Ассоциации уровней циркулирующих miR-145-5p, -181b-5p и -195-5p с кальцинозом коронарных артерий

Введение

Кальциноз коронарных артерий (ККА) представляет собой патологическое отложение кальция в стенках коронарных сосудов и является важным маркером атеросклероза и сердечно-сосудистого риска [1]. Его наличие коррелирует с повышенной вероятностью острых коронарных синдромов, инфарктов миокарда и смерти, даже при отсутствии явных симптомов [2]. Традиционные методы диагностики, такие как компьютерная томография с определением коронарного кальциевого индекса (КИ) в единицах Агатсона (AU), позволяют визуализировать и количественно оценить степень кальциноза, однако они описывают только результат активности множества процессов, лежащих в основе атерогенеза. Поиск чувствительных и специфических биомаркеров, отражающих активность патогенетических путей, остаётся актуальной задачей для ранней диагностики и персонализированного лечения.

МикроРНК (miR) — малые некодирующие молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК), регулирующие экспрессию генов на посттранскрипционном уровне — всё чаще рассматриваются как ключевые участники патофизиологических процессов в сердечно-сосудистой системе. Циркулирующие микроРНК, стабильно присутствующие в крови и других биологических жидкостях, демонстрируют высокий потенциал как неинвазивные биомаркеры. Их профиль может отражать динамику воспаления, окислительного стресса, апоптоза и ремоделирования сосудистой стенки, процессов, тесно связанных с развитием коронарного кальциноза [3]. Однако роль конкретных микроРНК в патогенезе ККА и их диагностическая ценность до сих пор изучены недостаточно полно.

Настоящее исследование направлено на анализ профиля циркулирующих микроРНК у пациентов с различной степенью выраженности ККА с целью выявления потенциальных молекулярных мишеней и разработки новых подходов к прогнозированию и терапии. Полученные данные могут способствовать пониманию механизмов, лежащих в основе сосудистого кальциевого ремоделирования, а также созданию персонализированных стратегий снижения сердечно-сосудистого риска у пациентов.

Цель исследования — изучение ассоциаций уровней циркулирующих miR-145-5p, -181b-5p и -195-5p с ККА.

Материал и методы

Были проанализированы данные, собранные нами ранее в зарегистрированной базе данных (патент № RU 2024622531)¹ База данных представляет собой dbf — файл (dBSAE IV) и содержит 62 уникальных профиля циркулирующих микроРНК (hsa-miR-16-5p, -195-5p, -205-5p, -126-3p, -126-5p, -21-5p, -143-3p, -223-3p, -145-5p, -29b-3p, -146a-5p, -92a-3p, -150-5p, -23a-3p, -181b-5p, -451a), сведения о степени выраженности атеросклероза, определённого с помощью компьютерной томографии (КТ), расчётные значения рисков сердечно-сосудистых осложнений, определённых согласно популяционным инструментам оценки (шкалам) SCORE2 (Systematic Coronary Risk Evaluation2), ACC/AHA (American College of Cardiology/American Heart Association), Framingham (ATP-III — Adult Treatment Panel III), MESA (The Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis), стандартные клинико-демографические и лабораторные данные пациентов.

Исследование проводилось на базе Клинического центра ФГАОУ ВО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова" Минздрава России (Сеченовский Университет).

Количество пациентов исследуемой популяции составило 62 человека.

КТ коронарных артерий осуществлялась при помощи 640-срезового компьютерного томографа Aquilion ONE (Canon, Япония). Количественный анализ уровня ККА по шкале Агатсона проводился с использованием программного пакета Vitrea (Canon Medical Informatics, Inc., Миннетонка, Миннесота, США). Одномоментно с подготовкой к проведению КТ проводили взятие венозной крови в пробирки с ЭДТА-К₂ (двукалиевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты) объёмом до 10-15 мл. На начальном этапе подготовки биоматериала проводили серию из трёх центрифугирований с отбором двух третей плазмы крови. После этого образцы плазмы переносили в пробирки типа эппендорф и замораживались при -20 °С. В дальнейшем происходила транспортировка в специализированную лабораторию для выделения бестромбоцитарного супернатанта в объёме до 300 мкл. Анализ уровней циркулирующих микроРНК проводился с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией с использованием наборов TaqMan AdvancedmiRNA и TaqMan Fast AdvancedMasterMix (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) в соответствии с протоколом производителя на аппарате QuantStudio 5 Real-Time PCR system (Thermo Fisher Scientific, США) с нормализацией по уровню эндогенной miR-16-5p. Методология сбора и анализа данных более подробно описана нами в предыдущей публикации [4].

На основании результатов наших прошлых исследований [4][5] в качестве кандидатов на более детальное изучение ассоциаций с ККА были отобраны miR-195-5p, -145-5p и -181b-5p. Для удобства анализа пациенты были разделены на подгруппы по значениям ККА с КИ =0 AU (n=20); КИ =1-10 AU (n=3), КИ =11-99 AU (n=22), КИ =100-299 (N=8) и КИ ≥300 AU (n=9). Краткие клинические и демографические характеристики исследуемой выборки отражены в таблице 1. У двух пациентов с КИ =0 были начальные признаки атеросклероза коронарных артерий, они были отнесены в группу с атеросклерозом.

Данная работа соответствует принципам Хельсинкской декларации. Одобрена локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), протокол № 12-23, от 06.07.2023.

Статистический анализ. Сравнение выборок было реализовано методами непараметрической статистики, дисперсионного анализа, для сравнения независимых переменных использовались критерии χ², критерий равенства дисперсий Ливиня, t-критерий Стьюдента с оценкой их значимости р. Анализ связи уровней циркулирующих микроРНК со значениями ККА рассчитывались методом множественной линейной регрессии с учетом ковариат: возраст, пол, курение, индекс массы тела (ИМТ), уровень холестерина, не входящего в состав липопротеинов высокой плотности (ХС неЛВП). Нормальность остатков оценивалась с помощью теста Шапиро-Уилка, гомоскедастичность — с помощью теста Бройша-Пагана, автокорреляция — с помощью теста Дарбина-Уотсона. Для оценки связи с дихотомическими показателями (наличие/отсутствие ККА, включая КИ ≥10 AU и КИ ≥100 AU) проводилась логистическая регрессия с последующим ROC-анализом и сравнением площади под кривой (AUC — area under curve) при помощи теста ДеЛонга. Статистически значимыми считались результаты при р<0,05. Для оценки диагностической эффективности использовался ROC-анализ со определением AUC. В качестве проверяемой переменной использовались значения уровней циркулирующей микроРНК, в качестве переменой состояния — групповая принадлежность пациента. Качество модели с AUC =0,6-0,7 считалось средним, с AUC =0,7-0,8 — хорошим, с AUC >0,8 — очень хорошим. Статистическая обработка данных производилась в программном обеспечении IBM SPSS Statistics версии 27, MedCalc Statistical версии 23.4.4.

Результаты

На первом этапе исследования была выполнена множественная линейная регрессия, где в качестве независимых переменных рассматривались относительные уровни циркулирующих miR-195, -145, 181b, а также стандартные ковариаты: возраст, пол, курение, ИМТ, уровень ХС-неЛВП. Диагностически значимый уровень был отмечен для miR-145 (p=0,005) при общей значимости модели F=2,077 (p<0,05).

Однако анализ качества модели выявил существенные недостатки. Так, за счет сильно коррелирующих предикторов (ИМТ и возраст) отмечалось высокое значение мультиколлинеарности (взаимозависимости объясняющих переменных), а также отсутствовало нормальное распределение значений КИ. Кроме того, модель описывала низкую долю дисперсии за счёт большого числа пациентов с КИ =0 (32,3%).

С учётом выявленных критически значимых факторов была построена новая модель множественной логистической регрессии только для пациентов с КИ >0 без учёта возраста и ИМТ в качестве ковариат, а также с логистическим преобразованием значений КИ для нормализации распределения. Такая модель показала более высокую значимость F=2,95 (p=0,11). При этом мультиколлинеарность отсутствовала, нормальность остатков была соблюдена, гомоскедастичность не нарушена, а автокорреляция отсутствовала.

Значимым предиктором наличия ККА (p=0,005) также остался уровень miR-145-5p (рисунок 1).

На втором этапе исследования было принято решение о проведении логистической регрессии для miR-145, а также комбинированных маркеров на основе miR-195 + miR181b и всех трёх исследуемых микроРНК для выявления ККА в принципе (КИ >0 AU), ККА без учёта минимальных изменений (КИ >10 AU) и значимого ККА (КИ >99 AU). Для этого значения относительных уровней микроРНК были стандартизированы через z-оценку. Для комбинированного маркера из трёх микроРНК значения z-оценки miR-145 были инвертированы, поскольку её снижение было ассоциировано с повышением значений КИ.

Результаты оценки диагностической эффективности описанных моделей для выявления ККА представлены на рисунке 2 и в таблице 2. Все исследуемые варианты моделей показали очень хорошие значения AUC за исключением модели без учета микроРНК, где AUC составила 0,78. При сравнении AUC всех вариантов ROC-кривых значимых различий получено не было. Обращает на себя внимание то, что использование оценки только уровня miR-145-5p без учета ковариат позволяет с очень высокой специфичностью выявлять факт наличия атеросклероза, однако чувствительность составляет ~62%. Наиболее эффективной в отношении чувствительности и специфичности была модель с учетом уровней miR-181b-5p и -195-5p и клинико-демографических данных.

Результаты оценки диагностической эффективности описанных моделей для выявления ККА без учёта минимальных повышений (КИ ≥10 AU) представлены на рисунке 3 и в таблице 3. Наилучшие результаты продемонстрировала модель с учётом всех исследуемых микроРНК и клинико-демографических данных, при этом очень хорошие значения AUC имели модели miR-145-5p + ковариаты, а также miR-181b-5p, -195-5p + ковариаты, однако, они обладали невысокой чувствительностью. Наименее эффективной была модель, учитывающая только уровни miR-145-5p. При сравнении AUC всех вариантов ROC-кривых использование только оценки miR-145-5p было значимо слабее по сравнению с моделями, учитывающими miR-145-5p и клинико-демографические факторы (p=0,037) и все три микроРНК с указанными ковариатами (p=0,047).

Результаты оценки диагностической эффективности описанных моделей для выявления значимого ККА (КИ ≥100 AU) представлены на рисунке 4 и в таблице 4. Модель miR-145-5p + ковариаты показала максимальные значения AUC, а также чувствительности и специфичности. Остальные модели за исключением модели с оценкой только уровней miR-181b-5p и -195-5p также демонстрировали высокую диагностическую эффективность. Стоит отметить, что при сравнении AUC всех вариантов ROC-кривых использование оценки только комбинации miR-181b-5p и -195-5p было значимо слабее по сравнению с моделями, учитывающими комбинацию miR-181b-5p и -195-5p и клинико-демографические факторы (p=0,003), miR-145-5p с ковариатами (p=0,001) и все три микроРНК с ковариатами (p=0,001) и даже по сравнению с моделью, не учитывающей уровни микроРНК (p=0,002). Таким образом, добавление уровней исследуемых циркулирующих микроРНК к клинико-демографическим показателям позволило улучшить чувствительность всего на 5% и специфичность всего на 7%.

Обсуждение

Недавние исследования циркулирующих микроРНК выявили их значительный потенциал в качестве биомаркеров и терапевтических мишеней при сердечно-сосудистых заболеваниях, в частности при атеросклерозе и процессах кальцификации сосудов. Ряд данных указывает на критическую роль miR-195-5p в патогенезе атеросклероза и механизмах кальцификации сосудов [5-7]. Отмечается, что уровень экспрессии miR-195-5p повышен у пациентов с атеросклерозом по сравнению со здоровыми людьми, что позволяет предположить его участие в прогрессировании заболевания посредством множества молекулярных путей, включая дисфункцию эндотелия, клеточную пролиферацию и регуляцию апоптоза, что согласуется с полученными нами результатами.

В недавно проведенных клинических исследованиях была установлена четкая связь между уровнем в крови miR-195-5p и прогрессированием атеросклеротического заболевания. Так, исследование Tang H, et al. показало, что экспрессия miR-195-5p значительно повышена в сыворотке крови пациентов с атеросклерозом сонных артерий по сравнению со здоровыми добровольцами [8]. Авторы указывают на потенциальную возможность использования miR-195-5p в качестве биомаркера для выявления и мониторинга атеросклеротических заболеваний. Настоящее исследование позволяет уточнить потенциальную предиктивную способность miR-195-5p в отношении атеросклероза, поскольку демонстрирует не просто положительную корреляцию с наличием атеросклероза коронарных артерий, причем, что важно, с большей чувствительностью и специфичностью в отношении начальных сосудистых изменений, но и отрицательную корреляцию с нулевым значением КИ. Корреляция между уровнями в сыворотке крови и паттернами клеточной экспрессии позволяет предположить, что уровень miR-195-5p может отражать наличие текущей сосудистой патологии и служить неинвазивным индикатором тяжести заболевания.

Патофизиологическая роль miR-195-5p в развитии атеросклероза связана со сложными взаимодействиями с биологией эндотелиальных клеток, в частности с эндотелиальными клетками аорты человека [8]. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что экспрессия miR-195-5p значительно увеличивается в ответ на воздействие окисленных липопротеинов низкой плотности, повышенный уровень холестерина в которых считается ключевым атерогенным фактором [9][10].

Помимо стимуляции эндотелиальной дисфункции, роль miR-195-5p описана и в процессе кальцификации аортального клапана, который имеет патофизиологическое сходство с кальцификацией коронарных артерий [11]. Авторы указывают, что miR-195-5p является ключевой регуляторной молекулой в прогрессировании кальцификации благодаря взаимодействию с осью RMST/miR-195-5p/SMAD7. В этом процессе длинная некодирующая РНК RMST действует в качестве молекулярной губки, связывая и изолируя miR-195-5p, тем самым снижая ее доступность для подавления мишени SMAD7 — важного регулятора сигнального пути трансформирующего фактора роста бета и костного морфогенного белка. Это способствует остеогенной дифференцировке и отложению кальция в аортальном клапане.

Другим возможным путём воздействия miR-195-5p на клеточном уровне является индукция апоптоза путём снижения экспрессии гена никотинамид-адениндинуклеотид (НАД)-зависимой деацетилазы сиртуина-1 (SIRT1), обладающего протективной функцией [12]. Терапевтическое значение этого пути весьма существенно, поскольку исследования ингибиторов SIRT1 показали, что защитное действие подавления эффектов miR-195-5p может быть обратимым при блокировании активности SIRT1.

В процессах апоптоза и аутофагии гладкомышечных клеток сосудов в качестве одного из важнейших регуляторов отмечалась и роль miR-145-5p. Так, в исследовании Zhang X, et al. было показано, что данная микроРНК воздействует на кальций/кальмодулин-зависимую протеинкиназу II дельта (CaMKIIδ), ключевой медиатор аутофагии в гладкомышечных клетках аорты человека и компонент, ассоциированный со стабильностью атеросклеротической бляшки [13]. Снижение уровня miR-145-5p в плазме пациентов с атеросклерозом и в тканях артерий коррелировало с повышением экспрессии CaMKIIδ, что впоследствии активировало сигнальный путь AMPK/mTOR/ULK1, как механизм регуляции аутофагии. Этот сдвиг в пути передачи сигнала способствовал образованию аутофагосом, в то время как оверэкспрессия miR-145-5p в эндотелиоцитах нивелировала эти эффекты, восстанавливая экспрессию маркеров сократимости (α-SMA, SM22α) и снижая накопление липидов. В нашем исследовании более высокие уровни данной микроРНК ассоциировались с нулевым уровнем коронарного кальция, что позволяет рассматривать снижение уровня miR-145-5p как один из патологических факторов атерогенеза.

Хотя прямые доказательства связи miR-181b-5p с ККА остаются ограниченными, функциональные исследования выявляют регуляторную роль указанной микроРНК в сосудистом воспалении. МикроРНК семейства miR-181, включая miR-181a-5p и miR-181b-5p, модулируют передачу сигналов ядерного фактора каппа B (NF-κB) через различные мишени. В эндотелиальных клетках пупочной вены человека оверэкспрессия miR-181b-5p снижает экспрессию молекул межклеточной адгезии 1-го типа (ICAM-1) и молекул адгезии сосудистого эндотелия 1-го типа (VCAM-1) на 40-60% при стимуляции фактора некроза опухоли-α (TNF-α), ослабляя адгезию моноцитов [14].

Анализ децидуализированных стромальных клеток эндометрия выявил способность miR-181b-5p подавлять экспрессию аннексина A2 и тканевого ингибитора металлопротеиназы-3 (TIMP-3), которые являются важнейшими медиаторами клеточной миграции и ремоделирования матрикса. Хотя это исследование было посвящено репродуктивной биологии, оказалось, что выявленные мишени играют важную роль в патофизиологии сосудов. Аннексин A2 способствует миграции сосудистых гладкомышечных клеток посредством активации плазминогена, в то время как TIMP-3 ингибирует матриксные металлопротеиназы, участвующие в разрыве бляшки [15]. Эти результаты указывают на то, что miR-181b-5p может влиять на ремоделирование атеросклеротических бляшек.

В нашем предыдущем исследовании уровень miR-181b-5p был выше у пациентов со стабильными атеросклеротическими бляшками. Однако, значения чувствительности и специфичности данной микроРНК в выявлении стабильных атеросклеротических бляшек по данным ROC анализа были посредственными. Кроме того, уровни данной микроРНК были выше у пациентов с КИ >100 AU [4]. Таким образом, хотя miR-181b-5p демонстрирует потенциал как регулятор стабильности атеросклеротических бляшек, её ограниченная диагностическая точность указывает на необходимость изучения этой микроРНК в составе мультипараметрических панелей или в сочетании с визуализационными маркерами для повышения прогностической ценности.

Ограничения исследования. Основным ограничением исследования является малый размер выборки. Исходя из небольшого размера выборки не представлялось возможным более детальное ранжирование пациентов по группам с различными уровнями, ККА особенно в группах с КИ ≥100, 300 и 1000 AU. В исследование не входили пациенты с сахарным диабетом 2 типа, который существенно повышает риск развития атеросклероза. Кроме того, исследование носит ретроспективный характер, что не позволяет оценить влияние уровней циркулирующих микроРНК на исходы у пациентов с атеросклерозом.

Заключение

Проведённое исследование подтвердило значимую ассоциацию уровней циркулирующих микроРНК — в частности miR-145-5p, miR-181b-5p и miR-195-5p — с наличием и степенью выраженности ККА. Наиболее убедительные данные получены для miR-145-5p, уровень которой был достоверно ниже у пациентов с выявленным коронарным кальцинозом и демонстрировал высокую эффективность выявления ККА как в качестве независимого биомаркера, так и в комбинации с клинико-демографическими факторами.

Комбинированные модели, включающие несколько микроРНК и ковариаты (пол, курение, уровень ХС-неЛВП), продемонстрировали высокую диагностическую эффективность (AUC >0,8) для выявления как начальных, так и значимых форм кальциноза (КИ ≥10 AU и КИ ≥100 AU, соответственно). Особенно высокую чувствительность и специфичность показала модель на основе всех трёх микроРНК в сочетании с клиническими параметрами при диагностике ККА без учёта минимальных изменений (КИ ≥10 AU). В то же время при оценке значимого кальциноза (КИ ≥100 AU) наилучшие результаты продемонстрировала модель с miR-145-5p и клинико-демографическими показателями.

Полученные данные согласуются с современными представлениями о роли указанных микроРНК в патогенезе атеросклероза и сосудистой кальцификации, подтверждая их участие в регуляции воспаления, апоптоза, эндотелиальной дисфункции и ремоделирования сосудистой стенки. Таким образом, профилирование циркулирующих микроРНК представляет собой перспективный неинвазивный подход к ранней диагностике, стратификации риска и, в перспективе, персонализированному управлению пациентами с атеросклеротическим поражением коронарных артерий

Отношения и деятельность. Работа выполнена при финансовой поддержке программы "Приоритет 2030", проект "Технологии регенеративной кардиологии". Шифр: 01.000.Б.133.