Роль межгенных взаимодействий между генами цитокинов и Toll-подобных рецепторов в этиологии врожденных пороков сердца

Введение

Современные исследования этиологии и патогенеза врожденных пороков сердца (ВПС) показали неоспоримую значимость молекулярно-генетических особенностей, лежащих в основе данной патологии [1]. В то же время, на сегодняшний день существуют проблемы изучения патогенетических механизмов развития ВПС, которые связаны с большой разнородностью нозологических форм ВПС и аномалий сердечно-сосудистой системы (ССС).

Есть незначительная группа ВПС с семейной историей, которые относят к моногенным заболеваниям с наследуемыми миссенс-мутациями, передающимися из поколения в поколение. Литературные данные демонстрируют, что подобного вида мутации кодируют молекулы, преимущественно регулирующие экспрессию функциональных генов [2][3]. Другая группа ВПС, отдельно учитываемая в мировых регистрах, связана с хромосомными заболеваниями, такими как синдром Дауна, синдром Шершевского-Тернера и др. Современные исследования показывают, что существует группа ВПС, при которых обнаруживаются хромосомные транслокации с мало проявляемыми фенотипическими признаками. Удельный вес этих пороков сердца во всей структуре ВПС не >10% [4]. Кроме того, стоит отметить, что >80% из всех ВПС приходится на спорадические (без семейной истории) [5].

Современные Omics технологии (исследования протеома, экзома, транскриптома и метаболома) при ВПС показали значимые отклонения в регуляторных сетях, детерминирующих пролиферацию клеток, формирующих зачатки ССС у эмбриона. Получены схожие данные и для комбинированных ВПС, таких как тетрада Фалло. В некоторых работах показана ассоциативная связь с ВПС генов цитокинов и мембранных рецепторов межклеточных контактов [6].

Изучение генетических, социальных, семейных, экологических факторов, ассоциированных с ВПС, продемонстрировало, что они являются преимущественно мультифакторным заболеванием. Период формирования ССС приходится на 3-8 нед. гестации, на протяжении которого идет активное "приживление" эмбриона, регулируемое межклеточными контактами и цитокиновой регуляцией. Соответственно, конституционально обусловленные отклонения в данной цепи событий могут оказывать влияние на эмбриогенез ССС [7][8].

Исходя из этого, была поставлена цель исследования — изучить ассоциативные связи взаимодействий между генами цитокинов и Toll-подобных рецепторов (TLR, Toll-like receptors) со спорадическими ВПС у детей.

Материал и методы

Настоящее исследование проведено на базе Научно-исследовательского института комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний (НИИ КПССЗ) и одобрено локально этическим комитетом. Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0419-2022-0001.

В исследование включено 188 детей (103 девочки и 85 мальчиков) со спорадическими (без семейной истории) ВПС (основная группа). Все матери детей подписывали информированное согласие на участие в генетическом исследовании. Диагноз ВПС у детей был подтвержден с помощью эхокардиографии и других инструментальных методов. У всех детей с ВПС было исключено наличие хромосомных заболеваний. Структура ВПС представлена в таблице 1.

Доминирующей патологией у детей основной группы были септальные пороки сердца без семейной истории (таблица 1).

Контрольная группа сформирована из 103 условно здоровых детей (52 девочки и 51 мальчик). Группа была сформирована на клинической базе ФГБОУ ВО Кемеровского государственного медицинского университета Минздрава России. У всех матерей контрольной группы получено информированное согласие на участие в генетическом исследовании. Средний возраст детей основной группы был 3,9±2,3 лет, контрольной — 4,7±1,8 лет, что было сопоставимо.

Кровь брали из локтевой вены в пробирку, содержащую калиевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (К₃ЭДТА). Выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) проводили стандартной фенол-хлороформной экстракцией согласно протоколу. Концентрацию выделенной ДНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop ND-2000C (Thermo, USA).

Генотипирование проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на амплификаторе "Viia7" (Applied Biosystems, США) с использованием Taqman зондов. Для исследования выбрано пять генов цитокинов и их рецепторов: IL6 (rs1800796, rs2069827), IL6R (rs2228145, rs2229238), IL8 (rs4073), IL10 (rs1800871, rs1800896, rs1800872), TNFa (rs1800629, rs361525, rs1799964) и четыре гена сигнальных TLR (TLR: TLR1 (rs5743611, rs5743551), TLR2 (rs5743708, rs3804099), TLR4 (rs4986791, rs4986790), TLR6 (rs3775073, rs5743810). Для отбора полиморфизмов использовались базы данных dbSNP, SNPinfo, SNPnexus.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакетов программ SNPstats и MDR (http://sourceforge.net/projects/mdr).

Анализ соблюдения закона Харди-Вайнберга проводили при помощи программы SNPstats. Анализ межгенных взаимодействий осуществляли при помощи метода MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) [9][10]. MDR-анализ выполнен для всей основной группы спорадических ВПС (n=188), а также для отдельных нозологических групп: септальные спорадические — дефект межжелудочковой перегородки/дефект межпредсердной перегородки (ДМЖП/ДМПП) (n=98), пороки клапанов сердца (n=17) и по отдельным нозологиям, представленным в таблице 1. Контрольная группа для всех сравнений была представлена условно-здоровыми детьми (n=103). Различия считались статистически значимыми при p<0,05 [11].

Результаты

Распределение всех частот генотипов цитокинов и TLR в основной и контрольной группах соответствовало распределению Харди-Вайнберга.

При помощи метода MDR проведена оценка SNP*SNP взаимодействия полиморфных вариантов генов цитокинов и TLR со спорадическими ВПС в целом (без разделения на группы). Характер межгенных взаимодействий (синергизм, антагонизм и аддитивные взаимодействия) представлен на рисунке 1.

Умеренный синергизм имел место между полиморфным вариантом гена IL8 (rs4073) с одной стороны, и полиморфизмами TLR2 (rs3804099) и TLR6 (rs5743810), с другой (рисунок 1), причем сами по себе взаимодействия TLR2 (rs3804099) с TLR6 (rs5743810) носили выраженный антагонистический характер.

Проведенный анализ показал доминирование антагонистических взаимодействий как отдельно между генами семейств цитокинов и TLR, так и между этими группами (TLR-цитокины). Наиболее значимым первичным антагонизмом обладали: IL10 (rs1800871) с TLR4 (rs4986791); IL6(rs1800796) с TLR4 (rs4986790); IL6 (rs2069827) с IL6R (rs2228145). Все эти три кластера также находились между собой в умеренном антагонизме.

Для более детального понимания вклада межгенных взаимодействий в формирование спорадических ВПС проведена оценка ассоциаций отдельно для цитокинов и их рецепторов и TLR. Получены значимые взаимосвязи с ВПС только для генов цитокинов и их рецепторов. Характер межгенных взаимодействий (синергизм, антагонизм и аддитивные взаимодействия), а также доля их вклада в общую энтропию спорадических ВПС представлены на рисунке 2. В результате проведенного анализа выявлено большое количество взаимодействий, однако наибольший долевой вклад в общую энтропию вносили варианты TNFa rs361525 (1,33%), IL6R rs2229238 (1,61%), IL6 rs2069827 (1,09%), IL10 rs1800896 (1,15%).

Анализ межгенных взаимодействий для отдельных нозологических форм ВПС, представленных в таблице 1, выявил значимые взаимосвязи ген-генных взаимодействий только со спорадическими септальными ВПС (ДМЖП/ДМПП). Характер межгенных взаимодействий (синергизм, антагонизм и аддитивные взаимодействия), а также доля вклада в общую энтропию при спорадических септальных ВПС (ДМЖП/ДМПП), представлены на рисунке 3.

Умеренный первичный синергизм имел место между полиморфным вариантом гена TLR2 (rs3804099) c TLR6 (rs5743810). Этот кластер, в свою очередь, имел умеренный синергизм с TLR1 (rs5743611) и далее — c IL8 (rs4073). Четыре полиморфных варианта генов цитокинов и TLR образуют единый синергетический блок, совместно усиливающих формирование спорадических септальных (ДМЖП/ДМПП) ВПС (рисунок 3).

Взаимодействия TLR1 (rs5743551) с IL6R (rs2228145) носили выраженный первичный антагонистический характер. Умеренный первичный антагонизм при спорадических септальных ВПС (ДМЖП/ДМПП) выявлен для IL10 (rs1800871) c IL10 (rs1800872). Этот первичный кластер имел антагонизм с дополнительными кластерами TNF (rs1799964) и TLR2 (rs5743708), а также третичные и четвертичные антагонистические связи с TLR4 (rs4986790) и с TLR4 (rs4986791), соответственно.

Детальное исследование с помощью метода MDR вклада межгенных взаимодействий в формирование спорадических септальных ВПС (ДМЖП/ДМПП) показало наличие значимых взаимосвязей только для генов цитокинов и их рецепторов. Характер межгенных взаимодействий (синергизм, антагонизм и аддитивные взаимодействия), а также доля вклада в общую энтропию при спорадических септальных ВПС (ДМЖП/ДМПП), представлены на рисунке 4.

В результате анализа выявлено большое количество взаимодействий, однако наибольший долевой вклад в общую энтропию при септальных спорадических ВПС (ДМЖП/ДМПП) вносили полиморфные локусы IL10 rs1800896 (2,57%), IL6 rs2069827 (2,42%), TNFa rs361525 (1,44%), IL6Rrs2229238 (1,67%), TNFa rs1800629 (1,14%), TNFa rs1799964 (1,03%) (рисунок 4).

Обсуждение

Гипотеза настоящего исследования состояла в том, что возникновение спорадических ВПС связано с конституциональной предрасположенностью к нарушениям регуляции процессов пролиферации и дифференцировки клеток, формирующих зачатки ССС у эмбриона. Высказано предположение, что важными молекулярными элементами регуляторных сетей являются цитокины и их рецепторы, а также TPR, как важные мембранные сигнальные системы. Плейотропность цитокинов и TPR реализуется, в т.ч. в эффектах регуляции деления и дифференцировки клеток и инициировании клеточной гибели. Особый путь, ассоциированный с провоспалительными цитокинами, представлен пироптозом — запрограммированной гибелью клетки за счет активации рецепторов апоптоза цитокиновыми лигандами [12]. Метод MDR позволил, преимущественно качественно, оценить вклад синергетических, антагонистических и аддитивных взаимодействий между генами цитокинов и TPR. Важные результаты получены для спорадических ВПС в целом и для спорадических септальных ВПС (ДМЖП/ДМПП). Отсутствие значимых ассоциаций для отдельных нозологий и групп ВПС связано с ограничением размеров выборок и требует дальнейшего изучения.

Выявлено, что важным геном для синергетических взаимодействий, которые ассоциированы со спорадическими ВПС в целом и со спорадическими септальными ВПС (ДМЖП/ДМПП), является IL8 (rs4073). Молекула IL (интерлейкин)-8 является основным хемокином для нейтрофильных лейкоцитов и лимфоцитов. Синергетическое влияние данного гена может быть связано с конституциональным повышением или понижением (гомозиготность по дикому или мутантному аллелю, соответственно) синтеза или нарушением функциональной активности этого цитокина [13][14]. Для IL8rs4073 получено большое количество ассоциаций с инфекционной, аутовоспалительной и аутоиммунной патологией [13].

Проведенное исследование также показало, что IL8 (rs4073) связан синергизмом с кластером TLR2 (rs3804099) и TLR6 (rs5743810) как при спорадических ВПС в целом, так и при спорадических септальных ВПС (ДМЖП/ДМПП). Различия между этими двумя группами ВПС заключаются в том, что в данном кластере гены взаимодействовали прямо противоположно: при спорадических ВПС с выраженным антагонизмом, а при септальных ВПС с умеренным синергизмом. Это указывает на значимость данных полиморфных вариантов в детерминировании ВПС. Достаточно большое количество исследований показало значимость полиморфного участка rs5743810 гена TLR6 в формировании провоспалительных, инфекционных, онкологических заболеваний [15-17].

Показано, что TLR6 образует гетеродимеры c TLR2, через которые воспринимаются сигналы от различных лигандов, в т.ч. от молекул регулирующих пролиферацию клеток. Формирование гетородимеров активирует внутриклеточные каскады, передающие сигналы на ядерный фактор транскрипции каппа B (NF-κB). В отношении эмбриобласта нет данных об особенностях экспрессии TLR. В то же время, исследования транскриптома эндометрия у женщин с повторяющимися репродуктивными потерями после экстракорпорального оплодотворения, показали доминирование регуляторных сетей с активацией IL-6, интерферона-γ, IL-17A, IL-23A, интерферонов-α и β, IL-2, TLR4 и TLR6, а также ряда хемокинов и внутриклеточных мессенджеров (STAT3, RAG1) [18][19].

Обнаружено, что именно в кластер, определяющий формирование ВПС, входит полиморфный вариант гена TLR2 (rs3804099). Данный полиморфный участок кодирует синонимичную мутацию (Asn199=), при которой замена Цитозина на Тимин не приводит к изменению аминокислоты в 199 положении. Данный тип мутации может влиять на сплайсинг РНК, на ее стабильность, а также на фолдинг белковый молекулы. Соответственно, через данные эффекты может снижаться как экспрессия самого рецептора, так и его функциональная активность [20][21].

Еще один значимый синергизм входил в кластер, ассоциированный со спорадическими септальными ВПС (ДМЖП/ДМПП). Это полиморфный участок гена TLR1 (rs5743611), который детерминирует миссенс-мутацию (Arg80Thr). Как показано выше, сигнальные TPR эффективно функционируют как гетеродимеры, в частности TLR2 с TLR1 или TLR6 с TLR1. Именно неэффективное образование данных структур может быть основой патогенеза заболеваний ССС, в т.ч. септальных ВПС [21][22].

Для септальных ВПС (ДМЖП/ДМПП) получено отдельное ген-генное синергетическое взаимодействие (IL8 rs4073 с IL6R rs2228145). Полиморфный участок гена IL6R rs2228145 детерминирует миссенс-мутацию (Asp358Ala), которая может изменять функциональную активность рецептора. Для данного полиморфного варианта показана ассоциация с патологической кальцификацией биологического протеза митрального клапана [23].

Для септальных ВПС получен большой антагонистический кластер, в который входят гены, кодирующие молекулы IL-10, фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α), рецептора к IL-6, а также TPR (TLR1, TLR2, TLR4). TLR2 rs5743708 является фактором риска формирования хронических инфекционных заболеваний, вызванных Borrelia burgdorferi и Mycobacterium tuberculosis [24]. Доказано, что мутантный TLR2 не способен эффективно образовывать гетеродимеры с TLR4 и активировать внутриклеточные каскады до NF-κB.

В первичный антагонистический кластер входят два полиморфных участка гена IL10 (rs180871 и rs180872), которые находятся в промоторе и влияют на экспрессию самого гена. В то же время, указанные полиморфизмы имели незначительные ассоциации с атопическими заболеваниями у детей с нарушениями функционирования Т-регуляторных лимфоцитов и Т-хелперов 1 и 2 типов [25]. Молекула IL-10 играет значительную роль в иммуносупресссии и в ограничении пролиферативной активности клеток [26]. Возможно, первичный антагонизм двух участков гена, определяющих экспрессию IL10, является проявлением конкуренции за ограничение пролиферативного потенциала. Это особо актуально в связи с тем, что в антагонистическом кластере находится и полиморфный участок гена TNFa rs1799964, который также детерминирует активацию гена. Повышенный синтез самой молекулы TNF-α дополнительно к ограничению пролиферации может запускать пироптоз [27].

Заключение

Таким образом, спорадические ВПС, в целом, и септальные ВПС (ДМЖП/ДМПП), в частности, формируются на схожих межгенных ассоциациях, которые детерминируют нарушение регуляции пролиферации и дифференцировки клеток, формирующих зачатки ССС у эмбриона.

Вероятно, одним из молекулярных механизмов формирования спорадических септальных ВПС может быть неэффективность внутриклеточных сигнальных путей до NF-κB из-за первичного дефицита мембранных гетеродимеров TLR1/TLR6, TLR2/TLR6 и TLR1/TLR2, однако данное предположение требует проведения дополнительных исследований.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.