Поиск диагностических микроРНК для идентификации опухолей головного мозга на базе низкотемпературного банка плазмы крови

Введение

Опухоли глиального ряда, и особенно глиомы высокой степени злокачественности, являются чрезвычайно агрессивными и имеют неблагоприятный прогноз [1]. Создание биобанка образцов опухолей головного мозга — это одно из перспективных направлений в нейроонкологии, поскольку он служит основой для прецизионной медицины и длительных проспективных исследований.

Биобанки представляют собой обширные коллекции биологических материалов человека, связанных с соответствующей личной и медицинской информацией, хранящихся для использования преимущественно в медицинских исследованиях. Важными аспектами функционирования биобанка являются: соблюдение принципов биоэтики, конфиденциальность данных, стандартизация процессов отбора и хранения проб, а также контроль качества на каждом этапе [2].

Основным видом биологического материала в биобанках онкологического профиля выступают образцы как свежезамороженных, так и фиксированных в формалине и залитых в парафин тканей. Кроме того, биобанки могут содержать линии опухолевых клеток и образцы биологических жидкостей, представленных, в основном, периферической кровью [2]. За последние годы опубликован ряд исследований [3][4], в которых биомаркеры глиомы, экстрагируемые из крови больных, использовались для различных целей. Это соответствует развивающейся области так называемых "жидких биопсий". Было обнаружено, что циркулирующие биомаркеры глиом полезны в качестве диагностических (включая маркеры степени дифференцировки опухоли), а также прогностических, предиктивных и мониторинговых инструментов [3][4]. МикроРНК (малые некодирующие молекулы рибонуклеиновой кислоты) являются одними из наиболее перспективных жидкостных биомаркеров глиом [1]. К преимуществам циркулирующих микроРНК по сравнению с другими маркерами можно отнести их стабильность во внешних условиях и защищенность от воздействия рибонуклеаз внутри организма, а также доступность биологических жидкостей [4]. В проведенной нами ранее работе методом NGS (Next Generation Sequencing, секвенирования нового поколения) были выявлены уникальные паттерны экспрессии микроРНК в крови пациентов с глиомами разной степени злокачественности [5]. Для этапа валидации данных запланировали сформировать выборки из биоматериала, депонированного в биобанке образцов плазмы крови, созданном в НМИЦ онкологии Минздрава России, г. Ростов-на-Дону [6]. На момент написания настоящей статьи биобанк включал 1100 проб от 550 человек: по 2 аликвоты плазмы на каждый случай. Самую обширную группу составили первичные опухоли головного мозга (475 человек, 950 проб). В выборке глиальных опухолей преобладали глиобластомы, а доброкачественные опухоли были всего у 85 человек (170 проб). В группу вторичных злокачественных новообразований вошли пациенты с метастазами в головной мозг рака молочных желез и рака легких (57 человек, 114 проб). Контрольную группу составили 18 лиц без онкопатологии (36 проб).

Цель работы — оценка уровня циркулирующих микроРНК, выявленных ранее как дифференциально экспрессирующиеся в NGS-профилях различных типов опухолей головного мозга, с использованием валидационной когорты, сформированной на базе низкотемпературного банка биологических образцов.

Материал и методы

В настоящую работу включено 8 здоровых доноров без онкопатологии и 32 пациента, которые были разделены на 4 группы по 8 человек в соответствии с Классификацией опухолей центральной нервной системы (5-е издание) Всемирной организации здравоохранения¹. Характеристика групп представлена в таблице 1. Критерии включения для формирования депозитария плазмы крови больных с глиальными опухолями: подписанное информированное согласие на включение в исследование; наличие морфологической верификации диагноза С71.0-С71.9, D33.0-D33.4; возраст ≥18 лет; отсутствие специализированного лечения по основному заболеванию. Критерием невключения являлось отсутствие информированного согласия либо его отзыв.

В работе соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki, 1964, ред. 2013). Проведение исследования было одобрено этическим комитетом НМИЦ онкологии. От всех участников исследования получено "Информированное согласие на обработку персональных данных и передачу сведений, составляющих врачебную тайну, и на передачу биологического материала".

Процедура биобанкирования образцов, порядок проведения высокопроизводительного секвенирования и отбора целевых микроРНК подробно описаны в предыдущих работах [5-7].

Исследование экспрессии циркулирующих микроРНК осуществляли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с предварительной обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Последовательности праймеров представлены в таблице 2. Статистическую обработку первичных данных проводили согласно рекомендациям, опубликованным в статье Taylor SC, et al. [8]. Уровень экспрессии микроРНК рассчитывали методом 2^−ΔΔCT. Различия в уровнях экспрессии микроРНК при сравнении исследуемых групп оценивали с помощью критерия Краскела-Уоллиса и критерия Мана-Уитни-Уилкоксона с поправкой Бонферрони для множественных сравнений в программной вычислительной среде R 4.5.1, пакет "rstatix". При p<0,05 различия считали статистически значимыми.

Результаты

Целевые микроРНК были выбраны на основе проведенных ранее высокопроизводительного секвенирования, машинного обучения и биоинформационного анализа [5][7]. Для валидации методом ОТ-ПЦР отобрано 10 дифференциально экспрессирующихся микроРНК: hsa-miR-128-3p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR-186-5p — для глиобластомы, hsa-miR-484 — для астроцитомы, hsa-miR-431-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-3168 — для олигодендроглиомы и hsa-let-7c-5p, hsa-miR-363-3p — для менингиомы. В таблице 3 приведена подробная характеристика экспрессии данных микроРНК в исследуемых и контрольной группах.

При сравнении уровня экспрессии 10 микроРНК во всех пяти группах значимые различия демонстрировали miR-128-3p, miR-194-5p, miR-19b-3p и miR-363-3p (таблица 3). В результате попарного сравнения полученных данных обнаружен более высокий уровень циркулирующих hsa-miR-128-3p (рисунок 1 А) и miR-194-5p (р=0,022) (рисунок 1 Б) в группе пациентов с глиобластомой по сравнению с контрольной группой. В целом повышенный уровень этих микроРНК был характерен и для других групп с патологией, однако широкое варьирование показателей экспрессии не позволило достичь статистической значимости на исследованном объеме выборок (рисунок 1 А и Б). Отмечен в 2-2,5 раза более высокий уровень miR-363-3p в плазме крови больных менингиомой (рисунок 1 В), статистически значимыми эти различия были при сравнении с контрольной группой (р=0,025) и группой больных олигодендроглиомой (р=0,028).

Обсуждение

Создание биобанка представляется особенно важным для изучения опухолей головного мозга вследствие их труднодоступного внутричерепного положения [2]. Жидкостная биопсия является приемлемым вариантом для получения достаточно репрезентативного представления об опухоли, позволяя улучшить понимание гетерогенности опухоли и молекулярных изменений в режиме реального времени [4][9]. Процедура получения крови менее инвазивна по сравнению с традиционной биопсией. Однако, несмотря на простоту процедуры получения крови, требуется стандартизация сбора биологических жидкостей и выбора анализируемого маркера [9]. Согласно рекомендациям RANO (Response Assessment in Neuro-Oncology) забор крови осуществляется в научных целях в основном для выявления биомаркеров и мониторинга лечения. Кровь должна быть обработана в течение 3 ч и храниться при температуре -80 ^оC [10]. Мы ужесточили требования к отбору и первичной обработке плазмы на основании предыдущих исследований [6].

Изменение уровня экспрессии микроРНК при глиальных опухолях может выступать в качестве диагностического маркера [3]. На предыдущем этапе исследования были определены полные профили микроРНК в плазме крови пациентов с глиомами, доброкачественными опухолями головного мозга в сравнении с плазмой здоровых людей [5][7]. В настоящей работе подтверждено достоверное различие в уровнях 4-х из 10 циркулирующих микроРНК (miR-128-3p, miR-194-5p, miR-363-3p и miR-19b-3p), дифференцирующих контрольную группу и группы первичных опухолей головного мозга. Роль вышеперечисленных микроРНК в процессе канцерогенеза неоднократно обсуждалась другими исследователями (таблица 4). В результате анализа литературных данных нами были выделены ключевые процессы онкогенеза глиальных опухолей, которые характеризуются аномальной экспрессией вышеперечисленных микроРНК (рисунок 2).

Изменение уровня экспрессии miR-128-3p может служить маркером как нейродегенеративных, так и злокачественных новообразований, поскольку её функционирование отмечено в клетках, происходящих из нейронной линии. Согласно некоторым исследованиям miR-128-3p является одной из наиболее дефицитных микроРНК при глиобластоме, что указывает на ее роль в патогенезе данного заболевания [11]. Однако в метаанализе Hasani F, et al. показано, что экспрессия циркулирующей miR-128 при глиальных опухолях может как снижаться, так и повышаться [3]. В настоящем исследовании уровень miR-128-3p был статистически значимо в 2,5 раза выше у больных с глиобластомой по сравнению с контрольной группой.

Во многих исследованиях микроРНК семейства miR-192, включая miR-194, предлагаются в качестве диагностических маркеров раковых опухолей. Экспрессия miR-194 изменяется при гепатоцеллюлярной карциноме, немелкоклеточном раке легкого, раке желудка, яичников, груди, почек и других. Также было установлено изменение уровня miR-194 в глиальных опухолях [12]. В настоящей работе выявлено повышение уровня экспрессии miR-194-5p в 2,4 раза в группе пациентов с глиобластомой по сравнению со здоровым контролем.

Доказано, что miR-363-3р играет роль в прогрессировании различных видов рака, таргетируя различные мишени, включая SPOCK2, Dickkopf 3, BTG2, SOX-4 и SphK2. При колоректальном раке, раке легкого и гепатоцеллюлярной карциноме miR-363-3р действует в качестве онкосупрессора. Напротив, при лейкемии, раке желудка и глиоме miR-363-3р выступает как онкоген, способствующий развитию заболевания. Уровень ее экспрессии зачастую повышен при глиоме и напрямую связан со степенью злокачественности [13]. Нами был обнаружен более высокий уровень miR-363-3р в плазме пациентов с диагнозом менингиома в 2,2 раза по сравнению с контрольной группой и в 2,5 раза по сравнению с группой пациентов с олигодендроглиомой.

miR-19b относится к кластеру miR-17-92, дисрегуляция которого наблюдается при злокачественных новообразованиях лёгких, молочной железы, толстой кишки, простаты, поджелудочной и щитовидной железы. Подтверждено, что miR-19b является ключевой онкогенной микроРНК в этом кластере. Khayamzadeh M, et al. выявили, что внеклеточные везикулы, содержащие miR-19b, способны стимулировать прогрессирование глиобластомы [14]. В нашей работе miR-19b-3p показала себя в качестве дифференциального диагностического маркера первичных опухолей головного мозга.

Несмотря на небольшой объем исследуемой выборки, который является основным ограничением настоящей работы, проведенный анализ литературы указывает на вовлеченность выбранных микроРНК в процессы глиомагенеза. Следовательно, определение дифференциальной экспрессии miR-128-3p, miR-194-5p, miR-19b-3p, miR-363-3p в крови пациентов с первичными опухолями головного мозга может быть использовано в научных целях и для разработки диагностического теста.

Заключение

Биобанк плазмы крови, созданный на базе ФГБУ "НМИЦ онкологии" Минздрава России, послужил основой для поиска биомаркеров опухолей головного мозга. Уровень экспрессии циркулирующих miR-128-3p, miR-194-5p, miR-363-3p и miR-19b-3p позволил дифференцировать пациентов с первичными опухолями головного мозга различной степени злокачественности от контрольной группы без онкопатологии.