Анализ инделов без сдвига рамки считывания в белках, ассоциированных с сердечно-сосудистыми заболеваниями

Введение

Термином "инделы" (англ. insertions and deletions) традиционно называют вставки (инсерции) и удаления (делеции) коротких участков генома, которые неизбежно происходят при репликации или репарации геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) [1]. Инделы являются наиболее распространенным после однонуклеотидных вариантов типом полиморфизма генома [2]. В экзоме (совокупности всех участков генома, кодирующих белки) эффект инделов определяется в первую очередь их длиной: если она не кратна трем, происходит сдвиг рамки считывания гена, что сопровождается появлением раннего стоп-кодона, укорачивает белок и приводит к его деградации. В большинстве случаев такие инделы вызывают полную или частичную потерю белка [3].

Предмет настоящего исследования составляют вставки или удаления участков экзонов с длиной, кратной трем нуклеотидам, что сохраняет рамку считывания гена и удаляет или добавляет несколько аминокислотных остатков в последовательность белка. Такие варианты генома (inframe indels, далее просто "инделы") представляют большой интерес ввиду широты их функциональных и фенотипических проявлений [4]. В базе ClinVar, которая содержит информацию о вариантах генома человека, в первую очередь в связи с моногенными заболеваниями, в марте 2024г было описано примерно по 3 тыс. патогенных и доброкачественных инделов и ~18 тыс. инделов с неизвестной или противоречивой клинической значимостью [5]. В качестве "классического" примера безусловно патогенного индела можно привести удаление единственного остатка фенилаланина ΔF508 в белке CFTR, являющееся наиболее частой причиной муковисцидоза [6]. В то же время, в последние годы в геномной базе gnomAD v.4.1.0 описано >300 тыс. инделов, подавляющее большинство из которых функционально и эволюционно нейтральны [2].

Функциональная роль инделов, таким образом, весьма разнообразна и аналогична таковой у несинонимичных вариантов (миссенсов). Однако, если последним в клинических рекомендациях по интерпретации данных секвенирования Американской коллегии медицинской генетики и геномики (American College of Medical Genetics, или ACMG) [7] отводится, как минимум, девять достаточно развернутых критериев для классификации их клинической значимости, то в случае инделов основные рекомендации сводятся к тому, что, с одной стороны, вероятность патогенности растет по мере увеличения эволюционной консервативности изменяемого участка белка, а также увеличения его длины, а с другой, короткие инделы в повторяющихся участках последовательности белка или в участках с низкой консервативностью (и, тем самым, предположительно без известной функции) будут патогенными с меньшей степенью вероятности. В отечественном "Руководстве по интерпретации данных, полученных методами массового параллельного секвенирования" [8], критерием патогенности предлагается считать уже сам факт расположения индела в неповторяющемся участке белка, без учета степени его консервативности.

Можно предложить несколько причин, почему инделы часто оказываются "в тени" миссенсов и остаются за рамками исследований [9-11]. Во-первых, это их меньшая распространенность: по данным UK Biobank (Биобанка Великобритании), экзом представителя европейской популяции содержит, в среднем, 115 инделов vs 9292 несинонимичных вариантов [12]. Во-вторых, для последних существуют методологии экспериментального анализа, в частности, с помощью глубокого мутационного сканирования (ГМС) [13], а также многочисленные вычислительные методы для предсказания эффекта [14]. Полученные этими методами результаты используются как дополнительные критерии при клинической интерпретации [7][8]. Возможность использовать ГМС для описания функционального эффекта инделов появилась совсем недавно [15]. Вычислительные методы для предсказания эффекта инделов не так многочисленны, как для миссенсов, однако в последние годы по мере развития методов глубокого обучения в этой области наблюдается определенный прогресс [16][17]. Так, на портале ProteinGym производится систематизация и единообразная оценка эффективности различных предсказательных методов как для миссенсов, так и для инделов¹. В-третьих, существуют определенные сложности при определении (коллинге) инделов по данным высокопроизводительного секвенирования, в результате чего различные методы могут по-разному определять инделы в одном и том же образце [9][18], а в базах данных может быть неполная информация об их частоте в популяциях [8]. Наконец, возможны определенные трудности при компактном, удобном и однозначном описании индела как изменения последовательности белка и соотнесения его с изменением геномной ДНК [19]. Как одно из следствий, различные вычислительные методы для предсказания или аннотации инделов требуют отдельной подготовки входных данных. Также затрудняется сравнение обнаруженного индела с описанными ранее в литературе или в базах данных. Отчасти эти трудности преодолеваются строгим соблюдением номенклатуры Human Genome Variation Society (HGVS) при описании вариантов последовательностей белков и ДНК [20].

Систематический поиск в базе данных PubMed термина "in-frame indels" или "inframe indels" дает 53 публикации, в части из которых описывается роль инделов в генах, ассоциированных, в частности, с раком молочной железы, эндометриальной карциномой, педиатрической хордомой и др. видах онкологических и нейродегенеративных заболеваний; а также с синдромами Нунан, Фанкони-Бикеля, семейной почечной глюкозурией, заболеваниями глаз, в т.ч. ретинальной дистрофией. При этом не удалось обнаружить какие-либо исследования, относящиеся к роли инделов в этиологии наиболее значимых и распространенных сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ).

Целью настоящего исследования было описание распространенности и локализации, а также патогенности и пенетрантности инделов без сдвига рамки считывания в клинически значимых генах, ассоциированных с ССЗ. Для этого были решены следующие две основные задачи: анализ клинико-генетической базы данных ClinVar, содержащей информацию о связи вариантов генома с моногенными заболеваниями, а также исследование >6800 секвенированных в ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России (далее — НМИЦ ТПМ) образцов из различных российских когорт [21-23].

Материал и методы

Для выбора группы генов, достоверно ассоциированных с ССЗ, использовался предложенный коллегией ACMG список генов, содержащих так называемые вторичные находки, т.е. патогенные или потенциально патогенные варианты, о наличии которых носителю предлагается сообщать вне зависимости от первоначальных причин прохождения генетического тестирования [24]. В нашей работе была использована предложенная совместно ACMG и консорциумом ClinGen современная версия списка 3.3, которая содержит 84 гена, ассоциированных с 85 заболеваниями преимущественно с доминантным типом наследования². В основном, это различные виды наследственных опухолевых синдромов или ССЗ; некоторые гены ассоциированы более чем с одним заболеванием. Было отобрано 42 гена, образующих 61 пары с 22 ССЗ, которые можно условно разбить на четыре группы: кардиомиопатии или миопатии; гиперхолестеринемия; аритмии; сосудистые нарушения (таблица 1). Для описания заболеваний также используются идентификаторы MONDO (Mondo Disease Ontology) [25].

В качестве источника патогенных и прочих вариантов в этих генах была использована база данных ClinVar (версия от 06/25), из нее извлекались пары "вариант-заболевание" с клинической значимостью в контексте данного заболевания (патогенный, доброкачественный и т.д.) и уникальным идентификатором RCVnnnnnn. Тем самым разрешаются потенциальные противоречия, когда один и тот же вариант классифицируется по-разному в связке с различными заболеваниями. Для описания вариантов без привязки к тому или иному заболеванию в ClinVar также используются идентификаторы VCVnnnnnn.

Для аннотации вариантов использовалась программа ENSEMBL VEP (Variant Effect Predictor), с помощью которой варианты картировались на репрезентативные и качественные транскрипты генов из набора MANE (Matched Annotation from NCBI and EBI) Select [26]. Тем самым однозначно фиксируются координаты индела в белке, что особенно существенно для альтернативно сплайсируемых генов. Интересующие нас в рамках данной работы инделы описываются в файлах аннотации как inframe_deletion (делеция), inframe_insertion (вставка), а также inframe_indel (крайне редкий случай одновременного удаления и вставки нескольких аминокислот).

С помощью информации из ENSEMBL была также выполнена разметка последовательностей белков на следующие участки: (1) консервативные фрагменты, соответствующие функциональным доменам, аннотированным в базе данных Pfam [27]; (2) участки низкой сложности, в которых возможны повторы аминокислот; (3) предсказанные в базе данных MobiDB [28] участки с неупорядоченной пространственной структурой. Два последних типа — участки низкой сложности и неупорядоченные участки структуры белка, как принято считать, наиболее терпимы к вставкам и удалениям аминокислот [4][29]. Для участков, представляющих собой домены Pfam, напротив, характерна эволюционная консервативность последовательности, обеспечивающая функциональность этих доменов. Пересечение координат индела с размеченным участком последовательности одного из описанных типов позволяет отнести его к этому типу и, тем самым, провести анализ локализации инделов различных классов клинической значимости.

В настоящем исследовании были также использованы результаты секвенирования образцов, собранных в Биобанке НМИЦ ТПМ (далее Биобанк) за все время его работы: пациентов и их родственников [21][22] и представителей популяционной выборки из исследования ЭССЕ-РФ (Эпидемиология сердечно-сосудистых заболеваний в регионах Российской Федерации) [30]. Протокол обработки результатов секвенирования подробно описан в работе [23]. Все исследованные образцы могут быть разбиты на четыре группы по принципу целевых участков секвенирования: три различных панели генов, содержащих 13, 34 и 35 генов из исходной группы 42 генов, и полные геномы. В общей сложности объем выборки составил 6837 человек. При анализе результатов секвенирования мы не рассматривали варианты в гене TTN ввиду его большой длины.

Сбор и хранение биоматериала осуществляли по регламенту биобанкирования в Биобанке [31]. Исследования были одобрены Независимым Этическим Комитетом НМИЦ ТПМ (номера протоколов 07-03/12 от 03.07.2012, 04-04/17 от 06.06.2017). От всех участников исследования было получено информированное согласие на их участие.

Результаты

Общая характеристика инделов по данным ClinVar

В отобранных 42 генах в базе ClinVar описано в общей сложности 43313 вариантов генома различной клинической значимости (таблица 2). Несинонимичные варианты (миссенсы) составляют из них ~ половину (49,7%), из которых, в свою очередь, 14,2% являются патогенными. В этих генах в ClinVar описано 525 инделов без сдвига рамки считывания, что составляет лишь 1,2% от общего числа вариантов, при этом 155 инделов классифицированы как патогенные, что соответствует 29,5% от общего числа вариантов данного типа (рисунок 1). Неизвестная или противоречивая значимость приписана 65,5% инделов, а доброкачественные составляют самую небольшую группу (5,0%). Поскольку среди инделов доля патогенных (29,5%) примерно вдвое больше, чем среди миссенсов (14,2%), отношение шансов (OR — odds ratio) быть патогенным для инделов составляет 2,52 (95% доверительный интервал (ДИ): 2,08-3,05, p=0) по сравнению с миссенсами, что может указывать на более высокую каузальность и/или пенетрантность вариантов первого типа.

В отобранных генах ССЗ на один патогенный индел в среднем приходится 19,8 патогенных миссенсов (=3064/155), что близко к соответствующему значению по всем генам в ClinVar (18,8). Группы ССЗ различаются по этому соотношению, которое составляет 47,1 в случае кардиомиопатий и миопатий, 34,9 для сосудистых заболеваний, а также 10,2 (гиперхолестеринемия) и 7,5 (аритмии). Таким образом, в первых двух случаях инделы, как каузальные варианты, наиболее редки, а в случае аритмий и гиперхолестеринемии, напротив, встречаются чаще.

Как можно было ожидать, гены различаются по общему числу описанных в ClinVar инделов: от 1-2 (например, CASQ2, TPM1) до 91 в гене LDLR (рисунок 1). Заметно различаются также распределения по типам клинической значимости: так, наибольшее число патогенных инделов (70 и 27, соответственно) содержат гены LDLR (MONDO:0007750, семейная гиперхолестеринемия 1 типа) и FBN1 (MONDO:0019625, семейная аневризма грудной аорты и расслоение аорты), что сочетается с полным отсутствием доброкачественных инделов в этих генах. Интересно, что в этих генах часть миссенсов является доброкачественной: 4,2 и 10,3%, соответственно. Интересным примером является ген SCN5A (MONDO:0015263, синдром Бругада), в котором среди 5 описанных инделов все классифицированы как патогенные.

При рассмотрении отдельно вставок и удалений без сдвига рамки считывания обращает на себя внимание то, что последние составляют большинство инделов: 382 из 525, что составляет 72,8%; при этом в 203 случаях из 328 удаляется один аминокислотный остаток. При этом вставки от 2 до 5 аминокислотных остатков (90 случаев из 143) более распространены, чем вставки единичной длины (53 случая). Распределение по типам клинической значимости в зависимости от длины инделов дано на рисунке 2. Видно, что доброкачественных вставок и удалений с длиной >5 аминокислотных остатков не наблюдается. OR быть патогенным среди удалений длиной >1 составило 1,57 (95% ДИ: 1,02-2,38, p=0,040) по сравнению с удалениями единичной длины. В случае вставок OR=1,42 (95% ДИ: 0,54-3,72), однако ввиду малого объема выборки в данном случае разница не является статистически значимой (p=0,47).

Локализация инделов в участках белков

Для выбранных 42 белков ССЗ в целом характерно достаточно высокое (63,3%) покрытие последовательностей фрагментами, соответствующими доменам Pfam. В базе белков UniProtKB в целом 53% остатков всех белков принадлежат фрагментам последовательности, аннотированным как тот или иной домен [32]; наблюдаемое увеличение этого значения в нашей небольшой выборке белков можно объяснить как ее размером, так и лучшей изученностью этих клинически важных белков. Участки низкой сложности и неупорядоченной структуры в белках ССЗ составляют 9,2 и 5,2%, соответственно.

На рисунке 3 показано распределение инделов различной клинической значимости по различным участкам белков. Видно, что патогенные инделы наиболее редко находятся в участках низкой сложности и неупорядоченной структуры (суммарно лишь 4,0%), при этом около четверти (24,1%) попадают в домены Pfam. Доброкачественные инделы, напротив, избегают доменов Pfam (4,8%), при этом почти четверть из них (23,8%) находится в участках низкой сложности. С учетом малой численности этой группы (21 индел) полученные результаты могут быть не вполне репрезентативными: так, во всей базе ClinVar в участках низкой сложности и неупорядоченной структуры находятся 52,1 и 43,4% всех 3064 доброкачественных удалений и вставок, при этом только 7,2% попадают в домены Pfam. Для инделов неизвестной клинической значимости характерна бóльшая представленность в участках низкой сложности и неупорядоченной структуры (14,1 и 12,6%) и близкая к патогенным доля в доменах Pfam (23,1%). В силу последнего обстоятельства локализация в домене Pfam, во всяком случае в исследованных белках ССЗ, не может являться надежным признаком для классификации индела как патогенного.

Инделы в российских выборках

В секвенированных выборках в 42 целевых генах было обнаружено в общей сложности 69,487 вариантов нуклеотидных последовательностей (таблица 2), только 60 из которых являются инделами без сдвига рамки считывания. Из них 22 индела классифицированы в ClinVar как доброкачественные, а также доброкачественные или неизвестной значимости (конфликтующие интерпретации значимости). Для некоторых из них характерны высокие частоты в популяции: например, 30,3% для удаления APOB:p. Leu12_Leu14del или 14,1% в случае вставки PCSK9:p. Leu22dup, что объясняет их высокую встречаемость, наблюдаемую в наших образцах.

С точки зрения связи с фенотипом наибольший интерес представляют 38 остальных обнаруженных в исследованных образцах инделов, среди которых четыре описаны в ClinVar как патогенные (один в гене TNNT2 и три в LDLR), 13 как инделы неизвестной значимости, а 21 вовсе отсутствуют в ClinVar. В таблице 3 приведены сведения о 12 инделах из числа этих 38, для которых по имеющимся клиническим данным можно было бы сделать вывод о наличии или отсутствии соответствующего диагноза. У 24 из 32 носителей мутантных аллелей генов с инделами ассоциации с клиническими проявлениями были подтверждены в результате медицинского обследования в НМИЦ ТПМ.

Большинство инделов наблюдается в 1-5 секвенированных образцах, за исключением удаления LDLR:p. Gly219del, обнаруженного у 9 участников исследования, у которых диагноз гиперхолестеринемия был подтвержден в 8 случаях, что соответствует значению пенетрантности 88,8%. Для трех других патогенных инделов (TNNT2:p. Lys220del — кардиомиопатия, LDLR:p. Asp224_Glu228del и LDLR:p. Leu571del — гиперхолестеринемия) характерна полная пенетрантность. Для двух инделов, охарактеризованных в ClinVar как варианты с неизвестной значимостью (APOB:p. Leu22dup и LDLR:p. Leu571del), также наблюдается полная пенетрантность; противоположный пример дает удаление PCSK9:p. Leu22_Leu23del, для которого диагноз не подтвердился.

Обсуждение

Инделы без сдвига рамки считывания — варианты генома, приводящие к удалению или вставке небольшого числа остатков в белке — представляют интерес в различных контекстах, в первую очередь с точки зрения оценки их каузальности в различных моногенных заболеваниях [33]. Возможности массовой оценки функционального эффекта инделов in vitro с помощью технологии ГМС появились совсем недавно [15], но вряд ли эти результаты смогут в ближайшем будущем дать исчерпывающие ответы на вопросы о патогенности тех или иных инделов, ввиду очевидной разницы между функциональным и клиническим эффектом. То же самое можно сказать про вычислительные методы предсказания эффекта инделов, которые переживают своего рода "второе рождение" в эпоху быстрого развития методов глубокого обучения (нейронных сетей) [17][34]. Накопление данных секвенирования и их интерпретация в клиническом контексте позволяют делать наиболее достоверные выводы о патогенности и пенетрантности различных вариантов генома. Настоящее исследование ставит своей целью собрать наиболее значимые гены, ассоциируемые с ССЗ, и описать свойства встречающихся в них коротких инделов, в частности, их распространенность и локализацию, а также патогенность и пенетрантность. Тем самым, среди прочего, мы надеемся привлечь внимание врачей-генетиков к этим вариантам генома, которые иногда оказываются на периферии внимания исследователей в клинических или научных проектах [10][11].

В настоящей работе были отобраны 42 гена, ассоциированные с 22 ССЗ, проанализированы описанные в базе ClinVar [5] инделы в генах из этой выборки. Обнаружен большой разброс числа инделов в этих генах: от 1 до 91 в гене, что в, первую очередь, объясняется разницей в длине и нуклеотидном составе генов, а также в общей степени их изученности. Также в ряде случаев в одних и тех же генах наблюдается разница в соотношении различных типов клинической значимости при сравнении инделов и миссенсов. Например, в случае LDLR и FBN1 полное отсутствие доброкачественных инделов статистически значимо, что может свидетельствовать о низкой толерантности данных генов в такому типу варианта. В SCN5A все известные инделы патогенные, а среди миссенсов таких вариантов лишь ~12,8%. Можно ожидать, что особенности этого гена станут понятнее по мере накопления клинических данных. Разброс количества инделов и их патогенности в различных генах отмечался ранее [14]. Полученные нами результаты позволяют сделать вывод, что инделы более редки, чем миссенсы, но более патогенны. Наиболее сильно это тенденция проявляется в кардиомиопатиях, миопатиях и сосудистых заболеваниях, в случае же аритмий и гиперхолестеринемии инделы, напротив, встречаются чаще.

Показано, что для локализации в различных участках белков доброкачественных и патогенных инделов из исследованной выборки в 30 генов характерны определенные тенденции, соответствующие описанным в рекомендациях ACMG по клинической интерпретации [7], в частности, увеличение вероятности индела быть патогенным по мере роста его длины. В работе [14] авторы наблюдают обратный эффект: некоторое увеличение доли доброкачественных вариантов по мере роста длины индела, однако в обоих случаях тенденция не является сильной. Патогенные инделы редко наблюдаются в повторах последовательности или в участках низкой сложности (суммарно 4%), а доброкачественные попадают в домены Pfam менее, чем в 5% случаев. Таким образом, можно сделать вывод о том, что короткие инделы в повторах последовательности или в участках без известной функции будут патогенны с меньшей степенью вероятности, однако сами по себе особенности локализации инделов в том или ином белке вряд ли могут приводить к однозначной интерпретации их эффекта.

В ходе анализа 42 целевых генов в >6800 секвенированных образцах из различных российских когорт были обнаружены описанные ранее инделы различной клинической значимости, а также 19 инделов, не описанных в базах данных ClinVar и dbSNP. Инделы, отсутствующие в этих базах (например, DSP:p. Ser957del или RBM20:p. Gln55_Ala56delinsPro), представляют интерес как потенциально специфичные для российской популяции [23]. Имеющиеся для части инделов данные о клинических проявлениях с установленным диагнозом позволяют сделать вывод об их достаточно высокой пенетрантности: так, у 24 из 32 носителей мутантных аллелей были подтверждены диагнозы, в первую очередь гиперхолестеринемия и кардиомиопатия (таблица 2), что позволяет оценить среднюю пенетрантность исследованных инделов в этих генах как 75%. Более точная ее оценка будет возможна по мере накопления данных секвенирования.

Заключение

Впервые был проанализирован спектр инделов без сдвига рамки считывания в группе генов, достоверно ассоциированных с ССЗ. Было показано, что инделы значительно менее распространены, но при этом более патогенны, чем несинонимичные варианты (миссенсы). В случае кардиомиопатий, миопатий и сосудистых заболеваний инделы как каузальные варианты наиболее редки, а в случае аритмий и гиперхолестеринемии, напротив, встречаются чаще. Патогенные инделы реже всего встречаются в участках низкой сложности (повторах) или в участках неупорядоченной структуры белков, а доброкачественные инделы избегают доменов, аннотированных в базе данных Pfam, для которых, как правило, характерна консервативность и функциональная значимость. Наиболее распространены делеции длиной один остаток и вставки (инсерции) с длинами от двух до пяти остатков. На основе анализа целевых генов в >6800 секвенированных образцах из различных российских когорт был сделан вывод о достаточно высокой пенетрантности исследованных патогенных инделов, описаны потенциально специфичные для российской популяции примеры патогенных инделов. В настоящей работе впервые выполнен систематический анализ инделов в генах ССЗ, который подчеркивают их клиническую важность с точки зрения каузальности и пенетрантности, несмотря на меньшую распространенность по сравнению с несинонимичными вариантами.

Отношения и деятельность. Государственное задание "Разработка модели предсказания пенетрантности и экспрессивности причинных вариантов наследственных моногенных заболеваний сердечно-сосудистой системы".