Пенетрантность генотипа ε2/ε2 и патогенных вариантов гена APOE, ассоциированных с семейной дисбеталипопротеинемией

Введение

Неполная пенетрантность вариантов генома — это явление, при котором у части носителей патогенных вариантов фенотип не проявляется [1]. Несмотря на то, что изначально большинство патогенных вариантов были описаны как высокопенетрантные на основании данных небольших клинических когорт, создание популяционных баз данных позволило продемонстрировать неполную, и, зачастую, даже низкую пенетрантность для моногенных заболеваний [2][3]. Оценку пенетрантности проводят на основе данных семейный исследований, исследований случай-контроль и популяционных выборок с использованием различных статистических методов, включая байесовский анализ. Преимуществом байесовского подхода является возможность оценки пенетрантности в выборках с ограниченным числом наблюдений, что особенно актуально при анализе редких генетических вариантов [4].

Семейная дисбеталипопротеинемия (СДЛП), III тип по классификации Фредриксона — распространенное (0,2-0,7% [5-7]), в т.ч. в России (0,67%: 1/150 чел. [8]), генетически обусловленное нарушение липидного обмена [9]. СДЛП вносит существенный вклад в структуру наследственных гипертриглицеридемий [10] и относится к наиболее атерогенным дислипидемиям вследствие накопления в плазме крови обогащенных холестерином ремнантных (остаточных) липопротеинов [11-13].

Основной генетической причиной СДЛП является наличие генотипа ε2/ε2 APOE, обусловливающего аутосомно-рецессивную форму заболевания [14][15]. Вместе с тем часть случаев СДЛП связана с патогенными вариантами APOE, наследуемыми по аутосомно-доминантному типу [16-18]. В ранее проведенном исследовании генетических данных образцов из лаборатории "Банк биологического материала" (далее — биобанк) ФГБУ "Национальный медицинский исследовательский центр терапии и профилактической медицины" Минздрава России (ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России) было описано 24 редких варианта APOE. Среди вариантов, ассоциированных с СДЛП, наиболее часто встречались вероятно-патогенный вариант p.Arg154Cys и вариант p.Gly145Asp, связь которого с СДЛП, вероятно, реализуется при его сцеплении с аллелем ε2 [16].

Наличие генетических причин, ассоциированных с СДЛП, само по себе недостаточно для развития заболевания. Необходимы дополнительные метаболические и генетические факторы, включая высокую метаболическую нагрузку [6][19][20], полигенную гипертриглицеридемию [19][21][22] и наличие дополнительных вариантов в генах, кодирующих белки, участвующие в липидном обмене [19][23]. В связи с этим СДЛП у носителей генотипа ε2/ε2 или патогенных вариантов APOE характеризуется неполной пенетрантностью [24]. В отличие от генотипа ε2/ε2, для которого в литературе описана относительно низкая пенетрантность (~10-18%) [9], количественная оценка пенетрантности вариантов APOE, ассоциированных с аутосомно-доминантной СДЛП, ранее не проводилась. Представление о них как о высокопенетрантных основано преимущественно на данных сегрегационного анализа и их выявлении у лиц с СДЛП в клинических когортах. Кроме этого, пенетрантность генетических причин СДЛП, в т.ч. с использованием байесовского метода, на российской выборке пациентов ранее не изучалась. Также не оценивались различия в возрасте выявления фенотипических проявлений СДЛП в зависимости от генетической причины заболевания.

Цель исследования — оценить пенетрантность генотипа ε2/ε2 и патогенных вариантов гена APOE, ассоциированных с СДЛП.

Материал и методы

Выборка. Одноцентровое одномоментное исследование носителей генетических причин СДЛП является продолжением ранее опубликованных работ, посвященных изучению данного заболевания [8][11][16], и выполнено на основе анализа генотипированных образцов биобанка ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России, полученных в рамках научных проектов и доступных по состоянию на январь 2025г (n=4860). В исследование включали лиц, имеющих генотип ε2/ε2 APOE либо вариант APOE, ассоциированный с развитием СДЛП [16]. Из исследовательской выборки исключали участников популяционной выборки Ивановской области, сформированной в рамках исследования ЭССЕ-РФ (Эпидемиология сердечно-сосудистых заболеваний в регионах Российской Федерации), поскольку их данные ранее использовали для оценки популяционной частоты генотипа ε2/ε2 [8] и патогенных вариантов APOE [16]. Это позволило избежать повторного использования одних и тех же данных при оценке пенетрантности байесовским методом.

В результате в исследование был включен 51 пациент (47,1% мужчин; медиана возраста — 49 лет). Большинство (76,5%) включенных пациентов и ранее наблюдались в Липидной клинике ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России в связи с гипертриглицеридемией.

Носителями генетических причин, ассоциированных с СДЛП, считали пациентов с генотипом ε2/ε2 (образуемого сочетанием p.Cys130Arg — альтернативная гомозигота и p.Arg176Cys — референсная гомозигота) [8][9], а также пациентов с патогенными или вероятно патогенными вариантами APOE [16]. Под фенотипическим проявлением генетической причины, ассоциированной с СДЛП, рассматривали уровень триглицеридов (ТГ) ≥1,5 ммоль/л [8][25].

Клинические и биохимические данные. Использовали клинические данные, ранее собранные нами в рамках серии работ, посвященных СДЛП. В анализе отражали параметры, характеризующие метаболический профиль носителей генетических причин СДЛП, включая индекс массы тела и наличие нарушений углеводного обмена. Нарушения углеводного обмена определяли на основании установленных клинических диагнозов сахарного диабета (независимо от типа), нарушения толерантности к глюкозе или нарушения гликемии натощак.

Для каждого пациента определяли уровень ТГ (ммоль/л) с помощью системы Abbott Architect C-8000 (Abbott Laboratories, США). В настоящем исследовании представлены уровни ТГ до начала приема гиполипидемической терапии. Для пациентов, регулярно принимающих гиполипидемическую терапию (n=9: высокоинтенсивная терапия статином), значения ТГ до лечения оценивали с использованием коэффициента коррекции, учитывающего влияние соответствующего вида терапии, согласно ранее представленным данным [26].

Генетический анализ. Генетическое тестирование проводили ранее в рамках научных проектов ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России.

Сбор и хранение биообразцов выполняли согласно регламенту биобанкирования в биобанке ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России. Выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из цельной крови проводили с использованием набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Германия). Для определения концентрации выделенной ДНК использовали флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, США). Подготовка библиотек для секвенирования ДНК была проведена с помощью набора SeqCap EZ Prime Choice Library (Roche, Швейцария).

Секвенирование следующего поколения проводили с использованием таргетной панели [16] на платформе NextSeq 550 (Illumina, США). Генотипы APOE (транскрипт NM_000041.4) определяли на основании двух вариантов: с. 526С>T (p.Arg176Cys; rs7412) и c.388T>C (p.Cys130Arg; rs429358) [8][9]. В исследование включали лиц с генотипом ε2/ε2, а также носителей вариантов APOE, ранее описанных как патогенные при СДЛП, в соответствии с критериями ACMG/AMP 2015 [16][27][28].

Подтверждение генотипа ε2/ε2 и выявленных вариантов APOE выполняли с помощью секвенирования по Сенгеру на Applied Biosystem 3500 Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific, США) согласно протоколу производителя.

Этические аспекты. Исследование выполнено в соответствии с принципами Хельсинкской Декларации и было одобрено Независимым этическим комитетом ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России (протокол № 07-05/20 от 26.11.2020). В текущем исследовании были использованы данные лиц из генотипированной когорты биобанка ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России. Письменное информированное согласие было получено от каждого пациента.

Статистический анализ и оценка пенетрантности. Статистический анализ проводили с использованием программной среды R версии 4.1.2 (R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия). Сравнение категориальных переменных между группами носителей генетических причин СДЛП (генотипа ε2/ε2 APOE и патогенных вариантов APOE) выполняли с помощью двустороннего точного теста Фишера. Для сравнения непрерывных переменных между указанными группами, а также возраста выявления фенотипического проявления в зависимости от пола и генетической причины СДЛП использовали U-критерий Манна-Уитни. Возрастом выявления фенотипического проявления считали возраст пациента при первом обращении в ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Оценку пенетрантности проводили с использованием байесовской формулы, позволяющей оценить вероятность наличия заболевания у носителей его генетической причины на основании данных о популяционной распространенности заболевания, доле носителей анализируемой генетической причины среди пациентов с данным заболеванием и частоты анализируемого варианта в условно здоровой популяции [4]:

в которой P(D|V) — пенетрантность анализируемой генетической причины СДЛП, т.е. вероятность развития СДЛП у ее носителей, P(D) — популяционная распространенность СДЛП, P(V|D) — отношение числа носителей анализируемой генетической причины с фенотипическим проявлением к общему числу носителей генетических причин СДЛП с фенотипическим проявлением в исследовательской когорте, P(V) — популяционная частота анализируемой генетической причины СДЛП.

Анализ пенетрантности проводили для генотипа ε2/ε2 APOE и двух наиболее часто встречавшихся в когорте вариантов APOE — p.Arg154Cys и p.Gly145Asp. В качестве оценки распространенности СДЛП использовали нижнюю границу, представленную в исследовании Pallazola VA, et al. [5] — 0,2%, полученную на основании критериев ультрацентрифугирования липопротеинов (уровень ТГ= 150-1000 мг/дл, и отношение холестерина липопротеинов очень низкой плотности к ТГ ≥0,3). Частоты генотипа ε2/ε2 (0,8%), а также вариантов p.Arg154Cys (0,16%) и p.Gly145Asp (0,05%) в российской популяции были получены из ранее опубликованных данных Blokhina AV, et al. [8][16].

Результаты

В исследование был включен 51 пациент, из которых 35 (68,6%) являлись носителями генотипа ε2/ε2 APOE. Клиническая характеристика включенных пациентов представлена в таблице 1.

Пациенты были среднего возраста (медиана 49 лет). Большинство из них (39 человек, 76,5%) имели избыточную массу тела или ожирение. Повышение уровня ТГ было умеренным — медиана 4,44 ммоль/л. Экстремальная гипертриглицеридемия (ТГ ≥10,0 ммоль/л) выявлена у 11 (21,6%) пациентов. У носителей вариантов APOE уровень ТГ был выше по сравнению с носителями генотипа ε2/ε2 APOE (таблица 1).

Среди включенных в исследование пациентов фенотипическое проявление генетической причины, ассоциированной с СДЛП, выявлено у 40 (78,4%). В частности, среди носителей генотипа ε2/ε2 оно выявлено у 26 (74,3%) пациентов, тогда как среди носителей вариантов APOE — у 14 (87,5%). Распределение выявленных генетических причин СДЛП в зависимости от наличия фенотипического проявления (уровня ТГ ≥1,5 ммоль/л) представлено на рисунке 1.

Фенотипическое проявление выявляли в более раннем возрасте у мужчин (n=18) по сравнению с женщинами (n=22): 48 [ 40; 51] vs 55 [ 50; 62] лет, соответственно (p=0,017). По возрасту выявления фенотипического проявления носители генотипа ε2/ε2 (n=26) и патогенных вариантов APOE (n=14) между собой не различались: 51 [ 44; 62] и 53 [ 43; 56] года, соответственно (p=0,932).

В рамках работы была проведена оценка пенетрантности генотипа ε2/ε2 APOE и двух наиболее часто встречавшихся в когорте вариантов APOE — p.Arg154Cys и p.Gly145Asp. На их долю приходилось 87,6% всех выявленных вариантов APOE (43,8% для каждого варианта). Полученная оценка пенетрантности, рассчитанная байесовским методом, составила 16,3% для носителей генотипа ε2/ε2, 21,9% для носителей p.Arg154Cys и 50,0% для носителей p.Gly145Asp (таблица 2). В исследуемой клинической когорте среди носителей p.Arg154Cys фенотипическое проявление имели 7 из 7 (100,0%) пациентов, а среди носителей p.Gly145Asp — 5 из 7 (71,4%) пациентов (рисунок 1).

Обсуждение

В представленном исследовании проведен анализ пациентов-носителей генотипа ε2/ε2 APOE или патогенных вариантов APOE, ассоциированных с СДЛП, с целью оценки пенетрантности данных генетических причин. Наиболее распространенной генетической причиной СДЛП в исследовательской выборке являлся генотип ε2/ε2 APOE, выявленный у 68,6% пациентов. Среди пациентов с фенотипическим проявлением данный генотип встречался в 65,0% случаев, тогда как на долю вариантов APOE приходилось 35,0% случаев. Полученные результаты отличаются от классических представлений о генетической структуре СДЛП, согласно которым вклад редких вариантов APOE, ассоциированных с аутосомно-доминантным наследованием, предполагали на уровне 10% [18], тогда как 90% случаев связывали с генотипом ε2/ε2 APOE, наследуемым по аутосомно-рецессивному типу [14][29]. Расширение применения технологий секвенирования следующего поколения и совершенствование подходов к интерпретации генетических данных позволяют выявлять более широкий спектр вариантов APOE, ассоциированных с СДЛП [16][17][30], вклад которых в общую структуру СДЛП, вероятно, ранее был недооценен.

В исследовательской выборке выявлена высокая частота фенотипического проявления среди носителей генотипа ε2/ε2 APOE (74,3%), что сопоставимо с ранее опубликованными данными, полученным в популяционной выборке Ивановской области, отобранной из исследования ЭССЕ-РФ, где данный показатель составил 78,6% [8]. Полученные результаты отражают долю носителей генотипа ε2/ε2 APOE с уровнем ТГ ≥1,5 ммоль/л — критерием фенотипического проявления, ранее валидированным на российской выборке для выявления носителей данного генотипа [8]. Аналогично высокая частота фенотипического проявления наблюдалась среди носителей вариантов p.Arg154Cys (100%) и p.Gly145Asp (71,4%).

Высокая доля носителей генетических причин СДЛП с фенотипическим проявлением в исследовательской выборке, вероятно, связана с особенностями ее формирования. Генотип ε2/ε2 и патогенные варианты APOE выявляли среди ранее генотипированных образцов биобанка ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России. При этом большинство включенных участников ранее наблюдались в Липидной клинике ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России в связи с подозрением на наследственные гипертриглицеридемии. Это могло привести к обогащению выборки лицами с повышенным уровнем ТГ (медиана ТГ — 4,44 ммоль/л) и сопутствующими факторами, влияющими на выраженность гипертриглицеридемии и проявление СДЛП.

Высокая доля лиц с фенотипическим проявлением могла быть также обусловлена возрастным составом выборки. Медиана возраста всех носителей генотипа ε2/ε2 составила 48 лет, а носителей вариантов APOE — 51 год. При этом возраст выявления фенотипического проявления, отражавший возраст обращения в ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России, составил 51 и 53 года, соответственно. Таким образом, часть носителей генетических причин СДЛП уже достигла возраста, сопоставимого с возрастом выявления фенотипического проявления, что могло способствовать его высокой частоте в настоящем исследовании. Сопоставимая медиана возраста носителей генотипа ε2/ε2 APOE (50 лет) была отмечена в выборке ЭССЕ-Иваново [8]. Помимо возраста, на наличие фенотипических проявлений у носителей генетических причин могут влиять дополнительные генетические факторы [19][21-23], которые в рамках настоящей работы не оценивались. Среди метаболических факторов, влияющих на проявление заболевания [6][19][20], в исследуемой выборке 76,5% лиц имели избыточную массу тела или ожирение.

Более раннее выявление фенотипического проявления у мужчин по сравнению с женщинами: медиана возраста 48 и 55 лет, соответственно, может отражать влияние половых различий в липидном обмене, модифицирующие пенетрантность заболевания [30]. Известно, что у мужчин среднего возраста, как правило, уровень ТГ выше, чем у женщин [31], что может способствовать более раннему фенотипическому проявлению у носителей генетических причин СДЛП. Отсутствие различий в возрасте выявления фенотипического проявления между носителями генотипа ε2/ε2 и патогенных вариантов APOE следует интерпретировать с учетом особенностей формирования исследовательской выборки: возраст выявления фенотипического проявления соответствовал возрасту обращения пациента в ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России и не отражал момент возникновения нарушений липидного обмена. Кроме того, ограниченное число носителей патогенных вариантов APOE с фенотипическим проявлением снижает возможность выявления потенциальных различий между генетическими группами. Нельзя также исключить, что отдельные патогенные варианты APOE могут различаться по влиянию на выраженность фенотипических проявлений.

В рамках работы была проведена оценка пенетрантности генотипа ε2/ε2 и вариантов APOE с использованием байесовского подхода. Полученная пенетрантность генотипа ε2/ε2 составила 16,3%, что соответствует литературным данным, согласно которым СДЛП развивается у ~10-18% носителей данного генотипа [9]. Для варианта p.Gly145Asp выявлена неполная пенетрантность — 50,0%. Следует учитывать, что данный вариант может встречаться в сцепленном виде с другим вариантом APOE: c.[434G>A; с. 526С>T] (p.[Gly145Asp; p.Arg176Cys]), формируя редкий генотип ε2/ε1, пенетрантность которого может быть выше [8][17]. Вариант p.Arg154Cys ранее был описан как вероятно патогенный для СДЛП [16] и для него также наблюдалась неполная пенетрантность (21,9%). Полученные данные демонстрируют, что как генотип ε2/ε2, так и варианты APOE, связанные с аутосомно-доминантной СДЛП, характеризуются неполной пенетрантностью. При этом пенетрантность вариантов APOE, ассоциированных с аутосомно-доминантной формой СДЛП, была оценена выше, чем пенетрантность генотипа ε2/ε2.

Ограничения исследования. Исследовательская выборка была сформирована на основе генотипированных образцов биобанка ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России и включала преимущественно лиц, ранее обследованных в Липидной клинике в связи с гипертриглицеридемией. Это могло привести к обогащению выборки лицами с фенотипическим проявлением.

В работе не использовали ультрацентрифугирование плазмы крови или электрофорез липопротеинов для подтверждения характерного для СДЛП профиля липопротеинов. Ранее разработанные биохимические алгоритмы диагностики СДЛП, включающие оценку уровня аполипопротеина B, в настоящее время не могут быть применены к российской выборке пациентов и требуют коррекции, что было показано в нашем предыдущем исследовании [8]. В связи с этим в настоящей работе под фенотипическим проявлением генетической причины, ассоциированной с СДЛП, рассматривали уровень ТГ ≥1,5 ммоль/л. Такой подход может ограничивать полноту характеристики фенотипа СДЛП. Вместе с тем, в ранее опубликованном исследовании применяли схожий подход к определению СДЛП, основанный на наличии генотипа ε2/ε2 и повышенных уровнях общего холестерина (≥5,2 ммоль/л) и ТГ (≥2,0 ммоль/л) [6].

В байесовской модели использовали оценку распространенности СДЛП, полученную в другой популяции на основании диагностических критериев, определяемых по результатам ультрацентрифугирования. Использование ранее полученной нами оценки распространенности аутосомно-рецессивной СДЛП в Ивановской области [8] не представлялось возможным, поскольку критерии определения заболевания включали наличие генотипа ε2/ε2 APOE, что не позволяло независимо оценить пенетрантность данного генетического фактора и могло привести к ее завышению. В связи с отсутствием валидированных диагностических критериев СДЛП для российской популяции, основанных на биохимических показателях, применение опубликованных данных о распространенности, определенной по результатам ультрацентрифугирования, в настоящем исследовании представляется обоснованным. Кроме того, точная распространенность аутосомно-доминантной СДЛП остается неизвестной.

Пенетрантность вариантов p.Gly145Asp и p.Arg154Cys следует интерпретировать с учетом ограниченного числа их носителей, что обусловливает широкие доверительные интервалы оценки и является возможным при анализе редких генетических вариантов.

Заключение

Впервые на российской выборке пациентов проведена оценка пенетрантности генетических причин СДЛП с использованием байесовского метода. Показано, что генетические причины СДЛП характеризуются неполной пенетрантностью: 16,3% для генотипа ε2/ε2 APOE, связанного с аутосомно-рецессивной формой заболевания, и 21,9-50,0% для вариантов APOE, связанных с аутосомно-доминантной СДЛП.

Возраст выявления фенотипического проявления у носителей генетических причин СДЛП был ниже у мужчин, чем у женщин, но не различался между носителями генотипа ε2/ε2 и патогенных вариантов APOE.

Отношения и деятельность. Работа выполнена в рамках государственного задания "Разработка модели предсказания пенетрантности и экспрессивности причинных вариантов наследственных моногенных заболеваний сердечно-сосудистой системы".