Опыт создания коллекции культур микроорганизмов и биологических образцов референс-центра ФГБУ "НМИЦ колопроктологии им. А. Н. Рыжих" Минздрава России

Введение

Коллекции культур микроорганизмов играют важную роль в изучении микробиологических аспектов инфекционных и неинфекционных заболеваний человека [1][2]. Они являются основой для мониторинга антибиотикорезистентности, оценки изменчивости клинически значимых микроорганизмов, разработки новых диагностических тестов и медицинских изделий, а также для исследований функциональных свой­ств микробиоты. Особое значение имеет формирование коллекций, отражающих структуру локальных микробных популяций, что позволяет своевременно реагировать на изменение циркуляции патогенов в регионах и расширяет возможности эпидемиологического надзора [3]. Сохранность штаммов микроорганизмов осуществляется комплексом мероприятий по обеспечению коллекционной деятельности, которая в Российской Федерации возложена на Государственные коллекции патогенных микроорганизмов [4][5].

Биобанкирование является одним из ключевых направлений современной биомедицинской науки, обеспечивая сохранение, систематизацию и использование биологических ресурсов для фунда­мен­тальных и прикладных исследований [6]. Развитие технологий хранения биоматериала создало условия для долгосрочного накопления данных, необходимых для изучения этиологии, патогенеза и эпидемиологии широкого спектра заболеваний. Криоконсервация, как центральный компонент биобанкирования, позволяет стабильно сохранять жизнеспособность микроорганизмов и клеток в течение длительного времени, с установленными протоколами при сверхнизких температурах, обеспечивая их доступность для научных проектов, верификационных процедур и клинических разработок [7][8].

Для области колопроктологии создание специализированных биобанков является особенно актуальным. Микробиота толстой кишки и облигатно-анаэробные бактерии играют существенную роль в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), развитии осложнений после хирургических вмешательств, формировании несостоятельности анастомоза, возникновении длительно незаживающих ран и инфекций промежности [9]. Наличие клинически релевантных, стандартизированных штаммов микроорганизмов позволяет исследовать механизмы нарушений микробного баланса, оценивать влияние микробиоты на течение хронических заболеваний, а также разрабатывать новые подходы к терапии и профилактике [10].

В последние годы наблюдается рост интереса к ретроспективным микробиологическим исследованиям, связанным с анализом эволюции штаммов, изучением генетических детерминант антибиотикорезистентности, оценкой изменений микробиоты под влиянием терапии [11][12]. Эти задачи невозможно реализовать без системного хранения депонированных изолятов. В Российской Федерации нормативную функцию по сохранению патогенных микроорганизмов выполняют государственные коллекции, однако специализированные клинические коллекции также приобретают важное значение, обеспечивая отраслевую направленность исследований.

Цель работы — описание методологии формирования банка микроорганизмов и биоматериала пациентов колопроктологического профиля на базе референс-центра ФГБУ "НМИЦ колопроктологии им. А. Н. Рыжих" Минздрава России.

В статье представлен опыт работы с биоматериалом при анаэробных инфекциях, ВЗК и опухолевых процессах, описаны принципы криоконсервации, систематизации и паспортизации штаммов. Приведенные подходы могут быть использованы для организации аналогичных коллекций в других медицинских учреждениях, участвующих в мониторинге биологических рисков и развитии медицинской микробиологии.

В структуре референс-центра по верификации результатов микробиологических исследований по профилю "колопроктология" Министерства здравоохранения Российской Федерации, созданного на базе ФГБУ "НМИЦ колопроктологии им. А. Н. Рыжих" Минздрава России функционирует криобанк, который является коллекционным центром, где создаются коллекции чистых культур микроорганизмов, коллекции выделенных дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК)-штаммов микроорганизмов и коллекции клинических биоматериалов от пациентов с заболеваниями толстой и прямой кишки.

Сбор биологического материала от пациентов с колоректальными заболеваниями осуществляется в отделениях хирургического, терапевтического и поликлинического профиля ФГБУ "НМИЦ колопроктологии им. А. Н. Рыжих" Минздрава России медицинскими сотрудниками или путем самовзятия пациентами (например, кал). В референс-центр также направляются культуры микроорганизмов и биологические материалы из 91 медицинской организации 73 субъектов Российской Федерации, с которыми ФГБУ "НМИЦ колопроктологии им. А. Н. Рыжих" Минздрава России заключили договора сотрудничества по мониторингу биологических угроз (рисунок 1).

Система мониторинга биологических рисков

В рамках функционирования референс-центра реализуется многоуровневая система мониторинга биологических рисков, направленная на выявление и отслеживание динамики распространённости клинически значимых микроорганизмов, включая штаммы с множественной лекарственной устойчивостью. В задачи системы входит:

• получение культур микроорганизмов и биоматериалов от медицинских организаций — участников мониторинга;
• выделение чистых культур и формирование коллекций;
• регулярный анализ антибиотикорезистентности штаммов с использованием унифицированных методов;
• оценка географических особенностей распространения резистентных к антимикробным препаратам (АМП) форм;
• ежегодная передача аналитических данных в заинтересованные подразделения Минздрава Рос­сии.

В коллекции изучаются и хранятся штаммы микроорганизмов, выделенные из биоматериалов, квалифицированные как "материал из предполагаемого очага инфекции", а также микроорганизмы — представители микробиоты кишечника, выделенные из просветной и пристеночной микробиоты от пациентов с заболеваниями толстой кишки.

Для транспортировки биологического материала в референс-центр применяются стерильные коммерческие транспортные системы, рекомендованные производителем для сохранения аэробных и облигатно-анаэробных микроорганизмов, а также стерильные контейнеры для сбора биоматериала для исследования микробиоты кишечника.

Видовая идентификации микроорганизмов, выделенных из биологических материалов или штаммов, поступивших в референс-центр, проводится методом MALDI-TOF-MS (Матрично-активированная лазерная десорбционная/ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия) анализа. Депонированию подлежат верифицированные до вида штаммы микроорганизмов, полученные при первичном росте на плотных питательных средах с идентификацией в автоматическом или ручном режиме с уровнем достоверности идентификации score ≥2,0, что свидетельствует о точной видовой идентификации. Все штаммы микроорганизмов, которые подвергаются длительному хранению, изу­чаются по различным темам научных проектов.

При криоконсервации выделенного микроорганизма проводится идентификация и/или верификация (при поступлении штамма в референс-центр), а также изучение фенотипических свой­ств, определение чувствительности к АМП и дезинфицирующим средствам, определение патогенности для некоторых видов микроорганизмов, тестирование на наличие генов антибиотикорезистентности. Микроорганизму присваивается код штамма, заполняется паспорт штамма и формируется запись в электронной базе данных на основе программного продукта лабораторной информационной системы "Акросс-Клиническая Лаборатория" (ЛИС АКЛ). Пробирки с культурой распределяются по штативам для заморозки.

В основном разделение происходит по родам, например: Enterococcus spp., Bifidobacterium spp., если штаммов одного вида выделяется достаточно много, то используется штатив только для одного вида, например, Escherichia coli, Clostridium perfringens. Все данные по пробе и штамму, а также информация о местоположении конкретного изолята, его номер и видовое название вносятся в ЛИС АКЛ с заполнением формы "Архив штаммов" для формирования базы данных штаммов микроорганизмов и статистической обработки данных (рисунок 2).

Хранение культур микроорганизмов проводится в криопробирках коммерческого производства. Удобство консервации в криопробирках коммерческого производства, в состав которых входит жидкая питательная среда и бусинки, на поверхности которых адсорбируются микроорганизмы, заключается в том, что при необходимости высева культуры достается одна бусина и производится посев на плотную или жидкую питательную среду, без потери оставшейся порции микробных клеток. Хранение штаммов микроорганизмов осуществляется в крио­среде при -80 ^оC; хранение ДНК возбудителей в морозильной камере при -80 ^оC. Штаммы облигатно-анаэробных микроорганизмов депонируются и хранятся дополнительно в специальной криосреде, которая позволяет сохранять облигатно-анаэробные микроорганизмы без потери их жизнеспособности, согласно разработанной в референс-центре инструкции.

Все культуры замораживаются в трех повторениях и хранятся в разных морозильных камерах, которые поддерживают постоянную температуру -80 ^оС, с целью сохранения штамма в случае выхода из строя морозильного оборудования. Каждые 3 года проводится пересев культур для поддержания жизнеспособности.

Для хранения образцов фекалий (кала), проба в количестве 1-2 г (1-2 мл жидкий кал) одноразовыми лопатками переносится в специальный стерильный флакон. Если образцы фекалий были оформленными, то готовится фекальная суспензия (при водянистой консистенции фекалий суспензию не готовят). Для приготовления фекальной суспензии в соответствующее пробам количество микроцентрифужных пробирок (объемом 1,5 мл) вносится 0,8 мл фосфатного буфера (или стерильного изотонического раствора натрия хлорида). В каждую пробирку отдельным наконечником с фильтром (или одноразовыми лопатками) вносятся 0,1 г (0,1 мл) фекалий и тщательно ресуспендируются на вортексе до образования гомогенной суспензии. Для длительного хранения в каждую пробирку с суспензией в качестве криопротектора добавляется стерильный глицерин в конечной концентрации 10-15%. Подготовленные таким образом пробы замораживаются при температуре ≤-70 ^оС после тщательной гомогенизации и экспозиции с глицерином в течение 30-40 мин.

Хранение образцов отделяемого ран, пунктатов, содержимого абсцессов и т.д. проводится по следующему протоколу: биоматериал с зонда-тампона (тупфера) помещается в подготовленные микропробирки с фосфатным буфером (или стерильным изотоническим раствором натрия хлорида). При необходимости наконечник зонда-тампона (тупфера) срезается стерильными ножницами и оставляется в микропробирке. Далее биологические образцы замораживаются при температуре ≤-70 ^оС.

Образцы биоптатов измельчаются стерильным скальпелем (или ножницами) с последующей гомогенизацией с добавлением изотонического раствора хлорида натрия объемом 0,5-1 мл. Далее добавляется глицерин в конечной концентрации 10-15%. Подготовленные таким образом биообразцы замораживаются при температуре ≤-70 ^оС только после экспозиции с глицерином в течение 30-40 мин.

В настоящее время сформированы несколько направлений по научным проектам, по которым проводится банкирование биологических материалов, чистых культур микроорганизмов и выделенных ДНК:

— аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, обладающие множественной резистентностью к АМП;

— облигатно-анаэробные микроорганизмы, обладающие множественной резистентностью к АМП;

— штаммы лактобактерий, обладающие антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных возбудителей;

— штаммы, выделенные из отделяемого и биоптатов длительно незаживающих ран;

— штаммы, выделенные из отделяемого и биоптатов кишечных анастомозов, свищей и абсцессов;

— штаммы, выделенные из пристеночной и про­светной микробиоты пациентов с ВЗК;

— токсин-продуцирующие штаммы Clostridioi­des difficile;

— штаммы микробиоты кишечника, обладающие пробиотическими свой­ствами.

Коллекция микроорганизмов и биологических образцов биобанка ФГБУ "НМИЦ колопроктологии им. А. Н. Рыжих" Минздрава России создана в 2021г. В настоящее время в коллекцию входят >7500 культур микроорганизмов, включая >1100 штаммов E. coli, >1200 пробиотических штаммов лакто- и бифидобактерий, ~2300 изолятов облигатно-анаэробных бактерий и ~700 образцов биологического материала, полученных от пациентов с колопроктологическими заболеваниями, такими как болезнь Крона, язвенный колит, хронические анальные трещины, синдром раздраженного кишечника, колоректальный рак и др. Ежемесячно в референс-центре депонируется >200 штаммов микроорганизмов. Начиная с 2023г, ведется паспортизация всех депонированных штаммов. На сегодняшний день паспортизированы 3869 штаммов. В 2025г было депонировано 5 штаммов высокоактивных лактобактерий в Уникальную научную установку "Коллекция микроорганизмов III и IV групп патогенности НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова". Происходит патентирование этих культур.

Коллекция содержит 985 штаммов факультативно-анаэробных микроорганизмов из группы ESKAPE-патогенов (устойчивые к антибиотикам бактериальные микроорганизмы, которые вызывают внутрибольничные инфекции: Enterococcus fae­ci­um, Sta­phy­lococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acine­to­bac­ter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacter spp.) с множественной резистентностью к АМП, выделенных от пациентов с колопроктологическими заболеваниями, в т.ч. и ВЗК. Культуры антибиотико-резистентных штаммов, получены из различных регионов Российской Федерации в рамках соглашения медицинских организаций с референс-центром. В коллекцию входят штаммы энтеробактерий, обладающие генами карбапенемаз (KPC, OXA-48, NDM, VIM, IMP), а также метициллин-резистентные штаммы стафилококков и ванкомицин-резистентные штаммы энтерококков. Среди штаммов облигатно-анаэробных бактерий депонированы культуры, обладающие множественной резистентностью к различным группам АМП (ампициллин/сульбактам, пиперациллин-тазобактам, имипенем, меропенем, клиндамицин, метронидазол, ванкомицин).

Развитие микробиологических биобанков является одним из ключевых направлений современной биомедицинской науки, что отражено в международных стратегиях по стандартизации и интеграции биоресурсных коллекций. В последние годы биобанкирование микроорганизмов перестало рассматриваться лишь как инструмент сохранения штаммов и превратилось в самостоятельную область, обеспечивающую воспроизводимость исследований, поддержку крупных научных проектов и формирование долгосрочных эпидемиологических наблюдений. Переход к биоспецифическим и клинически ориентированным коллекциям, соответствующим требованиям ISO 20387 и ISO 23494, усилил значимость структур, обеспечивающих контролируемое хранение, высокоточное документирование и аналитическую обработку микробиологических данных [13][14].

Представленная в работе коллекция биобанка ФГБУ "НМИЦ колопроктологии им. А. Н. Рыжих" формировалась с учётом этих требований и занимает особое место среди отечественных и зарубежных биоресурсных центров. Её уникальность заключается в узкой клинической специализации, ориентированной на заболевания толстой и прямой кишки, что не имеет прямых аналогов в российских коллекциях и слабо представлено в международных реестрах. Особую ценность представляет масштабная коллекция облигатно-анаэробных микроорганизмов, традиционно недостаточно охваченная мировыми биобанками из-за сложности выделения, культивирования и длительного хранения таких культур. Большая часть анаэробных штаммов, депонированных в данной коллекции, имеет клиническую значимость для патогенеза воспалительных заболеваний кишечника, осложнений после хирургических вмешательств и несостоятельности кишечных анастомозов, что делает их востребованным ресурсом для фундаментальных и трансляционных исследований [15].

Сравнение с зарубежным опытом показывает, что формирование высоко характеризованных коллекций, содержащих данные о генетических детерминантах антибиотикорезистентности, фенотипических свой­ствах штаммов и особенностях их циркуляции, является глобальным трендом. Такие подходы реализованы в европейских микробных биобанках и микробиомных хранилищах США, которые активно используются для разработки новых диагностических технологий и поиска функциональных пробиотиков [16][17]. Коллекция биобанка НМИЦ колопроктологии соответствует этим тенденциям: значительную её часть составляют штаммы с подтверждённой множественной лекарственной устойчивостью, включая представителей группы ESKAPE, продуценты карбапенемаз, а также резистентные облигатные анаэробы. Широкая география поступления материала из 73 субъектов Российской Федерации формирует уникальную базу для изучения региональных особенностей антибиотикорезистентности и динамики её распространения.

Не менее важным является участие биобанка в системе мониторинга биологических рисков. Стандартизированное депонирование штаммов, их систематическая паспортизация и возможность ретроспективного анализа обеспечивают высокий уровень аналитической ценности коллекции. Хранение материала в течение длительного времени позволяет отслеживать эволюцию клинически значимых микроорганизмов, выявлять новые механизмы устойчивости, проводить сравнительные исследования и своевременно реагировать на эпидемиологические угрозы. Такой подход соответствует мировым требованиям к функционированию биобанков, нацеленным на повышение биологической безопасности и поддержание готовности к реагированию на новые инфекционные вызовы [13][14].

Помимо эпидемиологического значения, кол­лекция активно используется в научной деятельности ФГБУ "НМИЦ колопроктологии им. А. Н. Рыжих". Штаммы из биобанка применяются в исследованиях, посвящённых роли микробиоты в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника, изучению факторов нарушения репаративных процессов после оперативных вмешательств, разработке новых диагностических методик и выделению перспективных пробиотических культур. Такой трансляционный характер использования биобанка соответствует современному международному тренду превращения коллекций микроорганизмов в многофункциональные исследовательские платформы, интегрирующие клинические, микробиологические и молекулярно-генетические данные [1][7]. Таким образом, созданная коллекция биобанка НМИЦ колопроктологии не только соответствует мировым стандартам, но во многом обладает уникальными характеристиками, дополняющими глобальные биоресурсные инициативы. Её вклад в развитие клинической микробиологии, эпиднадзора и фундаментальных исследований делает её важным инструментом биомедицинской науки, а дальнейшее расширение и интеграция с международными платформами позволит существенно укрепить позиции России в области биобанкирования и исследований микробиоты.

Заключение

Биобанк ФГБУ "НМИЦ колопроктологии им. А. Н. Рыжих" Минздрава России обладает уникальной коллекцией микроорганизмов, в т.ч. штаммов, резистентных к антибиотикам широкого спектра в отношении возбудителей анаэробных инфекций. Проводится контроль качества сохраняемых микроорганизмов и внесение всех данных по характеристике культуры в ЛИС АКЛ. Сохраненные культуры микроорганизмов, выделенные ДНК и другие биологические материалы используются в научных проектах ФГБУ "НМИЦ колопроктологии имени А. Н. Рыжих" Минздрава России, в работе по мониторингу распространения антимикробной резистентности, которая ведется в референс-центре, а также при разработке новых методов диагностики, профилактики и лечения пациентов с колопроктологическими заболеваниями.

Коллекционная деятельность, связанная с использованием штаммов микроорганизмов — это направление научной деятельности по обеспечению биологической безопасности и санитарно-эпи­де­мио­логического благополучия населения Рос­сий­ской Федерации, которое успешно реализуется и гармонично развивается. Вместе с этим некоторые аспекты этой важной функции требуют дальнейшего совершенствования.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.