Стратегии создания биоресурсных коллекций в акушерстве: опыт Биобанка "Генофонд"

Введение

Беременность является уникальным состоянием женщины, когда за ограниченный, короткий период времени происходит большое число выраженных изменений на всех уровнях биологической организации организма. Происходят значимые процессы, которые должны обеспечить адаптацию материнского организма к возросшим физическим и метаболическим потребностям во время беременности. В норме сердечно-сосудистая, дыхательная, гематологическая, мочевыделительная, желудочно-кишечная, эндокринная и другие системы претерпевают важные изменения, необходимые для развития плода и для того, чтобы мать и плод могли пережить роды [1].

Исследования последних десятилетий в области акушерства крайне редко затрагивают физиологию беременности, и в основном сосредоточены на осложненном ее течении. В то же время, критически важно изучение закономерностей прогрессирования беременности и развития плода на современном этапе, с учетом последних достижений биомедицинской науки, т.к. бóльшая часть представлений об условно "нормальной" беременности основывается на данных, полученных в прошлом столетии. В настоящее время научные исследования в акушерстве формулируются по "классическому" типу, и включают исследуемую группу — беременные с осложненным течением и контрольную группу, которая формируется из пациенток не с физиологическим течением беременности, а с отсутствием изучаемого состояния (осложнения) в конкретный отрезок времени (на момент включения в исследование) [2]. Ценность получаемых данных и необходимость внедрения других методологий при изучении вопросов акушерства требует отдельного обсуждения, но главное, что имеющиеся на сегодняшний день подходы не дают новых представлений о физиологии беременности.

Объективные ограничения исследований, направленных на изучение физиологии беременности, в первую очередь связаны с невозможностью за короткий период времени включить большое число беременных с физиологическим течением, т.к. частота различных гестационных осложнений достаточно высока. Таким образом, для изменения научно-исследовательских подходов в акушерстве крайне важным является создание биоресурсных коллекций образцов здоровых беременных, нереализовавших гестационные осложнения на протяжении всего срока беременности и в послеродовом периоде [3].

Другие сложности, с которыми сталкиваются исследователи, — это динамичность изменений при беременности за короткий ограниченный срок, что обуславливает невозможность единовременной (разовой) оценки состояния организма беременной, а определяет необходимость внедрения новой стратегии создания биоресурсных коллекций — "лонгитюдного" (динамического) биобанкирования образцов: неоднократного сбора биообразцов у одного испытуемого в течение ограниченного исследователем времени с определением контрольных точек [4]. Такой подход является крайне важным не только для понимания физиологии беременности, но и для изучения патогенетических механизмов реализации осложнений беременности и поиска их ранних предикторов.

Как известно, беременность является специфическим состоянием, при котором патологические события могут варьироваться от легких до жизнеугрожающих, что требует применения действенных прогностических, диагностических и терапевтических вмешательств. В то же время, ввиду неизученности, большое число методов прогнозирования и идентификации гестационных осложнений являются недостаточно точными или применяются с поздних сроков гестации, что значимо снижает эффективность превентивных мер [5-7]. Большинство имеющихся предикторов являются малоэффективными, в связи с тем, что относятся к какому-либо одному звену патогенеза и не учитывают другой "сценарий" развития патологических событий. Новые возможности в отношении целостной оценки предрасполагающих факторов, открывают исследования на основе биоколлекций, созданных по принципу "лонгитюдного" биобанкирования. Наиболее значимым преимуществом формирования такого типа коллекций является возможность изучения на их платформе предикторов осложнений, предшествующих клиническим проявлениям, что крайне важно для своевременного принятия мер профилактики.

В настоящей статье представлен опыт Биобанка "Генофонд" ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д. О. Отта" по созданию биоресурных коллекций, сформированных по принципу "лонгитюдного" биобанкирования, представляющих наибольший научный и практический интерес.

Особенности сбора биологических образцов

Для создания различных типов коллекций были сформулированы две принципиально различающиеся стратегии биобанкирования образцов: "единовременное" и "лонгитюдное" банкирование. Были даны определения для данных подходов, а также выделены по 2 подтипа каждого из подходов для уточнения деталей формата сбора биологических образцов:

— Единовременное банкирование — однократный сбор биообразцов, который может включать в себя Ретроспективное (когортное) банкирование — сбор биообразцов у когорты пациенток с установленным диагнозом и Проспективное банкирование — сбор биообразцов у группы пациенток до реализации исходов (осложнений/заболеваний);

— Лонгитюдное банкирование — сбор биообразцов в течение ограниченного исследователем времени (в течение беременности), которое может включать в себя Динамическое банкирование — сбор биообразцов на протяжении определенного исследователем ограниченного событием времени с определением контрольных точек (к примеру, сбор образцов у одной беременной в 1, 2, 3 триместре) и Контрольное банкирование — сбор биообразцов в контрольных точках до и после события, с определенным исследователем промежутком времени между точками (к примеру, сбор образцов до и после лечения).

Каждый из подходов формирования биоресурсных коллекций не лишен своих преимуществ и недостатков и должен применяться в зависимости от исследовательских целей, ресурсов и возможностей исследователей, когорты пациентов, образцы которых будут включены в биоколлекцию. К основным преимуществам "единовременного" биобанкирования можно отнести: возможность формирования больших биоколлекций образцов, быстрое наполнение коллекций, меньшая потеря ресурсов и данных, ассоциированных с образцами. К основным недостаткам данного подхода можно отнести: невозможность изучения динамических изменений, невозможность оценки биомаркеров на более ранних этапах. Относительно стратегии "лонгитюдного" банкирования, основным и главным преимуществом подхода является возможность поиска предикторов, предшествующих клиническим проявлениям заболевания, что принципиально важно для раннего принятия мер профилактики, а также для возможности изучения закономерностей физиологических и патологических изменений при беременности. К недостаткам такого типа банкирования можно отнести: длительность формирования коллекции, необходимость поддержки длительного контакта с исследуемым, большие затраты и потери ресурсов. В статье представлен опыт биобанка "Генофонд" в формировании биоресурсной коллекции образцов беременных женщин по наиболее сложному принципу: "лонгитюдному" банкированию.

Формирование биоколлекции по принципу "лонгитюдного" банкирования

По состоянию на сегодняшний день биоколлекция образцов беременных, созданная по принципу "лонгитюдного" (динамического) биобанкирования включает образцы различного типа биоматериала от 360 беременных. Данное количество образцов в коллекции было сохранено после "выбраковки", которая осуществлена вследствие важного аспекта менеджмента качества биобанкирования образцов — инвентаризации [8].

Для создания коллекции от беременных женщин сбор биоматериала осуществляется в каждом триметре гестации в сроки проводимого скрининга на хромосомные патологии и врожденные пороки развития плода: I — триместр (11-14 нед.), II — триместр (19-21 нед.), III — триместр (30-34 нед.). После подписания информированного добровольного согласия собираются следующие типы биоматериала:

• Материнская периферическая кровь (вакуумные пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) (фиолетовая крышка) 9 мл — 2 шт.; вакуумные пробирки с активатором свертывания крови и разделительным гелем (желтая крышка) 9 мл — 1 шт.);
• Моча (пластиковые контейнеры не <40 мл).

Все процедуры сбора материнской крови проводятся согласно стандартным операционным процедурам (СОПам) обученным медицинским персоналом в процедурном кабинете, моча собирается беременными самостоятельно, после проведения инструктажа исследователями. Сбор клинической информации осуществляется медицинским персоналом. Данные о течении и исходе беременности заносятся в специально разработанные для исследования карты участников. Вся информация о пациентках деперсонализируется и кодируется уникальными номерами. После получения биоматериала первичные контейнеры транспортируются в лабораторию в термоконтейнере с хладоэлементами при температуре от +4 до +8^о C.

После пробоподготовки в условиях лаборатории, для дальнейшего хранения в биоколлекции, согласно разработанным СОПам, выделяются следующие типы образцов крови и ее компонентов:

— цельная кровь (4 аликвоты по 0,9 мл; 2 аликвоты по 4,5 мл со стабилизатором крови для рибонуклеиновой кислоты — РНК);

— сыворотка крови (6 аликвот по 0,7 мл);

— плазма крови (4 аликвоты по 0,9 мл);

— лейкоцитарная пленка.

В настоящее время коллекция содержит 15349 единиц хранения. Хранение происходит, согласно СОПам, в криопробирках с индивидуальным штрих-кодированием в криохранилищах биобанка "Генофонд": низкотемпературные морозильники Thermo Fisher Scientific™ серии TSX Ultra-Low (-80^о C), система хранения в парах жидкого азота Biosafe (-180^о C).

Для использования образцов коллекции в дальнейших исследованиях был проведен контроль качества хранимых образцов, который осуществляли путем оценки качества производных образцов (дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и библиотек микрорибонуклеиновой кислоты (микроРНК) для секвенирования). Качество выделенных образцов ДНК оценивали путем измерения концентрации и соотношения длин волн A260/A280. Концентрацию всех образцов определяли на флуориметре "Qubit 2.0" (Invitrogen). Соотношения длин волн определяли на спектрофотометре "Nanodrop 2000C" (Thermo Scientific). Контроль качества библиотек микроРНК проводили с использованием автоматического капиллярного гель-электрофореза на приборе "2200 TapeStation Instrument" (Agilent Technologies).

Исследования на основе биоколлекции, созданной по принципу "лонгитюдного" банкирования

Динамические изменения биомаркеров при физиологической беременности. Для проведения данного пилотного исследования из биоресурсной коллекции были извлечены образцы плазмы и сыворотки крови 7 беременных женщин, полученных в ходе динамического сбора образцов в 3-х триместрах гестации. По данным медицинских карт об исходе беременности, после произошедших родов, у данных женщин в течение беременности и в послеродовом периоде не было диагностировано каких-либо гестационных осложнений.

Для оценки профиля микроРНК в парных образцах плазмы и сыворотки крови беременных были выделены 42 библиотеки малых РНК — по 21 для каждого типа биообразца. Высокопроизводительное секвенирование показало, что при динамической оценке в 3-м триместре процент считываний микроРНК в плазме и сыворотке снизился на треть по сравнению с 1-м и 2-м триместрами. Были обнаружены 2 микроРНК в плазме (hsa-miR-7853-5p и hsa-miR-200c-3p) и 10 микроРНК в сыворотке крови (hsa-miR-203a-5p, hsa-miR-495-3p, hsa-miR-4435), hsa-miR-340-5p, hsa-miR-4417, hsa-miR-1266-5p, hsa-miR-4494, hsa-miR-134-3p, hsa-miR-5008-5p и hsa-miR-6756-5p), которые продемонстрировали изменение уровня во время беременности (скорректированное значение p<0,05). Кроме того, были выявлены различия в 36 микроРНК между плазмой и сывороткой (скорректированное значение p<0,05), которые следует принимать во внимание при сравнении результатов исследований, проведенных с использованием разных типов биообразцов. Результаты были подтверждены анализом трех микроРНК с помощью ОТ-ПЦР (полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией) (p<0,05) [9].

Результаты данного исследования продемонстрировали, что профиль циркулирующей микроРНК в крови в норме подвержен динамическому изменению во время беременности. Полученные данные закладывают основу для дальнейшего изучения молекулярных механизмов, участвующих в регуляции беременности, и поиска биомаркеров нарушений течения беременности.

Динамические изменения биомаркеров при патологии беременности. Для проведения данного пилотного исследования из биоресурсной коллекции были извлечены образцы плазмы крови, полученные в 1-м и 2-м триместрах гестации у 13 беременных, которые в дальнейшем были выделены в группу высокого риска преждевременных родов, в связи с тем, что реализовали такое осложнение беременности, как истмико-цервикальная недостаточность (Международная классификация болезней, МКБ О34.3) — патологическое состояние перешейка и шейки матки во время беременности, при котором они не способны противостоять внутриматочному давлению и удерживать увеличивающийся плод в полости матки до своевременных родов. Для контроля были отобраны образцы плазмы крови, полученные в 1-м и 2-м триместрах у 11 беременных с физиологическим течением гестации.

С применением технологии высокопроизводительного секвенирования в 1-м триместре беременности в сравниваемых группах были обнаружены различия в уровнях 15 микроРНК (3 с повышенным уровнем экспрессии — hsa-miR-122-5p, hsa-miR-34a-5p, hsa-miR-34c-5p; 12 с пониженным уровнем экспрессии — hsa-miR- 487b-3p, hsa-miR-493-3p, hsa-miR-432-5p, hsa-miR-323b-3p, hsa-miR-369-3p, hsa-miR-134-5p, hsa-miR-431-5p, hsa-miR-485-5p, hsa-miR-382-5p, hsa-miR-369-5p, hsa-miR-485-3p, hsa-miR-127-3p) (log2(FC) ≥1,5; FDR ≤0,05). Было отмечено, что все микроРНК с пониженной регуляцией в 1-м триместре из плаценто-специфического кластера C14MC. Во 2-м триместре дифференциально экспрессируемых микроРНК обнаружено не было [10].

Результаты настоящего исследования продемонстрировали, что микроРНК могут рассматриваться в качестве потенциальных ранних предикторов осложнений беременности, выявление которых важно для их своевременной профилактики. Отсутствие различий во 2-м триместре беременности, с одной стороны может связано с естественными причинами (увеличение срока беременности, активное становление и функционирование плаценты), с другой стороны, — с началом терапевтических мероприятий при появлении начальных признаков истмико-цервикальной недостаточности.

Заключение

Результаты приведенных пилотных исследований открывают широкие научные перспективы в области акушерства, в первую очередь ввиду принципиально нового методологического подхода к проведению исследований. Планирование такого дизайна исследований возможно только на платформе биоресурсных коллекций образцов беременных женщин, созданных по принципу "лонгитюдного" (динамического) биобанкирования. Создание коллекций с применением новой стратегии открывает исследователям возможность изучения не только закономерностей физиологических изменений при беременности, но и поиска ранних предикторов гестационных осложнений, предшествующих их клиническим проявлениям.