Создание коллекции образцов плазмы для поиска диагностических биомаркеров глиальных опухолей

Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в 2022г в мире выявлено ~20 млн случаев злокачественных новообразований различных локализаций. Опухоли центральной нервной системы (ЦНС) (международная классификация болезней (МКБ) C70-72) насчитывали 321731 (1,6%) случай. В 2022г смертность при опухолях ЦНС составила >77% (ВОЗ)¹. В 2022г в РФ зарегистрировано 624835 случаев первично выявленных злокачественных новообразований, из которых опухоли ЦНС составили 8192 (1,3%). При этом смертность значительно выше среднемировой и достигает 91,7% [1]. Высокая смертность обусловлена не только чрезвычайной агрессивностью опухолей головного мозга (ГМ), но и несовершенством неинвазивной диагностики, представленной в основном магнитно-резонансной томографией. Более того, постановка диагноза зачастую осуществляется на поздних стадиях заболевания, когда возникают клинические проявления [2].

Решением проблемы малоинвазивной диагностики опухолей ГМ может стать поиск циркулирующих маркеров в биологических жидкостях, среди которых наиболее распространены кровь и спинномозговая жидкость [3][4]. С точки зрения точности ликвор является наиболее предпочитаемым источником опухолевых маркеров вследствие непосредственной близости к ГМ и отсутствию гематоэнцефалического барьера. Однако в связи с инвазивным характером люмбальной пункции и высокими рисками для пациента плазма крови представляется вариантом выбора, особенно при мониторинге опухолей ГМ [5]. Основные биомаркеры в плазме крови при внутричерепных опухолях представлены циркулирующими опухолевыми клетками, экзосомами, внеклеточной опухолевой ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислотой), внеклеточной опухолевой РНК (рибонуклеиновой кислотой), и, в частности, микроРНК (малыми некодирующими молекулами рибонуклеиновой кислоты), а также белками [6]. Циркулирующие микроРНК считаются одними из наиболее перспективных молекул для малоинвазивной диагностики опухолей ЦНС [3][7][8]. Малоинвазивный метод на основе выявления циркулирующих микроРНК позволит дополнить диагностику глиальных опухолей, снижая потребность в проведении стереотаксической биопсии, которая может быть причиной тяжелых осложнений и инвалидизации пациента. Предлагаемый подход, вероятно, обеспечит раннюю диагностику опухолей ГМ до появления неврологического дефицита в связи с прогрессированием заболевания [9].

Создание коллекции биологических образцов опухолей является основой для проведения качественных и воспроизводимых исследований [10], а также выявления механизмов, лежащих в основе патогенеза онкологических заболеваний [11]. В настоящее время в РФ функционирует >20 биобанков, где хранится биологический материал пациентов и культуры опухолевых клеток [12]. Первый биобанк опухолей глиального ряда на территории РФ основан в 2016г на базе ФГАУ "НМИЦ нейрохирургии имени академика Н. Н. Бурденко", Минздрава России, г. Москва. В данном биобанке находятся криоконсервированные и паспортизированные образцы ткани и плазмы крови пациентов с верифицированными опухолями ГМ [13]. Работа в этом направлении на базе "НМИЦ онкологии", г. Ростов-на-Дону, начата с 2017г. На сегодняшний день наш депозитарий опухолей ГМ включает >600 паспортизированных образцов крови, плазмы крови и образцов опухолей, хранящихся в низкотемпературных условиях [14].

В связи с актуальностью ранней диагностики опухолей ЦНС Минздрав России одобрил государственное задание "Разработка малоинвазивной диагностической панели опухолей головного мозга на основе циркулирующих микроРНК в плазме крови" (Госзадание № 123030200082-9). Работа выполняется на базе отделения нейроонкологии и лаборатории молекулярной онкологии "НМИЦ онкологии", г. Ростов-на-Дону.

Цель исследования — создание коллекции образцов плазмы крови пациентов с опухолями ГМ для разработки диагностической микроРНК-панели глиальных опухолей.

Материал и методы

Критерии отбора для биобанкирования включали: пациенты >18 лет, морфологически подтвержденный диагноз злокачественной или доброкачественной глиальной опухоли, или метастаз в ГМ (рак легких, рак молочной железы). Пациенты проходили лечение на базе "НМИЦ онкологии" в 2023-2024гг. В исследование также включена контрольная группа условно здоровых доноров без новообразований и патологий ГМ.

Все участники исследования подписали добровольное информированное согласие пациента или члена группы сравнения (письменное согласие на передачу биологического материала и обработку персональных данных оператору, а также на передачу и получение сведений, составляющих врачебную тайну). Проведение исследования было одобрено Локальным Советом по Этике "НМИЦ онкологии" Минздрава России.

Формирование коллекции образцов было начато со сверки соответствия пациента критериям включения/невключения в исследование и подписания информированного согласия. Затем был осуществлен сбор образцов крови натощак в вакуумные пробирки объемом 10 мл с К₂ЭДТА (калиевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты). В течение 30 мин кровь доставляли в лабораторию и подвергали последовательному двойному центрифугированию в режиме: 2000 об./мин 10 мин и 5000 об./мин 10 мин. Полученный объем плазмы разделяли на две криопробирки с присвоенными уникальными лабораторными номерами и немедленно замораживали при -75^о С. Пробы регистрировали в базе данных, представленной в виде таблицы Excell (Microsoft Excel, США), содержащей следующие сведения: лабораторный номер пациента, дата взятия материала, пол, дата рождения, возраст, номер истории болезни, регион проживания, диагноз, TNM (tumor, nodus, metastasis) классификация, стадия развития заболевания, заключение прижизненного патолого-анатомического исследования биопсийного (операционного материала), сопутствующие патологии, проведенная терапия, результаты дополнительных анализов: иммуногистохимии, молекулярно-генетического тестирования на наличие мутаций в генах IDH1/2 (кодирующих изоцитратдегидрогеназы 1 и 2). Все случаи были верифицированы в ходе морфологического исследования операционного или биопсийного материала опухоли. Параллельно образцы регистрировали с использованием программного обеспечения FreezerPro (Azenta Life Science, США).

Выделенные из плазмы крови 59 образцов РНК были исследованы методом NGS-секвенирования (next-generation sequencing, секвенирования следующего поколения/секвенирования нового поколения) с помощью набора QIAseq miRNA Library Kit (Qiagen, Германия) на приборе MiSeq Dx (Illumina, США). Анализ качества полученных ДНК библиотек проводили с помощью онлайн программы RNA-seq Analysis Portal (geneglobe.qiagen.com, Германия).

Результаты

Пациенты с впервые выявленными опухолями на момент забора крови для исследования не получали никакого лечения, а пациентам из группы вторичных опухолей ГМ было проведено оперативное удаление новообразования и/или химиолучевая терапия. У 52 пациентов образцы крови были отобраны как до, так и после лечения. При этом у 9 пациентов потребовалось повторное взятие крови вследствие нарушения времени транспортировки образца в лабораторию или гемолиза эритроцитов, что является критичным для получения достоверных результатов.

В настоящем исследовании для NGS-секвенирования циркулирующих микроРНК нами было отобрано 83 образца плазмы крови. Из данных образцов была выделена тотальная РНК и подготовлены библиотеки комплементарной ДНК. Концентрации 61 библиотеки оказались достаточно высокими и составили, в среднем, 25 нг/мкл. При этом 22 (26,5%) образца имели крайне низкие концентрации (<1 нг/мкл) при минимально требуемой в 4 нг/мкл. Анализ результатов NGS-секвенирования двух образцов с концентрациями по 0,4 нг/мкл продемонстрировал низкое качество полученных библиотек. Количество прочтений для них составило 897 и 1928, соответственно. При этом диапазон показателя для образцов с высокими концентрациями составил от ˃3600 до ˃5500 (таблица 1). Анализ уникальных последовательностей показал, что библиотеки с концентрациями по 0,4 нг/мкл содержат 321 и 254 малых некодирующих РНК, по сравнению с 1500-2700 для библиотек высокого качества (таблица 1).

В коллекцию образцов плазмы пациентов за период 2023-2024гг отобран биоматериал 339 пациентов с доброкачественными и злокачественными опухолями ГМ, а также пациентов с диагнозами рак легких или рак молочной железы с метастазами в ГМ. Контрольную группу составили 10 условно здоровых доноров. Итого было получено 349 образцов плазмы крови (две аликвоты на одного пациента, 698 проб) (таблица 2). Диапазон возраста участников исследования составил от 19 до 91 года, медиана равнялась 56 годам. В выборке пациентов преобладали женщины (соотношение 1,44:1) (таблица 2).

В объединенной группе первичных и вторичных опухолей ГМ злокачественные новообразования (56,4%) превалировали над доброкачественными (28,7%) и метастатическими экстракраниальными опухолями (12%) (таблица 3, рисунок 1 А). В группу со вторичными опухолями ГМ вошли как рецидивирующие опухоли ГМ (92,5%), так и метастатические опухоли рака молочных желез и легких (7,5%) (таблица 3, рисунок 1 Б). Доброкачественные опухоли ГМ были представлены в основном менингиомами (91 пациент, 91%). Количество опухолей других гистологических подтипов незначительно и составило суммарно 9% (таблица 3, рисунок 1 В). Группа новообразований различной степени злокачественности представлена глиобластомами (92 пациента, 46,7%), астроцитомами (82 пациента, 41,6%) и олигодендроглиомами (18 пациентов, 9,1%), объединенными в группу опухолей глиального ряда, а также эпендимомами (5 пациентов, 2,5%) (таблица 3, рисунок 1 Г).

С помощью NGS-секвенировния были проанализированы 59 образцов: 22 образца больных с диагнозом глиобластома, 15 — с астроцитомами, 5 — с олигодендроглиомами, 13 — с менингиомами и 4 образца плазмы крови условно здоровых доноров. В результате биоинформационного анализа NGS-данных выявлено 59 дифференциально экспрессирующиеся микроРНК, специфичных для каждой группы.

Обсуждение

На сегодняшний день единых протоколов для жидкостной биопсии при глиальных опухолях в повседневной практике не существует. Поэтому научное сообщество сходится во мнении, что перед внедрением в клиническую практику циркулирующих маркеров необходима стандартизация методов сбора биоматериала, проведения исследования и анализа результатов [15]. Международный консорциум RANO (Response Assessment in Neuro-Oncology), занимающийся стандартизацией исследовательской практики в области нейроонкологии, рекомендует подвергать цельную кровь первичной обработке в течение 3 ч после забора [16]. В настоящем исследовании продемонстрировано, что ДНК библиотеки низкого качества были получены из образцов плазмы крови с крайне низкими концентрациями (<1 нг/мкл) (рисунок 2 А, Б). Данный факт нами был связан со временем первичной обработки цельной крови. Эмпирически определено, что образцы, взятые в работу не позднее 30 мин после забора крови, служили адекватным материалом для выделения достаточного количества РНК и последующей подготовки ДНК библиотек с требуемыми характеристиками (рисунок 2 А). Из цельной крови, которая в силу логистических трудностей была обработана через ≥40 мин после забора, не удалось получить библиотеки, пригодные для дальнейшего NGS-секвенирования (рисунок 2 Б). Кроме того, для подтверждения гипотезы значимости времени, в течение которого была получена плазма, нами были отсеквенированы два образца с крайне низкими концентрациями. Количество прочтений и анализ уникальных последовательностей показал снижение качества библиотек данных образцов в ~3,5 раза по сравнению с образцами с высокой концентрацией (таблица 1). Таким образом, в ходе подготовки к исследованию профилей опухоль-специфичных микроРНК с помощью NGS-секвенирования нами экспериментально был определен критичный период между забором крови и получением плазмы, который составил 30 мин. В случае превышения данного периода времени получить библиотеки ДНК для дальнейшего секвенирования надлежащего качества и в требуемом количестве не представлялось возможным. Опыт использования нами криоконсервированной плазмы для выбранной платформы профилирования микроРНК выявил узкие места в логистике отбора материала и позволил эмпирически выделить критичный период между отбором крови и её первичной обработкой.

В собранной коллекции образцов плазмы крови ожидаемо преобладали пробы, полученные от пациентов с глиобластомами (27,1%) и менингиомами (26,8%), которые являются наиболее часто диагностируемыми злокачественными и доброкачественными опухолями ЦНС. Следующим по распространенности типом злокачественных новообразований были астроцитомы, которые составили 24,2%. Среди опухолей глиального ряда наименее распространенными оказались олигодендроглиомы (5,3%). Эпендимомы были представлены всего в 1,5% случаев. В группе доброкачественных новообразований гистотипы помимо менингиом были представлены единичными случаями и составили всего 9%. Полученное соотношение распространенности различных типов первичных опухолей ГМ в целом соответствует мировой статистике [17]. Группа вторичных опухолей ГМ включала метастатические опухоли (12,4%) рака молочных желез (3,5%) и рака легкого (8,8%). Вышеупомянутые локализации первичных экстракраниальных опухолей выбраны ввиду высокой частоты метастазов в ГМ: до 40% при раке легких и до 30% при раке молочной железы [18]. При этом соотношение доброкачественных и злокачественных опухолей (первичных и вторичных) составило 1:2,4.

Изменение экспрессии микроРНК при опухолях ГМ было продемонстрировано во множестве как отечественных, так и зарубежных исследований [7-9][19][20]. Интересно, что в разных исследованиях уровень одной и той же микроРНК был как повышенным, так и сниженным. На сегодняшний день для опухолей глиального ряда выявлена только одна микроРНК (miR-21), сверхэкспрессия которой подтверждается во всех работах без исключения [21]. Кроме того, дифференциальная экспрессия некоторых микроРНК может позволить различить первичные и вторичные опухоли ГМ, в частности метастатические опухоли рака молочной железы, легких, меланомы и других. Установлено, что при метастазировании в ГМ в основном изменяется уровень микроРНК, ассоциированных с нарушением проницаемости гематоэнцефалического барьера [22]. В результате проведенного нами NGS-секвенирования образцов плазмы крови (первичные опухоли ГМ, n=55; группа контроля, n=4) было выявлено 59 дифференциально экспрессирующихся микроРНК. При этом во всех группах преобладали микроРНК с повышенной экспрессией, которые являются потенциально онкогенными. Кроме того, были определены специфические микроРНК, характерные для менингиомы (15), олигодендроглиомы (14), астроцитомы (13) и глиобластомы (17) (неопубликованные данные). Согласно полученным нами ранее результатам, обнаруженный спектр микроРНК в плазме крови хоть и обладает меньшим разнообразием, но повторяет профиль экспрессии в опухолевой ткани [23][24]. Данный факт свидетельствует о целесообразности малоинвазивной диагностики опухолей ГМ на основе плазмы крови.

Заключение

Биобанкирование является основой для поиска опухоль-ассоциированных маркеров. На базе ФГБУ "НМИЦ онкологии" Минздрава России функционирует современный депозитарий, в котором создана коллекция из 698 образцов плазмы. При этом коллекция образцов включает весь спектр гистотипов первичных доброкачественных и злокачественных новообразований ГМ, диагностируемых в онкоцентре. В группе доброкачественных опухолей преобладали менингиомы, злокачественных — глиобластомы и астроцитомы. Вторичные опухоли ГМ представлены рецидивирующими глиальными опухолями и метастатическими опухолями рака легких и рака молочной железы. Помимо собранной коллекции образцов нами был усовершенствован протокол первичной подготовки образцов крови, позволивший получить библиотеки ДНК высокого качества для проведения NGS-секвенирования микроРНК. В результате были определены микроРНК, специфичные для различных подтипов опухолей ГМ.

Отношения и деятельность. Работа выполнена в рамках государственного задания Минздрава России (госрегистрация № 123030200082-9).