Анализ биохимических маркеров в неинвазивной оценке митохондриальной дисфункции и митохондриального здоровья (обзор литературы)

Введение

В последние годы в контексте превентивной медицины особый интерес в научном и клиническом сообществе уделяется концепции "митохондриального здоровья" — состояния оптимального функционирования митохондрий и, соответственно, наиболее эффективного и физиологичного энергетического обмена [1-3]. Митохондриальная дисфункция представляет собой комплекс субклеточных и молекулярных изменений, происходящий при нарушении работы митохондрий и связанных с ними метаболических процессов [4].

В настоящее время в отечественной и зарубежной литературе принято разделять патологию митохондрий на две группы — первичные митохондриальные заболевания, обусловленные генетическими факторами, и вторичные митохондриальные нарушения, развивающиеся в процессе онтогенеза и являющиеся одним из факторов в развитии хронических неинфекционных заболеваний (ХНИЗ). К первичным митохондриальным заболеваниям относится ряд состояний, связанных с мутациями в митохондриальной дезоксирибонуклеиновой кислоте (мтДНК) или генах, кодирующих белки митохондрий [5]. В настоящее время описано около 4000 подобных мутаций, среди которых наиболее изучены такие заболевания, как наследственная оптическая нейропатия Лебера (мутации в генах MT-ND1, MT-ND4, MT-ND4L, MT-ND6), синдром Лея (мутации в >75 различных митохондриальных генах), митохондриальная энцефалопатия с лактацидозом и инсультоподобными эпизодами (мутации в генах MT-ND1, MT-ND5, MT-TH, MT-TL1 и MT-TV), синдром Кернса-Сейера (делеции мтДНК) и др. [5][6].

Вторичные митохондриальные нарушения чаще всего наблюдаются при возраст-ассоциированных патологиях, включая нейродегенеративные заболевания, заболевания сердечно-сосудистой системы, ожирение, саркопению; при этом нарушения функций митохондрий запускают механизмы, ускоряющие процессы старения на клеточном и субклеточном уровнях. Так, ключевыми молекулярными процессами при данных нозологиях являются накопление мутаций в мтДНК и процессы окислительного стресса, приводящие к снижению эффективности белковых ансамблей митохондрий, так называемых комплексов дыхательной цепи, включающих комплекс I – НАДН-убихинон-оксидоредуктаза (никотинамидадениндинуклеотид восстановленный-убихинон-оксидоредуктаза), комплекс II — сукцинат-убихинон-редуктаза, комплекс III — убихинол-цитохром С-оксидоредуктаза), комплекс IV — (цитохром С-оксидаза), комплекс V — АТФ-синтаза (аденозинтрифосфат-синтаза), под действием которых осуществляется перенос электронов и синтез АТФ [1].

Некоторые исследователи выделяют отдельное направление — "митохондриальную медицину", так называемую "mitochondrial based medicine" или "mitochondrial based therapy", как раздел медицинской науки, включающий изучение и терапию как наследственных митохондриальных заболеваний, так и приобретенных нозологических форм, важным звеном патогенеза которых является нарушение обмена веществ, происходящего в митохондриях [7][8]. Важно отметить, что выделение отдельного направления "митохондриальной медицины" является дискуссионным вопросом и в рамках профилактической медицины более целесообразно рассматривать митохондриальное здоровье и митохондриальную дисфункцию в комплексе с другими процессами, включающими клеточный стресс, программируемую клеточную гибель, хроническое воспаление низкой интенсивности. В то же время митохондриальная дисфункция является значимым патогенетическим звеном, связывающим процессы, приводящие к развитию различных ХНИЗ [3][9]. Учитывая внутриклеточную локализацию митохондрий, а также их различия в зависимости от типа клеток и тканей, следует понимать, что неинвазивная оценка митохондриальной дисфункции с использованием циркулирующих биомаркеров является особенно сложной задачей [10][11].

Целью обзора является систематизация результатов актуальных исследований, посвященных циркулирующим биомаркерам митохондриальной дисфункции и оценке их потенциала в профилактической медицине и кардиологии.

Методология исследования

Поиск литературных источников проведен по заголовкам, содержанию аннотаций, ключевым словам в системах индексирования научных публикаций E-library, PubMed, Google Scholar, Web of Science. Поиск проводился по ключевым словам на русском и английском языках: митохондриальная дисфункция, митохондриальное здоровье, программируемая клеточная гибель, клеточный стресс, сиртуины, GDF-15, FGF-21, PGC1α, цитохром С, HIF-1α (гипоксией-индуцируемый фактор 1-альфа), неоптерин, аммиак). Глубина поиска составила 10-15 лет. В обзор включались публикации, касающиеся как фундаментальных аспектов функционирования митохондрий, так и конкретные исследования, в которых детально описана лабораторная методология. В настоящем обзоре представлены данные 51 литературного источника.

Результаты

Митохондриальная дисфункция представляет собой сложный патологический процесс, связанный с рядом ключевых молекулярных механизмов, приводящих к развитию широкого спектра ХНИЗ (рисунок 1). Хроническое воспаление низкой интенсивности, окислительный стресс и тканевая гипоксия, психоэмоциональный стресс, дефицит железа и магния, авитаминозы, вредные привычки, неблагоприятные физические и химические факторы внешней среды, а также врожденные и приобретенные мутации мтДНК приводят к снижению эффективности митохондриальных метаболических путей и, в конечном счете, к разрушению митохондрий [4].

Неинвазивная оценка данных нарушений возможна в результате поступления продуктов деградации митохондрий во внеклеточную среду и далее в кровоток, а также благодаря наличию описанных связей митохондриальной дисфункции с такими процессами как программируемая клеточная гибель, окислительный и клеточный стресс, хроническое воспаление, циркулирующие маркеры которых активно изучаются и которые также могут помочь в оценке выраженности митохондриальной патологии [10].

Крайне интересным и важным для понимания патобиохимического значения митохондриальной дисфункции является то, что митохондрии, согласно современным представлениям, ведут свое эволюционное происхождение от бактерий; тем самым, многие компоненты митохондрии, попадая во внеклеточную среду, вызывают мощный иммунный ответ, аналогичный ответу на внешние патогены. Так, повреждение митохондрий приводит к выходу в цитоплазму и, как следствие, во внеклеточную среду DAMP — Damage Associated Molecular Patterns (молекулярных паттернов, связанных с повреждением), при этом для повреждения митохондрий характерен специфический спектр данных соединений, включающий мтДНК, N-формилпептиды, митохондриальные транскрипционные факторы, кардиолипины и различные метаболиты [1].

Митохондрия содержит циркулярный геном, включающий >16 тыс. пар нуклеотидов и 37 генов. В процессе митохондриального стресса и повреждения клеток, мтДНК выходит в цитоплазму или внеклеточную среду, запуская каскад провоспалительных эффектов, опосредованных активацией так называемых, толл-подобных рецепторов (toll-like receptors, TLR) различных иммунокомпетентных клеток (B-лимфоциты, дендритные клетки и т.д.). Далее посредством нижележащих сигнальных путей повышается секреция классических провоспалительных цитокинов, включая интерлейкин-6 (ИЛ-6), фактор некроза опухоли альфа (ФНОα) и интерферонов, происходит активация инфламмасом классов NLRP3 (инфламмасома, в состав которой входит NOD-подобный рецептор, содержащий пириновый домен PYR с протеином 3-го типа (NOD-like receptor family pyrin domain containing protein-3 ), NLRC4 (инфламмасома, в состав которой входит нуклеотидсвязывающий домен с насыщенными лейцином повторами нуклеотидных последовательностей, содержащий CARD-домен с белком 4 типа, Nucleotide-binding domain and Leucine-rich Repeat containing Card Domain-containing 4), и AIM2 (инфламмасома с белком 2 типа, отсутствующим при меланоме, "absent in melanoma 2" [12].

Другим специфическим для митохондрий DAMP являются N-формил-пептиды (NFP), представляющие собой соединения, крайне близкие по структуре с бактериальными пептидами, которые в норме присутствуют только в пределах митохондрии. При митохондриальной дисфункции NFP выходят за пределы данной органеллы и взаимодействуют с формил-пептидными рецепторами (FPR) нейтрофилов и моноцитов, провоцируя продукцию провоспалительных интерлейкинов (ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-8), дополнительно повышая продукцию активных форм кислорода [13].

В качестве митохондриальных DAMP рассматривают АТФ, который во внеклеточной среде запускает процессы воспаления и окислительного стресса, а также сукцинат, который взаимодействует с системой индуцируемых гипоксией факторов (например, HIF-1α), повышает секрецию провоспалительных цитокинов и усиливает активацию T-лимфоцитов дендритными клетками [1][14]. В качестве митохондриального DAMP на экспериментальных моделях исследуется кардиолипин, который в норме регулирует трансмембранный транспорт в митохондриях, а при повреждении митохондрий поступает во внеклеточную среду, где оказывает плейотропное действие, как противовоспалительное (посредством ингибирования связывания липополисахарида с TLR4), так и провоспалительное (посредством активации инфламмасомы NLRP3) [15]. Митохондриальный транскрипционный фактор A (TFAM), в норме регулирующий транскрипцию митохондриального генома, при митохондриальной дисфункции действует как DAMP, совместно с NFP, активируя моноциты, повышая секрецию ИЛ-8, моноцитарного хемотрактантного белка-1 (MCP-1) и усиливая хроническое воспаление [16].

Согласно современным представлениям, митохондриальная дисфункция может оказывать влияние на программируемую клеточную гибель, которая является важным патогенетическим звеном многих ХНИЗ. Так, митохондрия является регулятором одного из типов программируемой клеточной гибели — апоптоза, а изменение проницаемости митохондриальной мембраны под действием проапоптотических белков семейства Bcl-2 является его ключевым триггером. Другой механизм апоптоза связан с высвобождением из митохондрии цитохрома С, который в цитоплазме образует олигомерный комплекс — апоптосому, включающий проферменты и метаболиты и активирующий процесс апоптоза посредством нижележащей эффекторной цепи ферментов каспаз (включая каспазу-3, каспазу-9), реализующих апоптотическую программу [17]. Митохондриальная дисфункция также оказывает влияние на механизмы другого типа программируемой клеточной гибели — пироптоза (тип программируемой клеточной гибели, связанный с воспалением), в частности, инфламммасома-опосредованного механизма. Было показано, что высвобождение митохондриальных DAMP приводит к активации инфламмасомы NLRP3 — белкового комплекса, оказывающего провоспалительное действие посредством процессинга процитокинов с образованием зрелых/активных цитокинов ИЛ-18 и ИЛ-1β под действием фермента каспаза-1, а также участвующего в активации белков гасдерминов, реализующих пироптотическое разрушение клеточной стенки [18]. Циркулирующие митохондриальные DAMP также могут приводить к активации полиморфноядерных нейтрофилов, которые реализуют нейтрофил-опосредованное повреждение органов при образовании нейтрофильных ловушек (NETs), инициируя другой тип программируемой клеточной гибели, ассоциированный с разрушением нейтрофилов и формированием нейтрофильных ловушек — нетоз [19][20].

Следующим механизмом, ассоциированным с митохондриальной дисфункцией, является недостаточность сиртуинов (Sirtuins или Silent Information Regulator 2 proteins) — белков, контролирующих функции митохондрий. Снижение уровня митохондриального сиртуина 3 (SIRT3) при стрессовом воздействии приводит к нарушению регуляции апоптотических процессов в тканях сердца [21].

Говоря о митохондриальной дисфункции и клеточном стрессе, стоить отметить сложный циклический характер взаимосвязи данных патологических процессов. Так, митохондриальная дисфункция, с одной стороны, сама по себе является одним из результатов клеточного стресса, а, с другой — становится фактором, индуцирующим клеточный стресс и способствующим прогрессированию поражения клеток [22]. В этом аспекте отдельного внимания заслуживает белок теплового шока с молекулярной массой 60 кДа, который рассматривается как митохондриальный белок теплового шока, в норме выполняющий протективные функции. При этом в патологических условиях, например, при нейровоспалительных заболеваниях, данный белок запускает провоспалительные сигнальные каскады [23].

Таким образом, митохондриальная дисфункция является связующим звеном между различными молекулярными механизмами, а высокая иммуногенная активность компонентов разрушающихся митохондрий запускает дополнительные порочные круги, приводя к усилению патофизиологических процессов, лежащих в основе развития ХНИЗ. В этом ключе циркулирующие биомаркеры могут рассматриваться как некие метаболические, энзиматические и структурные сигнатуры данных процессов, которые могут быть использованы для их неинвазивной оценки.

В зависимости от лабораторной методологии можно достаточно условно выделить несколько направлений исследования циркулирующих биохимических маркеров митохондриальной дисфункции: (I) изучение специфических белков, связанных с дисфункцией митохондрий (II) изучение активности ферментов, опосредующих митохондриальный метаболизм (III) исследование метаболитов, участвующих в митохондриальных путях обмена веществ.

(I) Изучение специфических белков, связанных с дисфункцией митохондрий. К этой группе маркеров можно отнести структурные митохондриальные белки, которые попадают в кровоток при разрушении митохондрий и клеток, а также белки, экспрессия и секреция которых, может изменяться при митохондриальной дисфункции. Данные белки могут быть исследованы с использованием как достаточно сложных и дорогостоящих методов протеомного анализа (микрочипы, масс-спектрометрия), так и с помощью более доступных иммунохимических технологий (классический иммуноферментный анализ, иммунохемилюминесцентный анализ, мультиплексный иммуноферментный анализ и т.д.), что открывает возможности для использованиях этих аналитов как потенциальных биомаркеров, применимых для внедрения в клиническую практику.

Фактор дифференцировки роста 15 (GDF-15) представляет собой белок семейства трансформирующих факторов роста, который был охарактеризован как маркер митохондриальной дисфункции [10]. Высокий уровень GDF-15 является фактором, ассоциированным с развитием старческой астении у больных с кардиометаболическими заболеваниями [24]. У больных с неклапанной фибрилляцией предсердий данный фактор рассматривается как интегральный биомаркер состояний, ассоциированных с возрастными изменениями, включая наличие и тяжесть артериальной гипертонии, хронической сердечной недостаточности, повышенным уровнем С-реактивного белка, а также признаками диастолической дисфункции левого желудочка [25]. Также в ряде исследований показаны возможности использования GDF-15 в комплексе с другими маркерами митохондриальной дисфункции при широком спектре нозологий, от неврологических до кардиометаболических [26-28].

Фактор роста фибробластов-21 (FGF-21) — фактор роста, который регулирует метаболизм липидов и углеводов, представляет собой фактор стрессового ответа, экспрессия которого повышена как при первичных, так и при вторичных митохондриальных заболеваниях и который рассматривается как маркер, непосредственно ассоциированный с митохондриальной дисфункцией [29][30]. Повышение циркулирующих концентраций данного фактора описано при таких заболеваниях, как ишемическая болезнь сердца, сахарный диабет 2 типа, ожирение, неалкогольная жировая болезнь печени, почечная недостаточность [26][31]. Гиперсекреция FGF-21 в комплексе с гиперсекрецией другого маркера митохондриальной дисфункции GFD-15 была описана как фактор неблагоприятного прогноза у пожилых пациентов [26].

1-α-коактиватор γ-рецептора, активируемого пролифераторами пероксисом (PGC1α) — представляет собой белок, регулирующий энергетический обмен и процессы образования митохондрий в мышечной и жировой ткани, а также в печени. У пациентов с гемодинамическими нарушениями вследствие аневризмы восходящего отдела аорты и аортального стеноза было показано, что определение концентрации PGC1α в комплексе с измерением уровня лактата позволяют выделить различные стадии дисфункции митохондрий и, тем самым, оценить выраженность нарушений энергетического обмена [32]. Также есть данные о возможности использования PGC1α как маркера митохондриального повреждения у пациентов с нейродегенеративными заболеваниями, включая болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона [33].

Цитохром С представляет собой гемопротеин митохондриальной мембраны и является маркером непосредственного повреждения митохондрий. В литературе описан ряд исследований его сывороточных концентраций, применительно к сердечно-сосудистым заболеваниям [32][34]. Показано, что повышенные уровни цитохрома С в сыворотке крови при инфаркте миокарда не обладают диагностической ценностью, однако являются независимым предиктором летального исхода на госпитальном этапе [34].

HIF-1α — биологический маркер тканевой гипоксии, который активируется при гипоксических условиях, переключая клетки на гликолиз (анаэробный путь), и подавляет митохондриальное дыхание [35]. В кардиологии HIF-1 изучался применительно к острому коронарному синдрому, при котором этот транскрипционный фактор в комплексе с эндотелиальным фактором роста сосудов (VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor) были факторами риска рецидива у пациентов после проведения чрескожных коронарных вмешательств, а также при сердечной недостаточности и ожирении. Была выявлена связь секреции HIF-1α с эхоКГ показателями ремоделирования миокарда [36][37]. Гиперсекреция HIF-1α в комплексе с гиперсекрецией маркеров митохондриальной дисфункции FGF-21 и GDF-15 была описана также при неврологических нарушениях у детей [38].

(II) Изучение активности ферментов, опосредующих митохондриальный метаболизм. В данную группу биомаркеров входят ферменты, так или иначе связанные с катаболическими процессами, при этом наиболее информативным является не измерение их концентрации, а оценка активности, например, кинетическими методами. Анализ ряда ферментов, связанных с митохондриальной дисфункцией, проводится в рамках рутинной клинико-лабораторной практики и доступен в любой биохимической лаборатории. При этом важно отметить, что использование данных маркеров для оценки митохондриальной дисфункции целесообразно в комплексе с более специфическими соединениями [10]. Так, активность креатинфосфокиназы в сыворотке крови может повышаться при повреждении скелетных мышц и миокарда, однако ее повышение в комплексе с повышением уровня лактата может свидетельствовать о наличии митохондриальной дисфункции [39][40]. Другой достаточно хорошо изученный фермент γ-глутамилтранспептидаза рассматривается как маркер окислительного стресса и митохондриальной дисфункции, в т.ч. у больных с метаболически ассоциированной жировой болезнью печени, при этом было показано, что γ-глутамилтранспептидаза наряду с GDF-15, щелочной фосфатазой и декорином, является фактором, независимо ассоциированным с фиброзом печени [41].

(III) Исследование метаболитов, участвующих в митохондриальных путях обмена веществ включает достаточно большой перечень соединений, среди которых часть достаточно хороши изучена, и их анализ доступен в практическом здравоохранении (например, анализ сывороточного уровня лактата), а часть практически не исследованы, т.к. их анализ требует достаточно сложных и дорогостоящих лабораторных технологий, включая высокоэффективную жидкостную хроматографию или масс-спектрометрию. Наиболее доступными метаболическими маркерами первичных митохондриальных заболеваний являются лактат — продукт анаэробных компенсаторных путей, накапливающийся при нарушении окислительного фосфорилирования, а также его предшественник пируват. Данные метаболиты исследовались как в циркулирующей крови, так и в спинномозговой жидкости у больных с митохондриальными заболеваниями, поражающими центральную нервную систему. Также приводятся данные, что лактат и пируват могут служить в качестве перспективных биомаркеров вторичных митохондриопатий, при различных нейродегенеративных заболеваниях [10][42]. Другой доступный для определения колориметрическими методами метаболит, связанный с митохондриальной дисфункцией — малоновый диальдегид, относят также к классическим биомаркерам окислительного стресса, но его клиническое применение ограничено главным образом метаболическим синдромом [43]. Неоптерин — маркер активации клеточного иммунитета, продукт распада гуанозинтрифосфата, концентрация которого в цереброспинальной жидкости связана с состоянием митохондрий [44]. Согласно данным метаанализа, повышенные уровни неоптерина в сыворотке крови также обладают определенным прогностическим потенциалом при ишемическом инсульте [45]. Помимо этого, высокие сывороточные уровни неоптерина являются фактором риска неблагоприятного течения сердечной недостаточности [46]. В контексте митохондриальной дисфункции интерес представляет 3-метилглутаконовая кислота, (промежуточный продукт метаболизма аминокислоты лейцина) избыточное накопление которой указывает как на наследственные метаболические расстройства (например, 3-метилглутаконовая ацидурия), при которых имеет место нарушение работы митохондрий, так и на наличие вторичных миопатий, кардиомиопатий и нейропатий [47]. В то же время, для количественного определения 3-метилглутаконовой кислоты применяется газовая хроматография и масс-спектрометрия, что ограничивает возможности для широкого внедрения исследований данного показателя в клиническую практику.

Более интересным с практический точки зрения является исследование аммиака, который участвует в непосредственном повреждении митохондриальных мембран и является триггером программируемой клеточной гибели клеток печени. Накопление этого соединения к синдрому гипераммониемии, который может быть диагностирован методами классической биохимии (кинетические методы на автоматических анализаторах, спектрофотометрах, методы сухой химии). Единственным серьезным ограничением для исследования циркулирующего в крови аммиака является необходимость проводить исследование в течение 1-2 ч после взятия крови, что требует выполнения анализа в том же лечебном учреждении, где проводится обследование и лечение пациента и исключает сложную логистику с доставкой образца в централизованные лаборатории. Исследования метаболитов, ассоциированных с митохондриями включают также такие соединения как 8-изопростан, O-тирозин, 3-хлортирозин, 3-нитротирозин, продукты окисления белков (AOPP), гидроксигуанозин и 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозин (8-OHdG), а также эндогенные антиоксиданты: глутатион, цистеин, мочевая кислота, убихинол — изменения концентраций которых в периферическом кровотоке ассоциированы с первичными и вторичными митохондриальными заболевания [10].

Помимо описанных биохимических методов изучения циркулирующих маркеров митохондриальной дисфункции существует ряд биофизических и молекулярно-генетических подходов, включая исследование мембранного потенциала митохондрий циркулирующих лейкоцитов методом цитофлуориметрии [48], исследований циркулирующих микро-РНК [49] и мтДНК [50]. Большой пласт исследований составляют работы по изучению клеточного метаболизма с использованием клеточных технологий (включая технологии "Seahorse"), которые позволяют одновременно измерять два главных энергетических пути клетки: окислительное фосфорилирование (митохондриальное дыхание) и гликолиз [51], однако анализ этих методов требует отдельного детального рассмотрения.

Заключение

Научные и клинические исследования маркеров, связанных с дисфункцией митохондрий и ассоциированных с ними метаболических путей, по данным литературы включают многочисленные показатели, такие как FGF-21, GDF-15, неоптерин, лактат, пируват и аммиак, которые количественно измеряются и служат в качестве диагностических инструментов не только при первичных митохондриальных заболеваниях наследственной природы, но и при вторичных митохондриальных нарушениях, таких как ожирение, сердечная недостаточность, атеросклероз, артериальная гипертония, хроническая дыхательная недостаточность, а также при нейродегенеративных и других возраст-ассоциированных заболеваниях. Исследование циркулирующих биомаркеров может быть использовано в диагностике митохондриальной дисфункции, прямой или косвенной оценки ее роли в патогенезе конкретных заболеваний, а также служить в качестве факторов прогноза исходов заболевания и мониторинга эффективности проводимого лечения.

Изучение большинства митохондриальных биомаркеров находится на этапе экспериментальных исследований, однако значение митохондриальной дисфункции в патогенезе большинства ХНИЗ отражает высокий потенциал для внедрения данных аналитов в клиническую практику. Исследование циркулирующих маркеров может стать полезным инструментом в оценке митохондриального здоровья и способствовать развитию митохондриальной медицины, направленной на поддержание здорового долголетия на субклеточном и молекулярном уровне.

Благодарности. Авторы выражают искреннюю благодарность д.б.н., профессору Метельской В. А. за ценные замечания и плодотворную дискуссию при обсуждении работы.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.