Роль биобанков в изучении частот аллелей в Российской популяции аллелей, ассоциированных с тяжестью течения и исходом COVID-19

Введение

За последние десятилетия роль генетического анализа для широкого спектра медико-генетических исследований сильно выросла. Широкое распространение и удешевление методов секвенирования нового поколения, а также более точечного изучения генетических полиморфизмов путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет нарабатывать большие объемы материала, достаточного для проведения исследований в масштабах целых популяций. Материал аккумулируется в специальных подразделениях — биобанках [1].

Термин "биобанк" определяется как структурированная коллекция биологических образцов и связанных с ними данных, хранящихся для целей настоящих и будущих исследований [2, 3]. Помимо непосредственно хранения данных, биобанки также играют важную роль в унификации методов. Это особенно актуально в условиях совместных мета-исследований, собирающих данные из лабораторий разных регионов или даже стран. Такие задачи как популяционные исследования, создание общенациональных референсных панелей и внедрение разработок в клиническую практику возможны только при условии соблюдения единых методологических подходов [4].

Биобанки играют ключевую роль в изучении частот аллелей. Они обеспечивают доступ к документированным образцам дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), что позволяет исследователям анализировать однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП), собирать статистические данные и находить связь с восприимчивостью к различном заболеваниям, тяжестью их течения и исходами. Например, в геноме человека выявлено 49 полиморфизмов, ассоциированных с более тяжёлым течением COVID-19 (COrona VIrus Disease 2019) [5].

Подавляющее большинство баз данных, специализирующихся на сборе информации по полиморфизмам, таких как Genbank, 1000 genomes, Clinvar и т.д., содержат, в основном, данные о европейских и североамериканских популяциях. Следствием этого являются значительные пробелы в знаниях о генетическом разнообразии других регионов, включая Россию. Недостаток данных может ограничивать точность генетической диагностики и эффективность персонализированной медицины для мало представленных или отсутствующих групп, что особенно проявилось в период пандемии, когда "генетические особенности популяций оказались значимым фактором различий в уязвимости к COVID-19" [6]. Для восполнения этих пробелов требуется участие локальных биобанков и инициатив по секвенированию геномов.

В 2017г на базе СПб ГБУЗ "Городская больница № 40" был организован нозологический биобанк, работа которого осуществляется в соответствии с требованиями международных принципов и норм и организована по модели работы признанных во всем мире международных и региональных организаций, таких как:

• Международное общество биологических репозиториев и репозиториев окружающей среды (International Society for Biological and Environmental Repositories, ISBER);
• Европейское, Средневосточное и Африканское общество биоконсервации и биобанкинга (European, Middle Eastern & African Society for Biopreservation & Biobanking, ESBB);
• Национальный институт исследования рака (National Cancer Institute, США).

Биобанкирование — это наукоемкий процесс, для которого необходим не только грамотно организованный и технологически оснащенный репозиторий, но и отлаженный процесс получения, систематизации и хранения клинических и лабораторных данных. Биобанк СПб ГБУЗ "Городская больница № 40" является уникальным репозиторием благодаря представленной коллекции биоматериала и полному комплексу клинической и лабораторной информации, сопровождающей её.

Несмотря на достижения последних лет, COVID-19 остается значительной проблемой для мирового здравоохранения. Пандемия определила необходимость адаптации существующих правил отечественного биобанкирования [7]. Накопленные данные свидетельствуют о том, что, помимо пола, возраста и сопутствующих заболеваний, на тяжесть и исход заболевания влияет ряд генетических факторов, обуславливающих работу врожденного и приобретенного иммунитета [8-10].

Целью настоящей работы является анализ частоты встречаемости 4-х однонуклеотидных полиморфизмов MUC5B rs35705950, TERT rs2736100, TLR3 rs3775290 и TLR7 rs179008 в популяции, а также их возможной ассоциации с тяжестью течения и исходом COVID-19. Эти варианты были выбраны на основании проведенного нами литературного анализа по ассоциации генетических замен с легочным фиброзом и тяжелым течением COVID-19 [11-14].

Материал и методы

В настоящем исследовании использовались образцы крови 4783 пациентов с диагнозом COVID-19 из коллекции биобанка СПб ГБУЗ "Городская больница № 40". Половозрастная структура и разделение пациентов на группы представлены в таблицах 1, 2. Все пациенты подписали информированное добровольное согласие на участие в исследовании. Форма информированного согласия и иные документы в рамках научно-исследовательского проекта "Биобанкирование и биомедицинские исследования образцов тканей и жидкостей человека" были одобрены на заседании № 119 Экспертного совета по этике СПб ГБУЗ "Городская больница № 40" 09 февраля 2017г.

В группу "случай" были набраны пациенты с диагностированным на момент забора материала COVID-19 тяжелого и крайне тяжелого течения. В группу "COVID-19-контроль" вошли пациенты с COVID-19 средней и легкой тяжести. Группа "популяционный контроль" состоит из условно здоровых доноров биобанка без диагностированного на момент забора материала COVID-19. Дополнительно все пациенты были разделены по исходу заболевания на две категории — с летальным исходом и выжившие.

Анализ полиморфизмов проведен с помощью набора реагентов для мультиплексного определения аллельных полиморфизмов MUC5B rs35705950, TERT rs2736100, TLR3 rs3775290 и TLR7 rs179008 методом ПЦР в режиме реального времени производства ООО "СибДНК". Для анализа использовался прибор CFX96 Touch.

Для оценки статистической значимости различий в частоте встречаемости полиморфизмов между группами использовался точный критерий Фишера и модель множественной логистической регрессии, подобранной с помощью критерия Акаике. При анализе всех возможных комбинаций предикторов применялась поправка на множественное тестирование false discovery rate (FDR) по Бенджамини-Хохбергу. Обработка данных проводилась в программном пакете R.

Результаты

С помощью ПЦР было проведено генотипирование образцов 4793 пациентов по полиморфизмам MUC5B rs35705950, TERT rs2736100, TLR3 rs3775290 и TLR7 rs179008. Результаты представлены в таблицах 3-6.

Рассчитаны аллельные частоты для MUC5B rs35705950, TERT rs2736100, TLR3 rs3775290 и TLR7 rs179008 по всей выборке и по подгруппам тяжести/исхода. Данные по частоте встречаемости близки к информации из базы данных gnomAD (Genome Aggregation Database) версии 4.1. Результаты сравнения в таблице 7.

Первым шагом статистического анализа было сравнение выборок с помощью точного критерия Фишера для количественных данных. Для каждого попарного сравнения выборок было рассчитано p-значение. Результаты приведены в таблице 8. Из всех исследуемых полиморфизмом только генотип АА гена TLR7 показал статистически значимое влияние на тяжесть заболевания (p-значение=0,009).

Следующим шагом было построение модели логистической регрессии для исходов заболевания (1 — летальный исход, 2 — нелетальный) со следующим набором предикторов: пол, возраст и тяжесть заболевания. Модель без взаимодействия показала статистически значимый вклад всех трех предикторов. У мужчин вероятность летального исхода была выше по сравнению с женщинами. С увеличением возраста также наблюдался рост шансов неблагоприятного исхода. Наиболее выраженное влияние имела тяжесть заболевания: пациенты с тяжёлым течением имели существенно более высокое отношение шансов летального исхода по сравнению с пациентами лёгкой и средней тяжести. Доверительные интервалы для всех трёх коэффициентов не включали единицу, что подтверждает статистическую значимость их вклада в модель.

Далее в модель в качестве дополнительных предикторов были добавлены изучаемые полиморфизмы. В связи с тем, что ген TLR7 расположен на хромосоме Х, статистические модели были построены отдельно для каждого пола. Согласно расчету, по отдельности ни один из полиморфизмов не имел статистически значимого влияния на исход заболевания.

Также было исследовано возможное совместное влияние генотипов на исход заболевания. В данном случае анализ также проводился раздельно для мужчин и женщин. Среди всех изученных комбинаций статистически значимыми в отношении исходов заболевания оказались сочетания вариантов TERT AA + TLR7 T у мужчин (p=0,02) и TERT CC + TLR3 CT у женщин (p=0,045). Однако после применения FDR-поправки по Бенджамини-Хохбергу эти ассоциации утратили статистическую значимость (скорректированные p=0,30 и 0,36, соответственно).

Обсуждение

В настоящем исследовании были проанализированы 4 ОНП, расположенных в генах TERT, TLR3, TLR7 и MUC5B. Ген TLR3 кодирует Toll-подобный рецептор 3, который играет ключевую роль во врождённом иммунитете, распознавая вирусные двуцепочечные рибонуклеиновые кислоты (РНК), образующиеся в процессе репликации вирусов, и инициируя TRIF-зависимый сигнальный каскад с последующей активацией транскрипционных факторов и синтезом интерферонов I и III типов. TLR7 кодирует Toll-подобный рецептор 7, способный идентифицировать вирусную одноцепочечную РНК и активировать MyD88-зависимый путь, ведущий к экспрессии интерферонов и провоспалительных цитокинов, что обеспечивает эффективную противовирусную защиту организма [11][15]. Согласно исследованию Абрамовой Н. Д. и др., у пациентов с тяжелой формой COVID-19 экспрессия генов TLR3 и TLR7 статистически значимо снижена [16].

Белок MUC5B, кодируемый одноимённым геном, является высокомолекулярным муцином и одним из основных компонентов мукоцилиарного клиренса дыхательных путей, формирующих барьер, препятствующий проникновению патогенов. Несмотря на то, что полиморфизм MUC5B rs35705950 ассоциирован с повышенным риском развития идиопатического легочного фиброза, исследования других авторов показывают, что носители этого варианта имеют более низкий риск тяжелого течения COVID-19, требующего госпитализации [12][17].

Ген TERT кодирует каталитическую субьединицу теломеразы, обеспечивающую поддержание длины теломер. Помимо этой функции, TERT участвует в регуляции транскрипции и иммунного гомеостаза, а его полиморфизмы рассматриваются как возможные генетические детерминанты предрасположенности к фиброзу лёгких, включая случаи, ассоциированные с тяжёлым COVID-19 [14].

Из всех полиморфизмов по отдельности только для генотипа AA гена TLR7 обнаружена статистически значимая ассоциация с тяжелым течением COVID-19, что согласуется с предыдущими работами о влиянии полиморфизмов TLR7 на исходы заболевания [11][15].

Модели логистической регрессии с учётом пола, возраста и тяжести заболевания не выявили значимого вклада отдельных ОНП в исход COVID-19. При анализе взаимодействий были отмечены два сочетания генотипов, для которых была показана тенденция к ассоциации до коррекции на множественные сравнения: TERT AA + TLR7 T у мужчин и TERT CC + TLR3 CT у женщин. Хотя после FDR-поправки статистическая значимость не сохранилась, эти комбинации могут представлять биологический интерес. Действительно, несмотря на отсутствие прямого взаимодействия между этими генами, имеются общие для TERT, TLR3 и TLR7 сигнальные каскады. Так, TLR3 активирует TRIF-зависимый путь с вовлечением IRF3 (interferon regulatory factor 3) и транскрипционного фактора NF-kB [18]. TERT, в свою очередь, может взаимодействовать с субъединицей p65 (RelA) NF-kB и усиливать транскрипцию его мишеней, включая интерлейкин-6 и фактор некроза опухоли [19][20]. Через эту связь активация TLR3 или TLR7 может привести к усиленной экспрессии противовоспалительных генов в клетках с высоким уровнем экспрессии TERT за счет синергии на уровне NF-kB-зависимой регуляции.

Помимо этого, роль TERT в активации противовирусных путей также подтверждается его участием в индукции экспрессии эндогенных ретровирусов, формирующих двуцепочечную РНК и активирующих RIG-i/MDA5-зависимый интерфероновый ответ [21]. Практическое проявление функциональной связи TERT с TLR7 видно в иммунотерапии: агонисты TLR7, такие как имиквимод, применяются как адъюванты в hTERT-вакцинах, усиливая активацию дендритных клеток и специфический Т-клеточный ответ [22-24].

Заключение

Проведенный анализ распределения полиморфизмов MUC5B rs35705950, TERT rs2736100, TLR3 rs3775290 и TLR7 rs179008 в выборке пациентов с COVID-19 показал, что частоты изученных полиморфизмов в целом сопоставимы с данными глобальной базы gnomAD (Genome Aggregation Database). Среди всех полиморфизмов только генотип AA TLR7 продемонстрировал статистически значимую ассоциацию с тяжелым течением COVID-19.

Модели множественной регрессии не выявили значимого вклада отдельных ОНП в исход заболевания, но анализ совместного влияния показал два потенциально интересных с биологической точки зрения генотип-генотип взаимодействия — TERT AA + TLR7 T у мужчин и TERT CC + TLR3 CT у женщин.

Полученные результаты подчеркивают ценность локальных биобанков для изучения популяционных особенностей распределения аллелей и выявления генетических факторов, влияющих на течение инфекционных заболеваний. Дальнейшие исследования на независимых выборках, а также функциональная валидация выявленных взаимодействий необходимы для подтверждения их клинической значимости и потенциального применения в персонализированной медицине.