возраста пациентов в группе ИБС с ХСНнФВ была выше по сравнению с лицами без ССЗ р=0,001).

Реваскуляризация коронарных артерий (ЧКВ/АКШ) была выполнена у 80,0% больных ИБС с ХСНнФВ и у 46,67% больных ИБС без ХСНнФВ. В группе ИБС с ХСНнФВ 40,0% участников была проведена имплантация устройства для сердечной ресинхронизирующей терапии с кардиовертером-дефибриллятором (CRT-D). У больных ИБС с наличием и отсутствием ХСНнФВ нарушения ритма в виде фибрилляции/трепетания предсердий имелись у 43,3 и 20,0% участников, соответственно. Эпизоды желудочковой тахикардии/фибрилляции желудочков в анамнезе были зарегистрированы у 23,3% больных ИБС с ХСНнФВ и у 3,3% больных ИБС без ХСНнФВ. У участников группы сравнения в анамнезе не было указаний на перенесенный ИМ, жизнеугрожающие нарушения ритма, а также сахарный диабет 1 и 2 типов, им не проводились реваскуляризация коронарных артерий или катетерная абляция (таблица 1).

Лабораторные показатели пациентов исследуемых групп представлены в таблице 2. Me значений скорости клубочковой фильтрации по CKD-EPI и клиренса креатинина по Кокрофту-Голту были статистически значимо выше у больных ИБС с ХСНнФВ по сравнению с больными ИБС без ХСНнФВ и лицами без ССЗ (р=0,003 и р=0,001, соответственно). Me значений глюкозы, трансаминаз, ХС ЛНП и ХС липопротеинов высокой плотности, ТГ оказались сопоставимы в изучаемых группах.

Результаты сравнительного анализа сывороточных концентраций нейрорегуляторного пептида галанина, полученные с использованием иммуноферментного метода, приведены на рисунке 1. Видно, что Me уровней галанина были статистически значимо выше в группе больных ИБС с ХСНнФВ и в группе ИБС без ХСНнФВ относительно контрольной группы лиц без ССЗ. При этом статистически значимых различий в уровнях данного пептида между группами ИБС с ХСНнФВ и без ХСНнФВ выявлено не было. Наиболее высокое значение галанина, зарегистрированное в настоящем исследовании, достигало 338 пг/мл и было выявлено у пациента группы ИБС с ХСНнФВ, тогда как максимально выявленная концентрация маркера в контрольной группе составляла только 74,1 пг/мл. Для анализа потенциальной диагностической эффективности галанина в качестве маркера ИБС нами был проведен ROC-анализ как в общей группе больных ИБС (с ХСНнФВ + без ХСНнФВ), относительно группы контроля, так и отдельный анализ по каждой из представленных групп, относительно лиц без ССЗ (рисунок 2).

Согласно результатам проведенного ROC-анализа во всех исследуемых группах площадь под кривой (AUC, area under curve) была достаточно высокой (>0,8), что позволяет рассматривать сывороточный галанин как фактор, потенциально связанный с патофизиологическими механизмами в развитии ИБС как с наличием, так и отсутствием ХСНнФВ.

По результатам ROC-анализа были рассчитаны пороговые уровни (cut-off) галанина с учетом максимального коэффициента Юдена (Jmax) по каждой исследуемой группе, относительно группы контроля. Пороговый уровень галанина для общей группы ИБС составил 70,5 пг/мл (Jmax=0,63), при этом диагностическая чувствительность составляла 68,3% при специфичности 95,0%. По группе ИБС с ХСНнФВ рассчитанный пороговый уровень был незначительно >72,1 пг/мл (Jmax=0,58), при котором диагностическая чувствительность составляла 63,3%, диагностическая специфичность 95,0%. В группе ИБС без ХСНнФВ пороговый уровень составил 71,5 пг/мл (Jmax=0,65), при этом диагностическая чувствительность достигала 70,0% и была более высокой чем в группе больных ИБС с ХСНнФВ, при аналогичной диагностической специфичности по контрольной группе (95,0%).

Обсуждение

В настоящей работе впервые показано, что уровень галанина статистически значимо выше у больных ИБС с ХСНнФВ по сравнению с контрольной группой. При этом статистически значимых различий между группами ИБС с наличием и отсутствием ХСНнФВ получено не было.

Представленные результаты расходятся с ранее опубликованными данными Özkaramanlı Gür D, et al. (2017), где концентрация галанина у больных ХСНнФВ была сопоставимой с таковой в контрольной группе. В этой же работе было показано, что концентрация мозгового натрийуретического пептида, копептина и нейропептида Y была существенно выше у больных ХСНнФВ, чем в контрольной группе [19]. При этом концентрация галанина коррелировала с ИМТ, но не со структурными показателями эхокардиографии [20]. Это может быть объяснено тем, что галанин реализует свои эффекты на уровне периферических сердечных симпатических нервов, поэтому его циркулирующие уровни в плазме могут не отражать степень его локального участия в патогенезе сердечной недостаточности. В сравнительно недавно опубликованном исследовании уровень галанина у пациентов с АГ был статистически значимо выше, чем в контрольной группе. При этом концентрация данного пептида постепенно нарастала по мере увеличения степени АГ. Уровень галанина во всех подгруппах пациентов с ожирением был выше, чем в контрольной группе, достигая максимальных значений у пациентов с АГ 3 ст. и ожирением 3 ст. [21]. У пациентов с метаболическим синдромом уровень галанина был существенно выше по сравнению с пациентами контрольной группы [22]. В исследовании была показана положительная корреляция между концентрацией галанина, уровнем глюкозы натощак, гликированного гемоглобина и значением индекса HOMA-IR (Homeostasis model assessment of insulin resistance). В работе Fang P, et al. (2016) была выявлена статистически значимая положительная корреляция между уровнем галанина и уровнем ТГ у пациентов с ожирением [23]. По данным литературы, уровень галанина плазмы крови был выше при ожирении и коррелировал с показателями ИМТ, содержанием висцерального жира, значением индекса HOMA-IR, уровнем общего ХС и ТГ [17]. В настоящей работе исследуемые группы были сопоставимы по ИМТ, однако корреляций между уровнем галанина и ИМТ выявлено не было.

Полученные нами результаты позволяют предполагать важную роль галанинернической системы в качестве одного из звеньев в развитии ИБС, потенциально независимого от сопутствующих заболеваний, таких как ХСНнФВ. С учетом последних тенденций в медицинской биохимии перспективным подходом будет комплексная оценка циркулирующих концентраций галанина, с другими пептидными регуляторами и неинвазивными биомаркерами, отражающими ключевые патогенетические процессы, включая ремоделирование миокарда (матриксные металлопротеиназы), клеточный стресс (белки теплового шока и регулирующие их транскрипционные факторы), а также маркеры, ассоциированные с метаболическими нарушениями.

К ограничениям исследования относятся небольшой объем выборки и одноцентровый дизайн; таким образом, для дальнейшей валидации полученных закономерностей целесообразно проведение более масштабных и многоцентровых исследований.

Заключение

В ходе настоящего исследования был проведен сравнительный анализ сывороточных уровней галанина у больных ИБС в зависимости от наличия ХСНнФВ, а также у лиц без ССЗ. Полученные результаты показали, что уровень галанина значительно выше у больных ИБС независимо от наличия ХСНнФВ по сравнению с лицами без ССЗ, что может служить подтверждением значения галанинергической системы в патофизиологии ИБС.

Отношения и деятельность. Исследование выполнено в рамках госзадания "Ассоциация саркопении с метаболическими нарушениями, хроническим воспалением и изменениями психологического статуса у пациентов с ожирением" (2023-2025гг, регистрационный номер 123020600129-8).