Получение клеточных культур из семенников крысы для исследований и разработки биологических лекарственных препаратов для восстановления сперматогенеза

Введение

В России и мире мужское бесплодие в половине случаев является причиной бесплодия пар, которое по разным оценкам достигает 10-20%. В некоторых случаях мужское бесплодие диагностируется как идиопатическое, и для него не существует эффективной терапии. Зачастую мужское бесплодие связано с повреждением сперматогониальных стволовых клеток (ССК) и их специфического микроокружения — ниши, которая обеспечивает гомеостаз стволовых клеток [1]. Ранее на животных моделях было показано, что мезенхимные стромальные/стволовые клетки (МСК) за счёт секреции комплекса биологически активных молекул — секретома, способны стимулировать восстановление ниши ССК и, как следствие, сперматогенез и фертильность самцов [2-4].

Согласно Решению Совета ЕЭК от 03.11.2016 № 89, основные продукты регенеративной медицины — тканевой и клеточной терапии, а также "бесклеточной терапии", одним из инструментов которой является секретом МСК, относятся к биологическим лекарственным препаратам, поскольку выделяются из биологических источников — тканей человека¹. Изучение механизмов действия биологических препаратов in vivo и in vitro является необходимым этапом для их трансляции в клиническую практику. Кроме того, для биологических препаратов критическим является разработка методов оценки специфической активности in vitro, которая должна отражать или имитировать механизм действия препарата в организме¹. Для этих целей методы должны быть воспроизводимы, чувствительны и специфичны, поэтому рациональным является использование охарактеризованных клеточных линий.

В мире существуют международные банки клеточных коллекций для тестирования биологических препаратов. Например, ATCC (American Type Culture Collection) и ECACC (European Collection of Authenticated Cell Cultures) включают >3000 клеточных линий, используемых для тестирования биологических препаратов для лечения иммунных и онкологических заболеваний, включая возможность оценки цитотоксичности, пролиферативной и рецепторной активности. В частности, в ATCC есть клеточные линии клеток семенника TM3 (мышиные клетки Лейдига) и TM4 (мышиные клетки Сертоли), эти клетки выделены из неполовозрелых самцов возрастом 11-13 дней². В клеточных банках Германии (DSMZ) и Японии (JCRB) есть опухолевые линии клеток, выделенных из семенника человека (например, SUSA и GCT-27) и грызунов (например, LC540 — клетки Лейдига мыши)^3 4. Опухолевые тестикулярные линии клеток мыши (F9) встречаются в клеточном банке РФ Института цитологии РАН⁵. Однако использование неполовозрелых или опухолевых клеток может являться нерелевантным для изучения процессов, происходящих во взрослом организме ввиду существенных фенотипических и функциональных различий клеток [5]. Таким образом, для изучения сперматогенеза и разработки препаратов для восстановления сперматогенеза, в т.ч. секретома МСК, необходимо создание коллекций клеток семенников из половозрелых животных. Согласно ГОСТ Р ИСО 20387-2021 используемые клеточные культуры должны быть хорошо охарактеризованы по фенотипическим и функциональным признакам⁶.

В то же время, специфические маркеры и секреторная активность, предлагаемые как уникальные для определённой популяции клеток in vitro, могут со временем и в зависимости от условий культивирования меняться. С учетом возможных изменений фенотипа и функции клеток в культуре, ключевым является определение допустимого временнóго диапазона их использования в методах оценки специфической активности in vitro и, соответственно, разработки оптимальной стратегии биобанкирования клеточных культур.

Цель работы — создание охарактеризованных по фенотипам и функциональной активности коллекций клеток семенников крыс для определения оптимальных условий их использования в моделях оценки специфической активности лекарственных препаратов, направленных на восстановление сперматогенеза. Для достижения этой цели мы проанализировали фенотип клеток семенников, а также секреторную активность некоторых из них в процессе культивирования.

Материал и методы

Выделение фракций клеток из семенников грызунов. Семенник состоит из семенных канальцев, которые содержат ССК, клетки Сертоли, перитубулярные миоидные клетки, и интерстициального пространства между ними с клетками Лейдига, стромальными клетками, включая МСК, и иммунными клетками [6]. Оптимизированный нами протокол выделения клеток подразумевает этапы последовательной ферментативной обработки семенника, начиная с внешнего интерстициального слоя, как описано в статьях других авторов [7-9].

Животные. В работе использовали самцов крыс породы Wistar в возрасте 100-120 дней. Животных содержали в стандартных условиях в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях.

Выделение клеток Лейдига и МСК семенника. После эвтаназии у животных забирали семенники и помещали в раствор Хэнкса с 5% смесью антибиотиков (пенициллин-стрептомицин). В чашке Петри снимали белочную оболочку и отделяли крупные сосуды, затем промывали оставшиеся семенные канальцы раствором Хэнкса с 5% антибиотиком 2-3 раза. Затем канальцы переносили в стерильную пробирку, добавляли среду Игла, модифицированную Дульбекко (ДМЕМ), содержащую 2,5 мг/мл трипсина и ДНКазу (дезоксирибонуклеазу) 10 мкг/мл и инкубировали при температуре 34-35 ^оC в течение 4-10 мин, периодически помешивая до тех пор, пока канальцы не станут рыхлыми. Для ингибирования ферментов добавляли среду ДМЕМ с 10% фетальной бычьей сывороткой (ФБС), аккуратно перемешивали переворачиванием пробирки. Далее оставляли пробирку в вертикальном положении для осаждения канальцев. После оседания канальцев жидкость над канальцами, содержащую интерстициальные клетки, отбирали в новую пробирку. Повторяли пункт отмывки 5 раз. Полученную суспензию интерстициальных клеток центрифугировали 300 g в течение 10 мин и фильтровали через 100 мкм фильтр. Затем суспензию разделяли на градиенте Перколла с плотностью 60, 34, 26 и 21%. Наслаивали 2 мл суспензии клеток на верхний слой градиента. Центрифугировали при 800 g при 4 ^оC в течение 20 мин, а затем при 100 g при 4 ^оC в течение 10 мин, используя медленное ускорение и замедление. Отбирали в отдельную пробирку слой между 21 и 26% градиентами Перколла, содержащий, в основном, стромальные клетки. Добавляли 20 мл раствора Хэнкса, пипетировали и центрифугировали при 300 g в течение 10 мин для удаления частиц Перколла. Данный этап промывки повторяли дважды. Конечный осадок ресуспендировали в ДМЕМ-Ф12 с добавлением 10% ФБС и 1× антибиотик пенициллин-стрептомицин.

В отдельную пробирку собирали слой между 30 и 60% градиентами Перколла, который, в основном, содержал клетки Лейдига. Добавляли 20 мл раствора Хэнкса, пипетировали и центрифугировали при 300 g в течение 10 мин для удаления частиц Перколла. Последний этап повторяли дважды. Полученный осадок ресуспендировали в среде ДМЕМ-Ф12 с добавлением 2% ФБС. 1× инсулина-трансферрина-селена и 1× антибиотиком пенициллин-стрептомицин.

Выделение перитубулярных клеток. После отделения интерстициальных клеток в ходе выполнения предыдущего пункта протокола к осадку канальцев добавляли ферментативный раствор: коллагеназа I типа до концентрации 1 мг/мл, гиалуронидаза до концентрации 1 мг/мл и ДНКаза 10 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и инкубировали при температуре 34-35 ^оC в течение 10-20 мин, периодически помешивая до тех пор, пока канальцы не станут короче, а края канальцев шероховатыми. Затем ингибировали воздействие ферментов раствором ДМЕМ + 10% ФБС и аккуратно перемешивали. После оседания канальцев в отдельную пробирку отбирали жидкость над канальцами. Повторяли пункты отмывки 5 раз. Полученную суспензию, содержащую преимущественно перитубулярные клетки, центрифугировали при 300 g в течение 10 мин. Полученный осадок ресуспендировали в ДМЕМ-Ф12 с добавлением 10% ФБС и пропускали суспензию 10 раз через иглу размером не <18 G.

Выделение клеток Сертоли и ССК. Канальцы после отмывок после окончания выполнения выделения клеток Лейдинга перемещали в среду ДМЕМ, содержащую гиалуронидазу до концентрации 1 мг/мл и ДНКазу 10 мкг/мл, и инкубировали при температуре 34-35 ^оC в течение 5-10 мин, а затем останавливали ферментативную реакцию добавлением ДМЕМ с 10% ФБС и центрифугировали при 300 g в течение 10 мин. Полученный осадок ресуспендировали в среде ДМЕМ/F12 и пропускали суспензию 10 раз через иглу диаметром не <18 G. Затем суспензию фильтровали через фильтр размером 70 мкм, на фильтре предположительно оставалась фракция клеток Сертоли. Культуру клеток Сертоли крысы собирали в среду ДМЕМ/F12, содержащей 2% ФБС и 1× антибиотик пенициллин-стрептомицин.

Через фильтр проходила суспензия ССК, которую собирали в среду ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы 4,5 г/л (Gibco), содержащей 1% ФБС, и высаживали на культуральный пластик, покрытый желатином.

Все типы клеток семенника культивировали в специальных условиях с учетом особенностей температурного режима для семенников — 5% CO₂; 35 ^оC.

Иммуноцитохимический анализ. Исследуемые клетки после выделения высаживали в лунки 96-луночного планшета в состоянии 60-70% конфлюента. Через 48 ч культивирования отбирали питательную среду и промывали культуру раствором ФСБ. Фиксировали клеточную культуру 3,7% раствором забуференного параформальдегида на ФСБ. Для пермеабилизации в случае исследования внутриклеточных белков использовали 0,2% раствор Triton X-100. Блокирование неспецифического связывания вторых антител проводили в течение 1 ч, применяя нормальную 10%-ую сыворотку животного-донора вторых антител (Abcam), приготовленную на 1% растворе бычьего сывороточного альбумина. Для детекции исследуемых мишеней применяли соответствующие антитела:

— маркеры клеток Лейдига: цитохром P450 11А1 (CYP11A1, Bioss, bs-3608R-Biotin), рецептор лютеинизирующего гормона (LHR, Bioss, bs-6431R),

— маркеры МСК: CD73 (abcam, ab175396), CD90 (PA5-80127, Invitrogen),

— маркер стромальных клеток: рецептор тромбоцитарного фактора роста бета (PDGFRb, abcam, ab32570),

— маркеры клеток Сертоли: ингибин бета (inhibin beta B, Bioss, bs-1825R), SRY-related HMG-box 9 (Sox9, abcam, ab185230),

— маркер перитубулярных миоидных клеток: α-гладкомышечный актин (αSMA, Biolegend, 904601),

— маркеры ССК: рецептор глиального нейротрофического фактора (GDNFR, Bioss. bs-0201r), c-kit (bs-0672R), щелочная фосфатаза (ЩФ) (SK-5400),

— иммунотипические контроли: IgG rabbit isotype control (Bioss, bs-0295P-Biotin и Biolegend, 910801), IgG1 mouse (BioLegend, 401402).

Детекцию антител проводили при использовании вторых антител, конъюгированных с флуоресцентной меткой, в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте: антитела козла против кролика (Invitrogen, A11034), козла против мыши (Invitrogen, A11001, A11032), streptavidin-Alexa488. Ядра докрашивали раствором DAPI (Sigma). Микроскопическое исследование проводили на микроскопе Leica DMi8, снабженного камерой Leica DFC 7000 T (Leica Microsystems GmbH), используя репрезентативные поля зрения для получения фотографий.

Окрашивание ССК ЩФ. Фракцию, обогащённую ССК, высаживали в 96-луночный планшет. В качестве среды культивирования использовался ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы 4,5 г/л (Gibco), содержащей 1% ФБС. Для оценки пролиферативной активности ССК клетки на 4 день после смены среды были фиксированы 10% формалином и окрашены хромогеном — субстратом ЩФ, т.к. известно, что недифференцированные стволовые клетки отличаются повышенным содержанием ЩФ на их клеточной мембране. Микроскопическое исследование проводили на микроскопе Leica DMi8, снабженного камерой Leica DFC 7000 T (Leica Microsystems GmbH), используя репрезентативные поля зрения для получения фотографий.

Окрашивание клеток Лейдига липофильным красителем Oil Red. Клетки Лейдига предварительно высаживали в лунки 96-луночного планшета. Через 48 ч культивирования питательную среду удаляли и культуру промывали раствором ФСБ. Фиксировали клеточную культуру 3,7% раствором забуференного параформальдегида на PΒS. После этого к клеткам добавляли изопропанол, промывали и добавляли готовый раствор Oil Red (МиниМед) до появления окраски. Микроскопическое исследование проводили на микроскопе Leica DMi8, снабженного камерой Leica DFC 7000 T (Leica Microsystems GmbH), используя репрезентативные поля зрения для получения фотографий.

Криоконсервация клеток Лейдига. Свежевыделенные клетки Лейдига криоконсервировали в криопробирках стандартной концентрации 1 млн в 1 мл в среде для заморозки 10% ДМСО (диметилсульфоксид) в ФБС.

Оценка секреторной активности клеток Лейдига и модель специфической активности in vitro. Клетки Лейдига после выделения (день 0) рассаживали в лунки 48-луночного планшета в среде роста ДМЕМ/Ф12 (Gibco), 1× ITS (ПанЭко) и 2% ФБС (Cytiva). На следующий день после выделения (день 1) все лунки промывали 3 раза раствором Хэнкса по 0,5 мл и проводили смену среды. В лунках группы "контроль 2 дня" клетки ставили на кондиционирование — добавляли среду ДМЕМ с низким содержанием глюкозы 1 г/л без фенолового красного (Gibco). На 2 день собирали среду с лунок группы "контроля 2 дня", центрифугировали при 300 g в течение 10 мин для осаждения клеточного дебриса. Затем собирали супернатант и закладывали на хранение при температуре -80 ^оС. Некоторые лунки ставили на кондиционирование (объём образца в одной лунке 0,35 мл), для этого добавляли среду ДМЕМ с низким содержанием глюкозы "контроль 4 дня" или секретома МСК. На 4 день собирали среду с лунок каждой группы, центрифугировали при 300 g в течение 10 мин для осаждения клеточного дебриса.

Аналогичным образом в данном эксперименте на 2 день оставшиеся лунки ставили на кондиционирование и на 7 день собирали среду с последующим центрифугированием для осаждения клеточного дебриса. Затем собирали супернатанты и закладывали на хранение при температуре -80 ^оC. В полученных образцах после размораживания определяли количество тестостерона методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Валидация аналитической методики. Аналитическая методика определения тестостерона методом ИФА была валидирована в соответствии с требованиями Решения Коллегии ЕЭК от 17.07.2018 № 113. Для этого измерение тестостерона в среде клеток Лейдига с помощью ИФА набора (DBC, Канада) тестировали по критериям: специфичность, линейность, правильность, внутрилабораторная прецизионность⁷.

Получение секретома МСК человека. СК от разных доноров были получены из биобанка Центра регенеративной медицины МНОИ МГУ им. М. В. Ломоносова, который пополняется согласно разрешению институционального локального этического комитета (Этический комитет МНОИ МГУ им. М. В. Ломоносова, IRB00010587) (протокол № 4, дата заседания 04.06.2018), с получением добровольного информированного согласия у всех доноров. Клетки культивировали в среде, поддерживающей рост недифференцированных мезенхимных прогениторных клеток Advance Stem Cell Basal Medium (HyClone) с добавлением 10% Advance Stem Cell Growth Supplement (HyClone) и 100 ед./мл пенициллина/стрептомицина (Gibco). Для получения секретома МСК жировой ткани человека 5 пассажа, достигшие 80% конфлюентности, промывали 3-кратно раствором Хэнкса. Затем в чашки добавляли среду ДМЕМ с низким содержанием глюкозы. Клетки культивировали в течение 7 дней, после чего кондиционированную среду, содержащую компоненты секретома МСК, собирали, очищали от клеточного дебриса путём центрифугирования при температуре 4 ^оС в течение 10 мин при 300 g, а затем 2000 g в течение 30 мин. Для концентрирования секретома МСК использовали фильтры-концентраторы с размером пор, предназначенным для отсечения молекул размером <10 кДа "JetSpin" (Jet Bio-Filtration). Секретом МСК помещали в фильтры и откручивали его на фильтрах на скорости 3000 g до уменьшения объема концентрата в необходимое число раз по сравнению с начальным для дальнейшего использования.

Статистический анализ. Экспериментальные данные представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q25; Q75). T критерий Стьюдента, U-критерий Манна-Уитни и многопараметрический анализ с использованием критерия Краскела-Уоллиса с применением критерия Данна для учета множественных групп сравнения был выполнен с использованием программного обеспечения Prism GraphPad (GraphPad Software, США), различия результатов считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Характеристика клеточных фракций из семенника по специфическим маркерам

Выделенные фракции клеток из семенников крыс были охарактеризованы по экспрессии специфических маркеров [10-13]. Клетки Лейдига окрашиваются на маркеры Cyp11A1, LHR (рисунок 1 А). Одной из основных функций клеток Лейдига является секреция тестостерона. Цикл синтеза тестостерона начинается в цитоплазме, предшественником является холестерин, который является липофильным веществом и запасается в жировых каплях [14]. Наличие множества небольших жировых капель, окрашиваемых липофильным красителем Oil Red, является специфическим признаком клеток Лейдига. МСК окрашиваются на специфические маркеры CD73, CD90 и PDGFRb, которые являются маркерами стромальных клеток (рисунок 1 Б). Клетки Сертоли имеют маркеры inhibin beta B и Sox9 (рисунок 1 Г), перитубулярные миоидные клетки — aSMA (рисунок 1 В), а ССК окрашиваются на GDNFR, c-kit и ЩФ (рисунок 1 Д).

У некоторых животных наблюдали вариабельность в соотношении маркеров одной клеточной культуры. Так, интересно отметить, что на подавляющем большинстве клеток выделенной популяции клеток Лейдига экспрессия специфичного маркера LHR была явно выражена. Однако в этой же клеточной культуре наблюдали только небольшой процент клеток, экспрессирующих специфичный маркер CYP11A1 — фермент, участвующий в катаболизме холестерина и последующем синтезе тестостерона.

Клетки Лейдига могут приобретать неспецифические маркеры при культивировании in vitro

Ранее in vivo было показано, что при введении секретома МСК животным под белочную оболочку яичка биораспределение происходит преимущественно в интерстиции, бóльшую часть которого занимают клетки Лейдига [4]. В связи с этим в дальнейших экспериментах проводили более подробное изучение фенотипа и функциональной активности клеток Лейдига как возможной первичной мишени для лекарственных препаратов с таким путём введения.

Было показано, что некоторые из проанализированных маркеров могут иметь нехарактерную экспрессию. Так, Sox9 считается уникальным маркером клеток Сертоли в яичках [15]. Действительно, при выделении в культуру на нулевом пассаже только популяция, обогащенная клетками Сертоли, экспрессирует данный маркер в ядре. Однако уже на первом пассаже клетки с ядрами, положительными по Sox9, детектируются и в культуре клеток Лейдига. Представленность таких клеток увеличивается при долговременном культивировании (рисунок 2).

Винкулин и виментин также являются типичными маркерами, используемыми для характеристики клеток Сертоли in vivo [16]. Однако по нашим данным винкулин экспрессируется в культуре клеток Лейдига in vitro уже в первые дни культивирования. Кроме того, мы показали появление экспрессии виментина в клетках Лейдига in vitro к 2 пассажу (рисунок 3).

Выявленный феномен кросс-специфичности следует учитывать при характеристике и стандартизации культур, выделенных из тканей семенника. Также можно сделать вывод о том, что использование клеток Лейдига без пассирования может быть более релевантным с точки зрения сохранения максимально сходными с in vivo фенотипом и функциональной активностью.

Уменьшение секреторной активности клеток Лейдига при культивировании in vitro

Помимо фенотипического профиля при культивировании изменяется способность клеток Лейдига к секреции тестостерона. Было показано, что на 4 день культивирования уровень секретируемого клетками Лейдига тестостерона в среде значимо снижается. На 7 день культивирования концентрация тестостерона снижается критически, достигая уровня ниже детектируемого методом ИФА (рисунки 4 А, 4 В). Такое резкое снижение продукции тестостерона может быть связано с потерей специфического микроокружения, которое регулирует выработку тестостерона за счёт паракринных и контактных межклеточных взаимодействий. Ранее было показано, что добавление секретома МСК может восстанавливать уровень секреции тестостерона, сопоставимый с первоначальным уровнем на 2 день культивирования. На основании этого была разработана модель специфической активности для оценки лекарственных средств, направленных на восстановление сперматогенеза [4].

Оптимизация и валидация модели для оценки специфической активности терапевтических агентов для восстановления сперматогенеза

Для рутинного контроля качества лекарственных препаратов выделение свежих клеток Лейдига из семенников крыс является нецелесообразным и сложным процессом. Кроме того, теряется большое количество ценного биологического материала. По нашим данным, из семенников одной крысы выделяется несколько десятков млн клеток Лейдига, при этом для одного анализа специфической активности используется, в среднем, несколько млн клеток. В связи с этим мы протестировали возможность использования для анализа замороженных сразу после выделения клеток Лейдига. При размораживании аликвот клеток Лейдига их жизнеспособность составляет ~70%. При этом сохраняются их морфология, уровень секреции тестостерона, а также способность отвечать на регенераторные стимулы (рисунки 4 Б, 4 Г).

Полученные результаты дают возможность использования клеток Лейдига, выделенных из семенников одного животного, для проведения десятка тестов по изучению специфической активности лекарственных препаратов in vitro. Это приводит к уменьшению количества используемых животных и вариабельности результатов между тестами.

При выполнении валидации аналитической методики определения тестостерона методом ИФА установлено, что коэффициент регрессии составляет 0,998 (критерий приемлемости не >0,995), как показано на графике (рисунок 5). Значение коэффициентов вариации результатов представлены в таблице 1 и составляют в полученных двух выборках (n=6) 2,63 и 3,98% при допустимом критерии не >5%. Различия между дисперсиями средних результатов двух выборок определения содержания тестостерона статистически незначимы при расчете F-критерия Фишера.

Таким образом, аналитическая методика определения тестостерона методом ИФА валидирована по критериям: специфичность, линейность, правильность, внутрилабораторная прецизионность, что позволяет использовать её в фармацевтической практике для изучения и контроля качества лекарственных препаратов, направленных на восстановление сперматогенеза.

Обсуждение

Использованные нами подходы позволили последовательно выделить культуры клеток из тканей семенников крыс: клетки Лейдига, резидентные МСК, перитубулярные миоидные клетки, клетки Сертоли и ССК. Для создания клеточных коллекций необходима подробная фенотипическая и функциональная характеристика полученных культур, которая была проведена сразу после выделения культуры клеток. При выделении из органа или ткани клетки теряют специфические сигналы микроокружения, которые сложно полноценно воспроизвести in vitro. Длительное культивирование и пассирование может приводить к изменению состава и соотношения клеточных маркеров и секреторной активности, что было показано в исследовании на клетках Лейдига.

Можно предположить, что нетипичная экспрессия Sox9, винкулина или виментина в культивируемых клетках Лейдига также связана именно с культивированием на культуральной посуде, без покрытия специальным мягким матриксом. Данное предположение коррелирует с данными литературы. Экспрессия Sox9 практически не выявляется в интерстиции и клетках Лейдига in situ при ИГХ анализе нормальных тканей [17]. Однако Sox9 выявляется, например, при долговременном культивировании в иммортализованной линии MA-10 Leydig cell, экспрессия виментина показана для иммортализованной линии Leydig cell line TTE1 и при исследовании различных опухолевых патологий [18-20].

Для того чтобы на клеточных моделях получать результаты, максимально релевантные процессам, происходящим в организме, по-видимому, следует использовать клетки непосредственно после выделения из семенников, избегая длительного культивирования и пассирования. Ещё одной стратегией является создание условий микроокружения, наиболее приближенных к нативным. Среди примеров можно выделить использование внеклеточного матрикса для 2D- и 3D-культивирования клеток семенника и модели со-культивирования [21-23]. Отдельной развивающейся областью является получение для исследований клеточных сфероидов, содержащих разные типы клеток семенника и имитирующих процессы сперматогенеза [24].

Заключение

Клеточные культуры или более сложные структуры на их основе являются основой для изучения механизмов действия in vitro и дальнейшей разработки моделей специфической активности биологических лекарственных препаратов. Например, была разработана модель на клетках Лейдига, которая основана на их способности под действием терапевтического агента восстанавливать снижающуюся во время культивирования способность секретировать тестостерон. Возможность криоконсервации клеток Лейдига, с сохранением всех ключевых свойств клеточной линии, позволяет создавать стандартизованные коллекции первичных клеток и облегчает процесс валидации биологической методики для оценки специфической активности.