Циркулирующие микроРНК и развитие коллатерального кровообращения при хронической окклюзии коронарной артерии

Введение

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире [1][2]. Хроническая окклюзия коронарной артерии (ХОКА) представляет собой серьезную клиническую проблему в спектре ИБС [3]. В связи с этим необходимы терапевтические стратегии, способствующие развитию хорошего коронарного коллатерального кровообращения (ККК), функционирующего как естественный обходной путь, поддерживающий снабжение кровью миокарда [4].

ККК формируется выше зоны ХОКА и играет жизненно важную роль в поддержании функционирования сердца, повышая выживаемость пациентов при ИБС и других неблагоприятных сердечных событиях [3][5-7]. ХОКА определяется как отсутствие антеградного кровотока, 0 по классификации TIMI (Thrombolysis In Myocardial Infarction), с предполагаемой продолжительностью не <3 мес. [8]. ХОКА диагностируется у 16-52% пациентов с ИБС [9-12]. В отличие от пациентов с неокклюзионной ИБС, пациенты с ХОКА обычно имеют предшествующий инфаркт миокарда, заболевания периферических артерий и сопутствующие заболевания, такие как сахарный диабет и артериальная гипертония [9]. ХОКА можно рассматривать как финальную стадию обструктивной ИБС, и она ассоциирована с негативным долгосрочным прогнозом [13].

Большое клиническое значение имеет изучение механизмов формирования ККК, а также выявление биомаркеров выраженности ККК [14]. Одним из наиболее важных процессов в развитии ККК является ангиогенез [4], который зависит от многочисленных факторов, включая гипоксию, сахарный диабет, артериальную гипертонию, воспаление, эффекты которых опосредованы в частности выработкой факторов роста, но они не могут полностью объяснить механизм образования ККК [15].

В большинстве исследований для выявления пациентов с недостаточной коллатерализацией применяют инвазивные методы на основе ангиографических данных (классификации по Rentrop [16] и по Werner [17]), а также на основе индекса коллатерального кровотока, рассчитанный с помощью измерения давления (pressure-derived collateral flow index, CFIp) [18-20].

Классификация по Rentrop основана на степени заполнения окклюзированного сосуда, классификация по Werner учитывает размер коллатералей на основе размера диаметра коллатерального соединения (КС) [21]. CFIp — метод, используемый для количественной оценки эффективности ККК в сердце [5] на основании измерения давления в аорте, в коронарной артерии дистальнее окклюзии и центрального венозного давления [3]. Однако с его помощью невозможно оценить ККК в контрольных группах здоровых людей [5].

В связи с тем, что развитие ККК оценивают, главным образом, с помощью инвазивных процедур, таких как коронарография, возможность выявлять циркулирующие биомаркеры, позволяющие различать пациентов с достаточно или недостаточно развитым ККК, имела бы большое клиническое значение [22][23]. Недавние исследования показали, что микроРНК играют важную роль практически во всех аспектах сердечно-сосудистой деятельности [24] и могут стать потенциальными неинвазивными биомаркерами сердечно-сосудистых заболеваний, включая ИБС [5][25][26].

МикроРНК — это короткие некодирующие одноцепочечные РНК (18-25 нуклеотидов), которые, взаимодействуя с матричной РНК (мРНК), участвуют в клеточной регуляции путем изменения уровня экспрессии генов, при этом одна микроРНК способна регулировать сотни мРНК [27]. МикроРНК, в зависимости от степени комплементарности микроРНК и мРНК, могут подавлять генную экспрессию с помощью деградации мРНК или ингибирования трансляции [28]. До одной трети всех мРНК подвергаются регуляции, опосредованной микроРНК [29][30].

Несмотря на то, что недавние исследования продемонстрировали важную роль микроРНК в регуляции ангиогенеза, артериогенеза и ремоделирования сосудов [5][14][23][28][31], данных об ассоциации микроРНК с выраженностью ККК немного.

Цель обзора — рассмотрение результатов основных современных исследований, посвященных изучению ассоциации циркулирующих микроРНК и выраженности ККК при наличии ХОКА у пациентов с ИБС, с последующим функциональным анализом выявленных микроРНК.

Методологические подходы

Поиск литературных источников был проведен по заголовкам, аннотациям и ключевым словам в системах индексирования научных публикаций (Google Scholar, PubMed, eLIBRARY) с использованием следующих запросов: "микроРНК + окклюз", "микроРНК + коллатерал", "microRNA + occlusion", "microRNA + collateral". Глубина поиска составила 10 лет. В обзор были включены только оригинальные исследования. В обзоре представлены обобщенные и систематизированные данные 13 литературных источников, посвященных поиску ассоциаций циркулирующих микроРНК с ККК у пациентов с ИБС и ХОКА.

Кроме того, критериями выбора публикаций были: наличие ИБС и разделение пациентов на группы с достаточно или недостаточно развитым ККК с применением известных классификаций (по Rentrop или Werner) или на основе CFIp. В результате литературного поиска были отобраны 13 источников, посвященных поиску ассоциаций циркулирующих микроРНК с ККК у пациентов с ИБС и ХОКА. В обзоре представлены обобщенные и систематизированные данные этих исследований.

Для микроРНК, показавших ассоциации с ККК в анализируемых исследованиях, был проведен функциональный анализ с помощью базы данных MSigDB¹ [32]. Для полученных мРНК был выполнен анализ обогащения на основании баз данных по генной аннотации Gene ontology (GO)² [33] категории биологические процессы (BP, biological process) и базы данных метаболических путей KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)³ [34].

Результаты

На основании проведенного анализа литературы было найдено 13 исследований, посвященных поиску ассоциаций циркулирующих микроРНК с ККК у пациентов с ХОКА (таблица 1). Все они выполнены на небольших выборках (от 26 до 249 человек). Только одно из исследований было проведено на двух независимых когортах [31]: обучающая когорта для анализа с помощью секвенирования следующего поколения (next generation sequencing, NGS) включала пациентов с ИБС с недостаточно (n=5) и достаточно развитым (n=5) ККК, а валидационная когорта для анализа с помощью количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) в режиме реального времени с обратной транскрипцией состояла из пациентов с ИБС с недостаточно (n=20) и достаточно развитым ККК (n=18) и здоровых лиц (контрольная группа, n=18). К сожалению, информация по сравнению уровней экспрессии между группами с достаточно и недостаточно развитым ККК и контрольной группой представлена только для одной из изучавшихся микроРНК — miR-15b-5p [31].

Разделение пациентов с достаточно или недостаточно развитым ККК в 8 работах [3][14][23][31][35][37][38][40] было выполнено по классификации Rentrop, которая ограничивается оценкой коллатеральных сосудов диаметром >100 мкм [3][18]. В большинстве исследований пациенты с ИБС и ХОКА разделяются на группы по классификации по Rentrop следующим образом: недостаточно развитое ККК (0 и 1) и достаточно развитое ККК (2 и 3).

В двух исследованиях применялась классификация по Werner [7][39]: к группе с недостаточно развитым КС относятся оценки 0 или 1, а к группе достаточно развитым КС — оценка 2 [7][39]. В двух других работах использовался метод CFIp [5][6], где пациенты с ИБС и ХОКА разделяются на группы с высоким (>0,39) и низким (<0,39) CFIp.

В работе Gacoń J, et al. (2015) не проводилось разделение пациентов на группы с достаточно и недостаточно развитым ККК, пациенты с неосложненным острым коронарным синдромом были классифицированы в зависимости от состояния инфаркт-связанной коронарной артерии: открытого и окклюзированного [36]. Это исследование было включено в обзор, т.к. сравнение экспрессии изучаемых микроРНК проводилось в группах ХОКА и ИБС без ХОКА.

В качестве метода количественного определения микроРНК во всех работах использовалась кПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией. Кроме того, в трех исследованиях применялся метод NGS для идентифицирования микроРНК, которые могут участвовать в развитии коллатеральных сосудов [6][7][31]. Во всех работах оценивалась экспрессия небольшого числа микроРНК (от 1 до 10).

В исследованиях, включенных в настоящий обзор, микроРНК для валидации были отобраны на основании анализа тотальной микроРНК с помощью NGS [6][7][31][39] или большого числа микроРНК (n=750) [5] с помощью кПЦР или на основании литературных данных, указывающих на их связь с ангиогенезом [14][23][35][38], механочувствительностью [3], ИБС [40], ишемией [36], ХОКА с недостаточно и достаточно развитым ККК [40].

Суммарно во всех работах статистически значимые ассоциации были выявлены для 30 микроРНК (таблица 2). Только 8 микроРНК (miR-15b, miR-21, miR-92a, miR-126, miR-146a, miR-155, miR-495, miR-503) были включены более чем в одно исследование. Однако ни для одной из 8 микроРНК подтвердить полученные результаты не удалось. В большинстве случаев полученные различия могут быть объяснены небольшими размерами выборок, разными контрольными группами (пациенты с ИБС без ХОКА или здоровые участники), методиками категоризации ККК, выделения и определения уровней микроРНК, а также тем, что не указано, какая именно зрелая микроРНК была использована в исследовании (с какого из двух концов исходной пре-микроРНК была образована изучаемая микроРНК).

Целесообразно отдельно обсудить исследование [3], в котором в качестве изучаемого показателя использовался транскоронарный градиент — разница между экспрессией микроРНК в корне аорты и экспрессией микроРНК в правом предсердии/коронарном синусе. Ассоциация транскоронарных градиентов и развития ККК не может сравниваться с ассоциацией экспрессии микроРНК и развития ККК. Поэтому эта работа не будет рассматриваться далее, при обсуждении сравнения уровней экспрессии.

МикроРНК miR-126 была проанализирована в 5 работах [5][6][31][35][40]. Во всех 5 исследованиях общим было сравнение групп пациентов с достаточно и недостаточно развитым ККК: в двух экспрессия miR-126 была повышена [6][35], в двух — снижена [5][31], в одном значимых ассоциаций не обнаружено [40]. Кроме того, был выявлен значимо повышенный [5] и сниженный [35] уровень экспрессии в группе пациентов с ХОКА по сравнению со здоровыми участниками. Стоит отметить, что в трех исследованиях не была указана конкретная зрелая микроРНК (-3p или -5p) [3][5][35], в двух указана форма hsa-miR-126-5p [6][40], в одном — hsa-miR-126-3p [31].

МикроРНК miR-155 была проанализирована в трех исследованиях [6][38][40], в которых совпадало определение групп сравнения: пациенты с достаточно развитым ККК против таковых с недостаточно развитым ККК. Выявленное направление изменения уровня экспрессии было разным во всех трёх работах: снижение экспрессии [38], повышение [6], отсутствие значимых изменений экспрессии [40]. В исследовании [38] нет указания точной формы микроРНК, тогда как в двух других указано, что анализировалась hsa-miR-155-5p [6][40].

Для микроРНК miR-92a получены значимые различия в уровне экспрессии между группами пациентов с достаточно и недостаточно развитым ККК только в одном [3] из двух исследований [3][31].

Для 4 микроРНК (miR-15b-5p [31][40], miR-21 [3][40], miR-146a-5p [23][40], miR-503 [14, 40]) данные об уровне экспрессии для групп пациентов с достаточно и недостаточно развитым ККК получены как минимум в двух исследованиях, одно из которых [40]. Для каждой микроРНК в исследовании [40] подтверждения ранее обнаруженных ассоциаций не получено.

Для микроРНК hsa-miR-495-3p значимые различия в уровне экспрессии были получены в двух исследованиях [7][39], уровень экспрессии был снижен в группе хорошего КС по сравнению с плохим, а также в группе ХОКА по сравнению с ИБС без ХОКА. Однако в этих исследованиях в точности совпадает размер выборки и подгрупп пациентов. Это вызывает сомнения в независимости исследованных выборок.

Функциональный анализ с помощью базы данных MSigDB [32] был выполнен для всех 30 микроРНК, показавших ассоциации с ККК в анализируемых исследованиях. Из 30 микроРНК, включенных в анализ, для 26 микроРНК (let-7d, miR-10a, miR-10b, miR-15b, miR-19a, miR-21, miR-23a, miR-23b, miR-26a, miR-30b, miR-30d, miR-34a, miR-124, miR-126, miR-130a, miR-133a, miR-133b, miR-134, miR-146a, miR-155, miR-329, miR-339, miR-423, miR-494, miR-495, miR-503) было выявлено 3886 мРНК, которые потенциально являются мишенью для хотя бы одной из исследуемых микроРНК. Для полученных 3886 мРНК был выполнен анализ обогащения на основании баз данных GO [33] и KEGG [34]. В результате с помощью GO (BP) было выявлено обогащение 1787 GO BP категорий, среди которых есть те, которые относятся к биологическим процессам, которые могут быть вовлечены в развитие ККК, такие как: регуляция клеточного роста (GO:0001558, regulation of cell growth), развитие артерий (GO:0060840, artery development), позитивная регуляция ангиогенеза (GO:0045766, positive regulation of angiogenesis). Аналогично по результатам анализа метаболических путей KEGG было выявлено обогащение 145 путей, среди которых можно выделить те, которые ассоциированы с сердечно-сосудистыми процессами, например, атеросклероз (hsa05417, lipid and atherosclerosis), сигнальный путь факторов роста эндотелия сосудов (hsa04370, VEGF signaling pathway). Таким образом, эти микроРНК могут быть вовлечены в регуляцию экспрессии генов, продукты которых, вероятно, участвуют в развитии сердечно-сосудистых патологий.

Поскольку количество таргетов микроРНК оказалось слишком большим, чтобы ожидать конкретного функционального результата, был реализован анализ обогащения для набора таргетов микроРНК, которые поддержаны как минимум двумя микроРНК (n=2126). В результате было выявлено обогащение 1230 GO BP категорий и 102 метаболических пути по данным базы KEGG. При сокращении общего количества таргетов ≥2 раза количество обогащенных категорий сократилось незначительно. Как и исходный анализ, анализ усеченного списка таргетных мРНК показал обогащение довольно общих и крупных категорий, что может свидетельствовать о дисперсии функций таргетов для исследуемого набора мРНК. Это, в свою очередь, позволяет предположить, что все исследуемые в обзоре микроРНК принимают участие в регуляции большого количества разнообразных и важных процессов для жизнедеятельности клетки и организма в целом. Ограничением проведенного биоинформатического анализа является отсутствие экспериментального подтверждения для получения более точных утверждений.

Основным недостатком исследований по ассоциации уровней экспрессии микроРНК с ККК является то, что они проведены на небольших выборках (до 249 участников) и только одна на двух независимых когортах [31]. Кроме того, отсутствует стандартизация в выборе контрольной группы, например, в части работ это здоровые люди [5][14][23][31][35][38], тогда как в других — это пациенты с ИБС без значимого стеноза или ИБС без ХОКА [39][40]. В 5 исследованиях присутствовали только пациенты с ИБС с достаточно и недостаточно развитым ККК [3][6][7][36][37]. В исследованиях применяются разные методы оценки ККК: классификация ККК по Rentrop [3][14][23][31][35][37][38], классификация по Werner [7][39] и CFIp [5][6].

При работе с образцами плазмы или сыворотки многие факторы на всех этапах процесса могут повлиять на результат анализа, поэтому для сравнения результатов важно свести к минимуму различия на преаналитическом (сбор, обработка и хранение плазмы), аналитическом (экстракция, синтез комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и кПЦР) этапах и этапе статистической обработки данных (нормализация) [27][41][42].

В рассмотренных в настоящем обзоре исследованиях для получения циркулирующих микроРНК использовались разные типы образцов. Чаще всего биоматериалом служила плазма крови [7][14][23][31][35][38-40], реже — сыворотка [36][37], цитратная плазма [5], моноциты [6] и образцы крови из корня аорты и правого предсердия или коронарного синуса, позволяющие измерить транскоронарные градиенты [3]. Ранее было продемонстрировано, что уровень экспрессии микроРНК в разных типах образцов не сопоставим даже у одного и того же человека [43][44]; это затрудняет сравнение результатов исследований, проводимых с использованием разных биоматериалов [27].

На уровень экспрессии микроРНК могут влиять и другие факторы [45]. Например, приахарном диабете нарушается формирование сети коллатеральных коронарных артерий [46] и снижается экспрессия нескольких микроРНК, включая miR-126 [47]. Было показано, что на экспрессию микроРНК влияет лекарственная терапия такими препаратами, как аспирин и статины [6][48]. В одном из исследований группы пациентов с достаточно и недостаточно развитым ККК различались по доле лиц, принимающих статины [6].

К различным результатам детекции может приводить использование разных протоколов выделения микроРНК [27][41][42]. В одном из исследований были использованы разные наборы для выделения в группе пациентов с ХОКА и в контрольной группе [5]. Поскольку микроРНК становятся потенциальными циркулирующими биомаркерами для диагностики или прогнозирования широкого спектра заболеваний, количественная оценка микроРНК требует тщательного преаналитического анализа, а контроль качества образцов становится решающим [43].

При использовании методов количественного определения микроРНК требуется нормализация для учета и корректировки различий между образцами, в то же время различные методы нормализации могут привести к противоречивым результатам [27][49]. Для нормализации можно использовать повсеместно экспрессируемую эндогенную микроРНК, например, малую ядерную РНК (мяРНК, snRNA) U6 [50][51], а также экзогенные микроРНК "spike-in" (такие как, Caenorhabditis elegans — cel-miR-39, cel-miR-54, cel-miR-238). В большинстве исследований по ККК используются разные РНК: мяРНК U6 [7][23][31][37][39], малая ядрышковая РНК (мякРНК, snoRNA) SNORD61 [3], miR-39 Caenorhabditis elegans (cel-miR-39) [14], miR-238 Caenorhabditis elegans (cel-miR-238-3p) [31], miR-16 [36][40], miR-223 [5]. В работе Hakimzadeh N, et al. (2017) нормализацию проводили с использованием стабильно экспрессируемых эндогенных контролей для каждого фенотипа моноцитов/макрофагов, и в связи с этим отсутствовал один общий эндогенный контроль, подходящий для всех фенотипов клеток [6].

При статистическом анализе в области количественной генетики необходимо введение поправки на множественные сравнения [52]. Отсутствие поправки приводит к завышению уровня значимости и выявлению большого числа ложных ассоциаций. Из 13 рассматриваемых работ поправка на множественные сравнения была упомянута всего в трех [7][31][40]. Таким образом, обсуждаемые ранее различия в найденных ассоциациях, описанных в различных работах, могут объясняться тем, что большинство этих ассоциаций — ложные обнаружения по причине неудовлетворительного статистического анализа.

Хотя исследования продемонстрировали наличие ассоциации уровня экспрессии микроРНК с ККК у пациентов с ХОКА, стандартизированных данных для принятия решения об использовании микроРНК в клинической практике все еще недостаточно. Основные причины: использование небольших выборок, отсутствие стандартизации в выборе контрольной группы, источника циркулирующих микроРНК, протокола выделения и метода нормализации при оценке уровня экспрессии микроРНК, а также отсутствие поправки на множественные сравнения.

Заключение

Возможность определения степени выраженности ККК у пациентов без проведения инвазивной катетеризации имеет потенциальное клиническое значение. Однако, несмотря на ряд исследований, посвященных поиску ассоциаций экспрессии микроРНК с развитием ККК у пациентов с ХОКА, необходимо дополнительное изучение прогностической силы микроРНК, ассоциированных с развитием ККК. Большинство изученных микроРНК были включены лишь в одно исследование, поэтому требуются более крупные многоцентровые исследования, проведенные на различных когортах пациентов с применением стандартизированных процедур обработки образцов, выделения и анализа микроРНК. Эти данные позволят принять решение о возможности применения микроРНК в качестве биомаркеров ИБС и развития ККК.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.