Ассоциация уровней микроРНК плазмы крови с различной выраженностью коллатерального кровообращения при хронической окклюзии коронарной артерии у пациентов с ишемической болезнью сердца: пилотное исследование

Введение

Коронарное коллатеральное кровообращение (КК) формируется за зоной хронической окклюзии коронарной артерии (ХОКА), играя жизненно важную роль в поддержании функционирования сердца, предотвращении некроза миокарда, уменьшении частоты желудочковых аневризм, обеспечении времени для реперфузионной терапии и в целом увеличении выживаемости пациентов [1]. Хорошо развитое КК и ангиогенез имеют решающее значение для улучшения симптомов и прогноза пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) и при других неблагоприятных сердечных событиях [2][3].

Несмотря на наличие таких показателей коронарного ангиогенеза, как хроническое воспаление и факторы роста эндотелия сосудов, все еще не хватает биомаркеров, позволяющих различать пациентов с плохим или хорошим КК [4][5]. Предыдущие исследования показали различия в экспрессии генов на уровне матричной (мРНК) рибонуклеиновой кислоты (РНК) у пациентов с ИБС с плохо и хорошо развитым КК [6]. Недавно в качестве потенциального биомаркера для различных заболеваний были предложены микроРНК [7].

МикроРНК — это класс малых некодирующих высококонсервативных одноцепочечных РНК длиной ~22 нуклеотидов, которые подавляют экспрессию генов-мишеней либо за счет деградации мРНК, либо за счет ингибирования трансляции в зависимости от степени комплементарности микроРНК и мРНК [8].

Изменения в уровне экспрессии микроРНК играют фундаментальную роль в физиологических и в патологических состояниях, а стабильные микроРНК в биологических жидкостях (в т.ч. плазме или сыворотке крови) могут стать новыми биомаркерами, пригодными для клинической диагностики [7]. Но несмотря на то, что недавние исследования циркулирующих микроРНК в крови свидетельствуют об их возможном потенциале в качестве новых неинвазивных биомаркеров многих заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), одного биомаркера может быть недостаточно для диагностики ИБС, поскольку профиль экспрессии циркулирующих микроРНК может меняться в зависимости от стадии ССЗ пациента, его развития и методов лечения. Вероятно, комбинация различных микроРНК может оказаться полезной в диагностике и прогнозировании ССЗ [9].

МикроРНК играют важную роль в регуляции различных аспектов сосудистой биологии, включая ангиогенез [2][3][5], однако информация об экспрессии микроРНК у пациентов с ИБС с различной степенью формирования коллатеральных артерий крайне ограничена.

На основе анализа литературных источников, в рамках настоящего пилотного исследования были выбраны 5 микроРНК, описанных в исследованиях пациентов с ХОКА с плохим или хорошим КК: hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-155-5p [2][3][5][10][11], а также 4 микроРНК (hsa-miR-210-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-451a), для которых ранее была показана ассоциация с ИБС [7][12] и участие в ангиогенезе [13-18]. Однако работ по изучению ассоциаций этих микроРНК с КК, насколько известно из доступной нам литературы, пока не было опубликовано.

Целью настоящего исследования было изучить ассоциации 9 микроРНК плазмы крови и выраженности КК при наличии ХОКА у пациентов с ИБС.

Материал и методы

Выборка. В исследование были включены 43 пациента, проходившие обследование в ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России (г. Москва), которые были разделены на 3 группы: пациенты с ИБС и ХОКА крупной эпикардиальной артерии (диаметр >2,5 мм) с хорошим (n=13) и плохим (n=10) КК на основе классификации Rentrop [19][20], и контрольная группа, куда входили пациенты без значимого стенозирования коронарных артерий (n=20).

Всем участникам исследования проводилась коронарная ангиография (ангиографическая установка General Electric, США). Исследование одобрено Независимым этическим комитетом ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России (протоколы № 05-05/15 от 09.06.2015, № 02-02/22 от 17.03.2022). Все участники дали письменное информированное согласие.

Критериями включения были: 1) для группы контроля — возраст >18 лет; предполагаемое наличие ИБС; отсутствие значимого стенозирования коронарных артерий (<50%); 2) для группы ХОКА с хорошим КК — возраст >18 лет; наличие клиники стенокардии; наличие известной ХОКА и планируемое чрескожное коронарное вмешательство; наличие ХОКА крупной эпикардиальной артерии (диаметр >2,5 мм) с развитием хорошего КК — 3 класс по классификации Rentrop; 3) для группы ХОКА с плохим КК — возраст >18 лет; наличие клиники стенокардии; наличие известной ХОКА и планируемое чрескожное коронарное вмешательство; наличие ХОКА крупной эпикардиальной артерии (диаметр >2,5 мм) с плохим КК — 0 класс по классификации Rentrop.

Критерии невключения: острый коронарный синдром (ОКС) за последние 6 мес.; хроническая инфекция, онкологическое заболевание в анамнезе, воспалительные заболевания, психические расстройства, беременность, отказ от подписания информированного согласия.

Выделение микроРНК. Кровь собирали в пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) и хранили при комнатной температуре не >1 ч до выделения плазмы. Далее кровь центрифугировали 15 мин при 1200 g при +4^о С, отбирали плазму и хранили при -70^о С в биобанке ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России (г. Москва) [21]. Образцы плазмы перед выделением РНК размораживали на льду и центрифугировали при 14000 g в течение 15 мин при +4^о С, после чего супернатант переносили в чистые пробирки, свободные от нуклеаз. Супернатант использовали для выделения тотальной РНК, включая микроРНК, с помощью miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (Qiagen, Германия) согласно протоколу производителя. Каждый образец РНК был разделен на аликвоты, хранящиеся при -70^о С до дальнейшего анализа. Время хранения плазмы до выделения микроРНК составило 2 [ 0,2; 25] мес.

Выбор микроРНК. В исследование были включены 9 микроРНК, ассоциированных с ИБС, и одна микроРНК для нормализации полученных данных (таблица 1).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени. Для анализа экспрессии микроРНК использовался метод количественной ПЦР в режиме реального времени (кПЦР), которая проводилась с помощью TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit, TaqMan Advanced miRNA assays, TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) на амплификаторе 7500 Fast Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) согласно протоколам производителя. Нормализацию данных кПЦР для каждой микроРНК проводили с использованием значения пороговых циклов Cq (cycle of quantification) для hsa-miR-16-5p [23]. Степень гемолиза образцов определяли по соотношению в Cq независимой от гемолиза hsa-miR-23a-3p и гемолиз-зависимой микроРНК hsa-miR-451a, содержащейся в эритроцитах [23][26]. Для каждого зонда в качестве отрицательного контроля была проведена ПЦР без матрицы.

Статистический анализ. Для анализа полученных данных применяли метод относительной количественной оценки 2^-ΔΔCq [27]. Определение значений пороговых циклов Cq проводили в одной технической повторности для каждой мишени микроРНК в отдельном образце. Если значение Cq анализируемой микроРНК не было получено в течение 40 циклов ПЦР, ее Cq считали равным 40. Статистический анализ проведен в среде R 4.2. Непрерывные параметры представлены в виде медианы и интерквартильного размаха: Me [Q25; Q75]; дискретные — при помощи абсолютных и относительных частот. Вычисление главных компонент проводилось для центрированных и нормированных данных. Различия между двумя независимыми выборками для уровней экспрессии оценивали критерием Стьюдента, для остальных непрерывных параметров — критерием Манна-Уитни, для дискретных — точным критерием Фишера. Различия между тремя независимыми выборками для непрерывных параметров оценивали критерием Краскела-Уоллиса, для дискретных — точным критерием Фишера. Поправка на множественные сравнения на уровне различных микроРНК не проводилась, т.к. уровни экспрессии микроРНК ассоциированы между собой — две главные компоненты объясняют 78% дисперсии. Поправку на множественные сравнения для 4-х сравнений подвыборок между собой провели методом Холма-Бонферрони. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

В исследование были включены пациенты, составившие 3 группы: с ХОКА с хорошим (n=13) и плохим (n=10) КК, а также группа контроля, включающая пациентов без значимого стенозирования коронарных артерий (n=20). Клиническая характеристика выборки представлена в таблице 2. Размер выборки — 43 участника, доля мужчин в выборке — 65%, медиана возраста — 63 года.

Оценка гемолиза образцов плазмы проводилась с помощью кПЦР для всех образцов, включенных в исследование, по разнице в пороговом числе циклов двух микроРНК (hsa-miR-23a-3p и hsa-miR-451a). Согласно исследованию, использовавшему те же микроРНК того же производителя для оценки гемолиза, образцы с ΔCq (hsa-miR-23a-3p и hsa-miR-451a) >14 должны были бы быть исключены из анализа из-за возможного влияния гемолиза на уровни микроРНК в плазме [23]. В результате проведенного анализа было показано, что все образцы плазмы имели значение ΔCq ниже порогового значения и находились в диапазоне от 5,3 до 10,4.

hsa-miR-210-5p была обнаружена только в 26% образцов (n=11) и поэтому исключена из дальнейшего анализа. По частоте выявления hsa-miR-210-5p группы не различалась (p=0,153). Анализ главных компонент на основе 9 микроРНК свидетельствует об однородности полученных данных (рисунок 1).

Статистически значимых различий в уровне экспрессии исследуемых микроРНК между группами ХОКА с хорошим и плохим КК, а также между группой ХОКА с плохим КК и группой контроля выявлено не было. Возможно, это вызвано "промежуточным" положением группы с плохим КК и, как следствие, недостаточным размером эффекта. Поэтому в дальнейшем анализе группы с ХОКА
были объединены. Анализ экспрессии 8 микро-РНК между объединенной группой пациентов с ХОКА и группой контроля, а также между груп-
пой ХОКА с хорошим КК и группой контроля представлен в таблице 3. Достоверные различия в уровнях экспрессии 5 микроРНК (hsa-miR-126-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-451a) были выявлены между объединенной группой случая и группой контроля и 7 микроРНК (hsa-miR-126-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-451a) между группой ХОКА с хорошим КК и группой контроля. Ни в одной из групп сравнения не было выявлено достоверных различий в уровне экспрессии микроРНК hsa-miR-503-5p. Направление изменения уровня экспрессии 6 микроРНК (hsa-miR-126-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-23a-3p), по которым имелись достоверные различия, было в сторону уменьшения экспрессии, для hsa-miR-451a — в сторону увеличения.

На рисунке 2 представлены относительные уровни изучаемых микроРНК в плазме крови представителей исследуемых групп.

Помимо анализа экспрессии микроРНК был проведен анализ ассоциаций с другими клиническими показателями, такими как хроническая сердечная недостаточность, фибрилляция предсердий, постинфарктный кардиосклероз. Значимых ассоциаций выявлено не было.

Обсуждение

В рамках проведенного исследования были выявлены достоверные различия в уровне экспрессии 5 микроРНК между объединенной группой пациентов с ХОКА и группой контроля, а также 7 микроРНК между группой пациентов с ХОКА с хорошим КК и группой контроля. Отсутствие различий между группой с ХОКА с плохим КК и группой контроля может объясняться небольшим размером реального эффекта. Для его детекции понадобится группа большего размера, чем в текущем исследовании. Небольшой размер выборки и список анализируемых микроРНК, как и отсутствие валидации на другой независимой выборке являются ограничениями данного исследования.

Для 6 микроРНК (hsa-miR-126-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-23a-3p) наблюдалось снижение экспрессии, для одной микроРНК hsa-miR-451a — повышение в группе пациентов с хорошим КК по сравнению с группой контроля (таблица 3). Эти данные носят противоречивый характер, подтверждая [3][11] либо не подтверждая [2][3][5][22] данные предыдущих исследований на пациентах с ХОКА. В большинстве случаев полученные различия могут быть объяснены разными методиками категоризации КК, выделения и определения уровней микроРНК, а также с различными формами изучаемых микроРНК.

Для 4 микроРНК ранее были показаны ассоциации уровня экспрессии со степенью развития коллатеральных артерий у пациентов с ХОКА (hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-155-5p), но для 3 микроРНК (hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-451a), таких публикаций нет. В настоящей работе у пациентов с ХОКА по сравнению с лицами без значимого стенозирования коронарных артерий была выявлена сниженная экспрессия для 6 микроРНК и повышенная для одной микроРНК.

Несмотря на клиническую важность изучения новых путей и инструментов для профилактики и лечения ИБС, а также растущее количество исследований микроРНК, полученные на сегодняшний день доказательства все еще недостаточны для того, чтобы сделать однозначные выводы об использовании изученных в настоящей работе микроРНК в клинической практике. В большинстве исследований по данной теме отсутствует стандартизация в выборе контрольной выборки, времени отбора проб, источника циркулирующих микроРНК, протокола выделения, внутреннего и эндогенного контроля, методов количественного определения микроРНК, и параметров нормализации микроРНК [9][28][29]. Кроме того, большое влияние на статистическую мощность и обобщаемость полученных результатов оказывают небольшие размеры выборок и отсутствие валидации на другой независимой выборке, а также различия в исходных характеристиках когорт, влияющих на уровень экспрессии микроРНК, таких как, возраст, пол, сопутствующие заболевания, фармакологическая терапия [9][28]. Это дополнительно подтверждается тем фактом, что одна и та же микроРНК оказывает разное действие по данным разных исследований [9][28]. Таким образом, только более крупные многоцентровые исследования, основанные на различных популяциях пациентов и с использованием стандартизированных процедур обработки образцов и выделения РНК, дадут нам информацию о том, будут ли микроРНК успешными в качестве биомаркеров ИБС [9].

hsa-miR-146a-5p. МикроРНК miR-146a участвует в регуляции развития различных воспалительных заболеваний, включая атеросклероз [30, 31]. Хотя сообщалось о повышенном уровне экспрессии miR-146a у пациентов с ИБС [32-34], атеросклерозом [35][36], ОКС [37], ряд исследований подтверждают снижение уровня экспрессии miR-146a при более тяжелых формах атеросклероза, включая коронарный атеросклероз, связанный с плохим КК [5], ОКС по сравнению со стабильной ИБС [38] и мультифокальный атеросклероз [39].

В работе Wang J, et al. [5] было показано, что микроРНК hsa-miR-146a-5p в плазме может быть потенциальным биомаркером плохого КК у пациентов с ИБС [5]. Было выявлено, что уровни экспрессии hsa-miR-146a-5p в плазме были значительно ниже в группе с плохим КК (n=44) и значительно выше в группе с хорошим КК (n=34) по сравнению с таковым в контрольной группе, включающей здоровых участников без ИБС (n=34) [5]. Несмотря на похожий дизайн исследования, эти данные не согласуются с нашими результатами, в которых сниженная экспрессия этой микроРНК была выявлена как в общей группе ХОКА, так и в группе с ХОКА с хорошим КК, а достоверных различий в группе с ХОКА с плохим КК выявлено не было.

hsa-miR-126-5p. Одной из ключевых микроРНК, регулирующих ангиогенез, является miR-126 [40], играющая важную роль в неоваскуляризации и стабилизации кровеносных сосудов [40]. В ряде исследований было показано, что уровень экспрессии miR-126 значительно снижен у пациентов с ИБС [41-43], однако в других работах была продемонстрирована повышенная экспрессия miR-126 у пациентов с ИБС [44][45].

Экспрессия hsa-miR-126-3p в плазме была выше в группе пациентов с плохим КК (n=20) по сравнению с группой с хорошим КК (n=18) [3]. Был показан статистически значимо повышенный уровень miR-126 плазмы у пациентов с недостаточным развитием коллатеральной сети (n=27), по сравнению с пациентами с высокой пропускной способностью коронарных коллатеральных артерий (n=14), а также повышенный уровень экспрессии miR126 у пациентов с ХОКА по сравнению со здоровыми людьми (n=19) [2]. В другом исследовании уровень miR-126 в плазме был значительно ниже у пациентов с ИБС (n=120), чем у здоровых контролей (n=30), а также значительно выше в группе с хорошим КК (n=64), чем в группе с плохим КК (n=56) [11]. В настоящем исследовании экспрессия hsa-miR-126-5p у пациентов с ХОКА по сравнению со здоровыми людьми была снижена.

hsa-miR-15b-5p. miR-15b-5p является ключевым регулятором артериогенеза и ангиогенеза [3]. Согласно данным литературы, уровень экспрессии miR-15b-5p у пациентов с ИБС снижен [46][47].

В одном из исследований было показано, что уровень циркулирующей hsa-miR-15b-5p существенно снижен у пациентов с ИБС с хорошим КК и подходит для различия пациентов с хорошо и плохо развитым КК [3]. Более высокая экспрессия hsa-miR-15b-5p наблюдалась в плазме пациентов с плохим КК (n=20) по сравнению с пациентами с хорошим КК (n=18), в то же время экспрессия hsa-miR-15b-5p в плазме как при хорошем, так и при плохом КК была значимо снижена по сравнению с таковой у здоровых людей из контрольной группы (n=18) [3]. Результаты, полученные в этом исследовании, несмотря на разную методологию определения уровня экспрессии изучаемой микроРНК, согласуются с данными нашего исследованием, где также была выявлена сниженная экспрессия hsa-miR-15b-5p в группе пациентов с ХОКА по сравнению с группой здоровых пациентов.

hsa-miR-155-5p. miR-155 выполняет множество функций, включая роль в дифференцировке гемопоэтических клеток, формировании иммунитета, ремоделировании сосудов и регуляции путей передачи воспалительных сигналов [48]. В исследованиях на пациентах с ИБС была выявлена сниженная экспрессия miR-155 по сравнению со здоровыми [42][49][50].

Уровень miR-155 в плазме был в 11,5 и 1,8 раза выше у пациентов с плохим КК (n=44) и хорошим КК (n=34), соответственно, по сравнению с контрольной группой (n=34) [22]. Уровни miR-155 в группе с плохим КК значимо отличались от таковых в группе контроля и у пациентов с хорошим КК. Однако по уровню miR-155 в плазме группы хорошего КК и контроля существенно не различались [22]. Эти результаты отличаются от полученных в нашем исследовании, где экспрессия hsa-miR-155-5p была снижена у пациентов с ХОКА по сравнению со здоровыми людьми. Полученные различия могут объясняться разными методиками категоризации КК, выявления микроРНК и различными формами изучаемой микроРНК.

hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-451a. В настоящем исследовании впервые показана сниженная экспрессия hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-21-5p и повышенная hsa-miR-451a у пациентов с ХОКА по сравнению с лицами без значимого стенозирования коронарных артерий. Согласно ранее опубликованным данным, сниженная экспрессия miR-23a была выявлена у пациентов с ИБС по сравнению со здоровыми [12]. В образцах плазмы крови пациентов с ИБС сообщалось как о повышенных [12][34][44], так и о сниженных [51] уровнях циркулирующей miR-21. Повышенный уровень miR-451 был выявлен в плазме пациентов c ИБС и с нестабильной стенокардией по сравнению с людьми с несердечной болью в груди [44].

Заключение

В рамках настоящего исследования у пациентов с ХОКА с хорошим КК была идентифицирована сниженная экспрессия 6-и циркулирующих микроРНК и повышенная для одной по сравнению с контрольной группой. Впервые было показано, что уровень 2 циркулирующих микро-
РНК (hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-21-5p) существенно снижен, а уровень hsa-miR-451a увеличен у пациентов с ИБС с хорошим КК. В данной работе не было выявлено циркулирующих микроРНК для различия пациентов с хорошо и плохо развитым КК.

Таким образом, поскольку возможность определять емкость коронарной коллатеральной артерии у пациентов без необходимости инвазивной катетеризации имеет большое клиническое значение, полученные результаты требуют дальнейшего исследования на более крупных когортах пациентов с ХОКА, а также изучения прогностической силы (клинической диагностической ценности) этих микроРНК у пациентов с ИБС.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.