Мониторинг активности специфических антител к возбудителям инфекционных заболеваний по материалам биобанка

Введение

Развитие высокотехнологичных методов исследования в области медицины и биологии является триггером стремительного расширения сети биобанков во всем мире. Материалы отдельных коллекций и крупных биобанков стали значимым ресурсом для проведения научных исследований в области как соматической, так и инфекционной патологии. Особым направлением являются популяционные серологические исследования разных аспектов инфекционных заболеваний (от этиологии и патогенеза отдельных инфекций до восприимчивости населения страны в отношении актуальных возбудителей) [1]. Основным и наиболее доступным для определения маркером встречи человека с инфекционным агентом является выработка специфических антител (иммуноглобулинов, Ig) класса G (IgG). В зависимости от специфики антигена по наличию и уровню указанных антител можно судить о стадии инфекционного процесса, наличию в анамнезе вакцинации и т.д. В связи с этим ключевую роль для обеспечения достоверности таких исследований по материалам биобанков играет сохранность антител при низкотемпературном хранении. По данным научной литературы Ig достаточно стабильны при долгосрочном низкотемпературном хранении, однако физические факторы (температура и продолжительность хранения) могут стать причиной искажения результатов исследования [2, 3]. Научные исследования по оптимизации технологического процесса биобанкирования ставят своей целью не только научно обосновать наилучшие условия для обеспечения сохранности антител в биообразцах [4], но и выявить влияние специфики соответствующих антигенов. Температура хранения оказывает значимое влияние на сохранность антител, при этом известно, что предпочтительно использование более низких температур (≤-70 ^оС). Тем не менее, в научной литературе имеются данные о том, что температура хранения -20 ^оС также не оказывает значимого влияния на сохранность специфических антител класса IgG на примере возбудителя бактериальной природы Leishmania infantum [5]. В другой работе установлено, что хранение при температуре -20 ^оС в течение как минимум 15 мес. не оказывает значимого влияния на сохранность антител, специфических к другим бактериальным агентам, таким как гемофильная и пневмококковая инфекции [6].

Исследования стабильности антител, специфичных к антигенам вирусной природы, единичны. Исключением стал COVID-19 (COrona VIrus Disease 2019), в отношении которого показано, что низкотемпературное хранение сыворотки крови в течение 3 лет [7], а также проведение 16 циклов замораживания/оттаивания биообразцов не приводит к появлению ложноотрицательных результатов [8].

В наших предыдущих работах подробно изложены результаты исследования влияния температуры и длительности хранения образцов сывороток крови в биобанке на сохранность общих антител разных классов [9] и специфических антител IgG в отношении таких вирусных инфекций, как корь и краснуха [10].

Настоящая работа посвящена изучению стабильности антител IgG к HBs-антигену (анти-HBs IgG), являющихся ключевым серологическим маркером наличия поствакцинального или постинфекционного иммунитета к гепатиту В. Выбор данного показателя обусловлен высокой значимостью этой инфекции, которая остаётся одной из ведущих причин тяжёлых хронических заболеваний печени, включая цирроз и гепатоцеллюлярную карциному [11-13]. Массовая вакцинация, включённая в национальные календари прививок большинства стран, а также противовирусная терапия изменили структуру циркулирующих вариантов вируса, способствуя селекции мутантных форм, которые могут оставаться недетектируемыми с помощью традиционных методов иммунодиагностики HBsAg и обладать сниженной чувствительностью к поствакцинальному иммунитету [14, 15]. Дополнительно в группах лиц с иммунодефицитными состояниями или тяжёлым преморбидным фоном формирование и долговременная сохранность антительного ответа также могут быть ограничены [16-18]. В этих условиях особое значение приобретает систематический мониторинг напряжённости популяционного иммунитета к гепатиту В с помощью определения протективного уровня анти-HBs IgG в сыворотках крови [19][20] из постоянно пополняемой коллекции биобанка.

Цель исследования — изучить влияние температурных режимов хранения (-20 и -70 ^оС) и длительности экспозиции (6 мес. и 6 лет) на сохранность и стабильность специфических антител класса IgG к HBs-антигену вируса гепатита В в образцах сывороток крови, хранящихся в биобанке.

Материал и методы

Для проведения исследования использованы образцы сыворотки крови от условно здоровых лиц в возрасте от 18 до 55 лет (47% мужчин, 53% женщин) из коллекции биобанка научно-исследовательского учреждения. Аликвоты образцов сывороток крови хранили в криопробирках (Axygen Scientific, USA) с завинчивающимися крышками, при низких температурах (-20 ^оС; -70 ^оС) в морозильных камерах (производство (модель Ultra Low, Sanyo, Япония). Все указанные камеры имеют датчики температуры, значение которой выведено на табло передней панели. Контроль режима хранения образцов осуществляли сотрудники лаборатории в ежедневном режиме, что отражено в соответствующей внутренней документации.

Образцы сывороток крови (n=180) были исследованы сразу после поступления в лабораторию (нативные образцы) и по завершении хранения в разных температурных и временных условиях в соответствии с двумя сценариями исследования (в каждом из них использовали по 90 образцов). Первый сценарий предполагал исследование двух аликвот образцов, после их хранения в течение 6 мес. в двух температурных режимах: при температуре -20 ^оС (первая аликвота) и -70 ^оС (вторая аликвота). Второй сценарий исследования предполагал исследование образцов после хранения при температуре -70 ^оС за два разных по продолжительности периода хранения: 6 мес. (первая аликвота), 6 лет (вторая аликвота) (рисунок 1).

Повторные циклы замораживания/оттаивания образцов были исключены, т.к. для проведения работы использованы разные аликвоты. Размораживание биообразцов проводили в несколько этапов — последовательное выдерживание в температурных интервалах: 1) от -20 до -22 ^оС (сут.); 2) от +4 до +6 ^оС (сут.); 3) от +19 до +21 ^оС (2 ч).

Определение уровня иммуноглобулинов класса IgG к HBs-Ag вируса гепатита В в образцах сыворотки крови в каждом опыте осуществляли одномоментно методом твердофазного непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием соответствующих тест-систем (разных лотов) производства ЗАО "Вектор-Бест" (Россия) в пределах срока годности. Постановку ИФА в двух сценариях исследования осуществлял один и тот же сотрудник.

Проведение работы одобрено локальным этическим комитетом (протокол № 2 от 4 февраля 2016г).

Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью программ Microsoft Excel и STATISTICA 12.0. Уровни значимости α и β установлены равными 5% (т.е. значение р<0,05, рассматривается как значимое, а анализ имел 95%-ю мощность). Для статистического анализа полученных значений уровня антител на каждом этапе исследования было оценено распределение исследуемых величин. С помощью критерия Шапиро-Уилка установлено несоответствие распределения уровней антител нормальному закону (распределению Гаусса), в связи с чем использованы непараметрические методы описательной статистики с расчетом медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q25-Q75). Сравнение групп проводили при помощи критерия Уилкоксона (Т). Если Т<Ткр, где Ткр — табличное значение, зависящее от объема выборки, то различия были статистически значимыми при р<0,05. Для оценки корреляционной связи использовали коэффициент корреляции Спирмена (ρ).

Результаты

Первый сценарий исследования

При исследовании нативных образцов сывороток крови в рамках первого сценария исследования (n=90) установлено, что в 62 из них не были выявлены антитела к HBs-Ag. При повторном исследовании по истечении 6 мес. хранения в обоих температурных режимах в 12 из них были выявлены анти-HBs IgG на уровне ниже минимального положительного значения (cut off =10 МЕ/мл). В 9 нативных образцах были выявлены антитела на уровне ниже значения cut off, что не изменилось и при повторном исследовании после хранения их при температуре -60 ^оС. Однако хранение указанных образцов при температуре -20 ^оС оказало значимое негативное влияние — все 9 образцов стали положительными (т.е., появилось 9 ложноположительных образцов). Средний уровень anti-HBs-антител в нативных образцах составил 35,5 (7,8-76,8) МЕ/мл. Этот показатель несколько снизился после хранения образцов при температуре -60 ^оС (29,5 (8,08-62,5) МЕ/мл), а при температуре -20 ^оС — значительно возрос и составил 65,3 (26,0-105,0) МЕ/мл (Т<Ткр при р<0,05). Для наглядности полученных результатов образцы были упорядочены по мере увеличения уровня антител в нативных аликвотах, которые представлены на графике в виде закрашенной области, тогда как значения, полученные при повторном исследовании, изображены в виде точек (рисунок 2).

Видно, что уровень антител в образцах, хранившихся при -20 ^оС, значительно варьировал и всегда превышал значение, полученное для соответствующих нативных аликвот. Тем не менее, между уровнями антител в нативных образцах и уровнем антител после 6 мес. хранения при температурах -20 и -60 ^оС выявлена корреляционная связь, коэффициент составил t=0,97 при р<0,05 и t=0,99 при р<0,05, соответственно.

Второй сценарий исследования

90 нативных образцов после исследования на anti-HBs IgG были аликвотированы на две аликвоты и заложены на хранение при температуре -60 ^оС. Одна из них была разморожена и исследована через 6 мес. хранения, а вторая — через 6 лет хранения. В 25 нативных образцах anti-HBs IgG не были выявлены, в 15 из них появились антитела на уровне, не превышающем значения cut off, по истечении двух периодов хранения. После 6 лет хранения осталось только два образца, в которых антитела не определялись, а в двух образцах уровень антител превысил пограничное значение cut off и они стали положительными.

Медианный уровень anti-HBs- IgG в нативных образцах (исследованных сразу после поступления в лабораторию) составил 72,5 (27,9-132,0) МЕ/мл. Этот показатель снизился после хранения образцов при температуре -60 ^оС в течение 6 мес. до значения 49,3 (4,0- 98,4) МЕ/мл (различия статистически значимы, Т<Ткр при р<0,05), и 6 лет — до 33,3 (6,15-88,4) МЕ/мл (различия статистически значимы, Т<Ткр при р<0,05). При этом основной вклад в процесс снижения антител внесли именно первые 6 мес. низкотемпературного хранения.

На рисунке 3 видно, что чем выше был уровень антител в нативных образцах, тем более выраженное его снижение произошло после хранения, что согласуется с данными, полученными нами ранее для других инфекций [9][10].

Обсуждение

Наряду со многими преимуществами, которые может обеспечить биобанк для проведения исследований с использованием репрезентативных коллекций биообразцов, отвечающих отраслевым и международным стандартам качества, существуют опасения, что длительный период хранения может оказать негативное влияние на активность исследуемых маркеров, в т.ч. Ig [21]. Кроме того, для максимального замедления всех биохимических процессов и предотвращения деградации биологических молекул предпочтительным является хранение образцов при очень низкой температуре (от -70 до -196 ^оС (температура жидкого азота)). Наиболее распространенным для большинства биобанков и отдельных коллекций биообразцов является хранение биоматериала при температуре в пределах от -20 до -90 ^оС [22]. В связи с этим экспериментальное обоснование допустимости указанной температуры и значительной продолжительности хранения образцов сывороток крови при проведении сероэпидемиологических исследований повышает доверие исследователей к биобанкированию.

Полученные данные согласуются с результатами наших предыдущих исследований [9][10] и данными других авторов о снижении уровня антител при долгосрочном хранении при температуре -70 ^оС. Так, в комплексном исследовании Aladawy AI, et al. было показано, что содержание антител, как и других значимых специфических и неспецифических маркеров инфекционного процесса, при хранении сыворотки крови снижается [23]. Однако указанное снижение не приводит к изменению интерпретации результатов и появлению ложноотрицательных результатов. Как и в предыдущих наших работах, в отношении антител к HBs — Ag гепатита В установлено, что наибольшее снижение их уровня происходило в образцах с высоким уровнем в нативных аликвотах. Объяснением этому явлению может служить следующее. В соответствии с данными научной литературы, процесс денатурации антител более выражен в тех образцах, где они имеют низкий уровень. Однако при средних и высоких титрах IgG негативное влияние длительного низкотемпературного хранения минимально [24].

Следует отметить, что наиболее заметное падение среднего уровня антител наблюдалось в первые 6 мес. хранения. В последующий 6-летний период регистрировалось лишь незначительное снижение их содержания. При этом появление двух ложноотрицательных образцов (со значениями, близкими к пограничным) в общей выборке (n=90) не оказывает существенного влияния на результаты популяционных исследований.

Температура хранения -20 ^оС неблагоприятно отразилась на уровне изучаемых антител, что не только привело к появлению 9 ложноположительных образцов, но выразилось в 2-кратном увеличении среднего уровня антител в выборке: с 35,5 (7,8-76,8) до 65,3 (26,0-105,0) МЕ/мл. Это, в конечном итоге, может привести к искажению результатов популяционных исследований при использовании материалов биобанка. Тем не менее, это не вполне согласуется с результатами других авторов об отсутствии значимого влияния указанной температуры хранения на стабильность антител [5, 6]. Однако заметим, что приведенные исследования проводились в отношении антител, выработанных в ответ на антиген бактериальной природы, тогда как полученные нами данные характеризуют антитела IgG на вирусные инфекционные агенты.

Ограничения исследования связаны с изучением только одного специфического маркера встречи с возбудителем гепатита В. Для уточнения выявленных зависимостей целесообразно расширение перечня исследуемых маркеров, в т.ч. специфических иммуноглобулинов класса IgM. Кроме того, оптимальным было бы одномоментное исследование образцов сывороток крови на наличие антител к возбудителям бактериальной и вирусной природы.

Заключение

Таким образом, установлено, что использование образцов сывороток крови из биобанков является надёжным инструментом для проведения сероэпидемиологических исследований и обеспечивает достоверность получаемых популяционных данных. Установлено, что хранение образцов при температуре -70 ^оС в течение 6 лет не оказывает существенного влияния на точность полученных результатов определения уровня анти-HBsAg IgG. В то же время хранение при -20 ^оС может рассматриваться лишь как краткосрочный вариант: уже через 6 мес. наблюдается удвоение уровня антител и появление ложноположительных результатов. Строгое соблюдение международных и национальных стандартов по условиям хранения биообразцов является необходимым условием обеспечения репрезентативности и достоверности сероэпидемиологических исследований распространённости антител IgG среди населения.