Выраженность окислительного стресса и носительство полиморфных вариантов митохондриальной ДНК у пациентов с хронической сердечной недостаточностью, имеющих высокий риск внезапной сердечной смерти

Введение

Желудочковые тахиаритмии, включая фибрилляцию желудочков и желудочковую тахикардию (ЖТ), являются наиболее распространенными нарушениями сердечного ритма, приводящими к внезапной сердечной смерти (ВСС). В настоящее время накоплено достаточно фактов, подтверждающих, что одним из патогенетических звеньев развития хронической сердечной недостаточности (ХСН) и вызванных ею аритмий является окислительный стресс (ОС) [1-3]. Дисбаланс между скоростью образования свободных радикалов и активностью антиоксидантов при ОС приводит к повреждению клеточных структур кардиомиоцитов, запуску воспаления и фиброза, образуя субстрат для развития аритмий, особенно желудочковых, через механизмы активации никотинамидадениндинуклеотидфосфат-оксидаз [4] и повреждения митохондрий (МХ) [5]. В результате снижения выработки аденозинтрифосфата и чрезмерного образования активных форм кислорода (АФК) нарушается работа ионных каналов и транспортеров, что отражается на внутриклеточном ионном гомеостазе и возбудимости кардиомиоцитов [6] и может приводить к повышенной предрасположенности к нарушениям сердечного ритма.

Митохондриальный геном кодирует комплексы белков дыхательной цепи, следовательно, изменения кодирующей последовательности нуклеотидов могут отражаться на процессах энергетического обмена. В то же время расположение митохондриальной дезоксирибонуклеиновой кислоты (мтДНК) в непосредственной близости к дыхательной цепи, месту образования АФК, и низкая активность систем ее репарации в МХ обуславливает высокий уровень мутаций в мтДНК в сравнении с ядерной. Возникающие повреждения цепи мтДНК препятствуют воспроизведению и экспрессии митохондриального генома, а нуклеотидные замены могут вызывать изменения работы электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) [7]. Таким образом, можно, предположить существование взаимосвязи между полиморфными вариантами мтДНК и интенсивностью ОС при сердечно-сосудистых заболеваниях (ССЗ).

Цель исследования — у пациентов с ХСН и высоким риском ВСС оценить выраженность ОС и носительство полиморфных вариантов мтДНК.

Материал и методы

В исследование включено 198 пациентов, из них 156 (78,79%) мужчин и 42 (21,21%) женщины с диагнозом ХСН I-III функционального класса (ФК) согласно классификации Нью-Йоркской ассоциации сердца (NYHA — New York Heart Association) и имплантированным кардиовертер-дефибриллятором (ИКД) в качестве первичной или вторичной профилактики развития жизнеугрожающих ЖТ и ВСС. Первичную профилактику осуществляли пациентам, которые имели высокую вероятность развития ВСС. Вторичная профилактика проводилась пациентам, имеющим в истории болезни эпизоды устойчивой ЖТ и/или фибрилляции желудочков, наличие симптоматики развития нарушений ритма сердца (синкопе, зарегистрированные на электрокардиограмме желудочковые тахиаритмии), перенесенную ВСС. После имплантации ИКД пациенты повторно обследовались по прошествии 6, 12 и 24 мес. для снятия показаний эндограмм системы ИКД-электрод.

Критерии включения пациентов в исследование: диагноз ХСН I-III ФК по NYHA, показания к имплантации ИКД, возраст >40 лет, добровольное информированное согласие. Критерии невключения: ХСН IV ФК по NYHA, отказ пациента от участия в исследовании на любом из этапов, каналопатии (синдром удлиненного интервала QT, синдром Бругада и пр.), сопутствующие тяжелые патологии, такие как онкологические заболевания, хроническая болезнь почек 4-5 стадий, наличие неврологических расстройств или психоэмоциональных состояний, показание к трансплантации сердца, беременность. Пациенты наблюдались в профильных отделениях НИИ кардиологии Томского НИМЦ. Протокол исследования одобрен комитетом по биомедицинской этике НИИ кардиологии Томского НИМЦ (протокол № 219 от 26.10.2021). Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании.

Клинико-инструментальная характеристика пациентов на момент включения в исследование представлена в таблице 1. Все данные взяты из базы данных "Клинико-лабораторные характеристики кардиологических пациентов с показаниями к имплантации кардиовертера-дефибриллятора" (https://elibrary.ru/item.asp?id=76385590).

Одновременно с набором пациентов из 28 здоровых добровольцев была сформирована группа контроля (18 мужчин и 10 женщин), не имеющих в анамнезе сердечно-сосудистой патологии, нарушений обмена веществ (ожирения, сахарного диабета 1 или 2 типа, нарушений толерантности к глюкозе, дислипидемии, а также не получавших лекарственную терапию по данным фармакологического анамнеза. Медиана возраста в группе контроля составила 57 (50; 68) лет.

Всем пациентам и здоровым добровольцам утром натощак выполняли взятие венозной крови в два вакутейнера с антикоагулянтом — двукалиевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (К₂ЭДТА) объемом 10 мл. Для определения полиморфных вариантов и гаплогрупп мтДНК один вакутейнер направляли в лабораторию популяционной генетики НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ. Полную последовательность митохондриального генома пациентов определяли методом массового параллельного секвенирования (секвенирование следующего поколения). Для этого мтДНК амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) длинных фрагментов. Для каждого образца ДНК проводили две реакции ПЦР в раздельных пробирках, которые позволяют получить два ПЦР-продукта, полностью перекрывающих мтДНК: (1) длиной 9065 пар нуклеотидов (последовательности праймеров соответствуют позициям 9397-9416 и 1892-1873 референсной последовательности мтДНК человека) и (2) длиной 11170 пар нуклеотидов (позиции праймеров 15195-15214 и 9796-9777). Таким образом, полученные ПЦР-продукты перекрывались друг с другом в областях 9397-9796 и 15195-(0)-1873.

ПЦР длинных фрагментов проводили с помощью набора реактивов "БиоМастер LR HS-ПЦР (2x)" (БиоЛабМикс, Новосибирск). Концентрацию ПЦР-продуктов определяли на приборе Qubit (Thermo Fisher Scientific, США), используя реактивы для определения концентрации ДНК "Spectra Q BR" (Raissol, Россия). Затем два ПЦР-продукта для каждого индивида смешивали в эквимолярных количествах до концентрации ДНК 20 нг/мкл. ДНК-библиотеки готовили с помощью наборов реактивов для приготовления ДНК-библиотек, предназначенных для работы с геномной ДНК. Для этого использовали наборы DNA Prep (Illumina, США) и наборы "SG GM Plus" (Raissol, Россия), с использованием двойного индексирования. При приготовлении ДНК-библиотек следовали протоколу производителя. Секвенирование проводили на секвенаторе MiSeq (Illumina, США), набор реагентов MiSeq reagent v.2 kit 300 циклов, а также на секвенаторе GenoLab M (GeneMind, Китай), набор реагентов GenoLab M V2.0 FCM, 150 циклов. Нуклеотидные прочтения в формате fastq, полученные после демультиплексирования данных, выравнивали на референсную последовательность генома человека (hg38) с использованием программного обеспечения DRAGEN 3.9.5, DNA pipeline (Illumina, США). Полученные файлы формата bam анализировали с помощью специализированного для мтДНК программного обеспечения "MtDNA-Server 2" [8]. Наличие нуклеотидных замен выявляли при сопоставлении исследуемых образцов с референсной последовательностью мтДНК человека [9], а принадлежность выявленного гаплотипа к гаплогруппе мтДНК, оценивали согласно общепринятой классификации [10].

Для определения выраженности ОС оценивали активность фермента супероксиддисмутазы (СОД) и концентрацию активных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП). Для этих исследований использовали образец крови из второго вакутейнера, который центрифугировали 10 мин при 3000 об./мин. Полученную плазму аликвотировали и хранили до выполнения анализов в низкотемпературной камере при -80 °С. В образцах плазмы в реакции с тиобарбитуровой кислотой проводили определение ТБК-АП ПОЛ по ранее опубликованному методу [11]. Активность СОД определяли гидроксиламиновым методом с использованием коммерческого набора реагентов Total Superoxide Dismutase (T-SOD) Assay Kit (Hydroxyiamine method), Cloud-Clone Corp. Измерение оптической плотности проб выполняли на спектрофотометре Biowave II (Biochrom Ltd., Великобритания). Активность фермента рассчитывали по формуле согласно инструкции к набору реактивов и выражали в Ед/мл.

У всех пациентов определены индекс массы тела и содержание в сыворотке крови глюкозы, общего холестерина и триглицеридов.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программ Statistica 12.0. Проверку соответствия распределения количественных данных нормальному закону проводили критериями Колмогорова-Смирнова, Шапиро-Уилка. Сравнение независимых групп количественных переменных осуществляли U-критерием Манна-Уитни и критерием Краскела-Уоллиса. При попарном множественном сравнении количественных данных использовали поправку Бонферрони. Значения представлены в виде медианы и интерквартильного размаха — Me (Q25; Q75). Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты

В сформированной выборке пациентов (таблица 1) преобладали мужчины, средний возраст составил 64 (58; 71) лет. У 11,62% пациентов выявлена ХСН ФК I, у 53,03% — ХСН ФК II и у 35,35% — ХСН ФК III. Постинфарктный кардиосклероз в анамнезе был у 55,05%, ишемическая кардиомиопатия у 37,37%. У 17,68% пациентов был диагностирован сахарный диабет 2 типа (СД2), 70,2% пациентов имели дислипидемию, 90,4% — артериальную гипертензию. В качестве терапии ишемической болезни сердца пациенты получали антиагреганты, антикоагулянты, β-блокаторы, статины. Большинство пациентов получали антигипертензивную терапию ингибиторами ангиотензинпревращающего фермента либо блокаторами рецепторов ангиотензина II, антагонистами кальция и диуретиками. Пациенты с коморбидным течением ХСН и СД2 получали ингибиторы натрий-глюкозного котранспортера 2 типа.

Благодаря проводимой фармакологической терапии показатели общего холестерина (ХС) и триглицеридов у включенных в исследование пациентов находились в пределах референсных значений. Уровень глюкозы крови незначительно превышал целевые значения.

Определение маркеров ОС позволило установить, что в общей выборке пациентов Me концентрации ТБК-АП составила 14,11 (11,03; 18,21) мкмоль/л и значимо (р=0,042) превышала показатель в группе контроля — 11,79 (10,90; 13,85) (таблица 2). Активность антиоксидантного фермента СОД составила 20,95 (16,27; 38,80) Ед/мл, что также значимо (р=0,001) превышало значения этого показателя в контрольной группе 15,67 (14,11; 18,40) Ед/мл.

Сравнение маркеров ОС у мужчин и женщин в рассматриваемых группах показало, что у здоровых женщин уровень ТБК-АП значимо ниже, чем у здоровых мужчин (р=0,004) (таблица 2). При этом активность СОД у здоровых женщин была значимо выше в сравнении с мужчинами (р=0,003). Напротив, в основной выборке мужчины и женщины не имели значимых различий по концентрации ТБК-АП в плазме, однако и здесь, у женщин отмечена тенденция к более высокой активности СОД в сравнении с мужчинами.

Была проведена оценка влияния рассматриваемой патологии на уровень ТБК-АП и активность СОД в женской и мужской когорте (таблица 2). Из представленных данных видно, что риск ВСС и у женщин, и у мужчин не связан с уровнем ТБК-АП. Однако и у женщин, и у мужчин с высоким риском ВСС было отмечено статистически значимое повышение активности СОД.

В рассматриваемой выборке пациентов по данным эндограмм ИКД за 24 мес. наблюдения возникновение эпизодов ЖТ было зарегистрировано у 55 человек. По этому признаку общая выборка была разделена на две подгруппы, в которых сравнили активность СОД и уровень ТБК-АП (таблица 3). В группе пациентов с зарегистрированными ЖТ концентрация ТБК-АП (p=0,68) и активность СОД (p=0,57) не отличались от показателей в группе без ЖТ.

Сформированная выборка включала пациентов с ХСН I, II и III ФК по NYHA (таблица 1). Группы пациентов с разным ФК ХСН значимо не различались по уровню ТБК-АП в плазме крови (таблица 3). В подгруппе пациентов с ХСН I ФК активность СОД была статистически значимо выше, чем в подгруппе c ХСН ФК II (p=0,002). Показатель активности СОД в подгруппе ХСН III ФК значимо не отличался от аналогичного показателя в подгруппах ХСН I ФК и ХСН II ФК.

Активность СОД и концентрация ТБК-АП у пациентов была рассмотрена в зависимости от генеза ХСН. Сформированные подгруппы пациентов с ишемическим и не ишемическим генезом ХСН значимо не различались по концентрации ТБК-АП и активности СОД. Концентрация ТБК-АП в группе пациентов без ишемии миокарда составила 14,42 (10,06; 18,46) vs 14,04 (11,09; 17,76) мкмоль/л (p=0,79) у пациентов с ишемической кардиомиопатией. Активность СОД у пациентов без ИБС — 23,9 (15,5; 46,6) vs 20,8 (16,6; 36,1) Ед/мл, (р=0,42) у пациентов с ИБС.

Не удалось выявить значимых различий при сравнении рассматриваемых показателей в зависимости от отсутствия или наличия в анамнезе перенесённого инфаркта миокарда. Концентрация ТБК-АП в группе с инфарктом миокарда в анамнезе составила 14,1 (10,8; 18,2) vs 13,2 (10,3; 16,2) (р=0,37) мкмоль/л без инфаркта миокарда, активность СОД соответственно 21,9 (16,2; 40,8) vs 20,7 (16,4; 34,1) Ед/мл, (р=0,35).

Рассматриваемая выборка включала 35 пациентов с сочетанным течением ХСН и СД2 и 133 пациента с ожирением (таблица 1). Оказалось, что наличие СД2 характеризовалось значимо (р=0,009) более высокими показателями ТБК-АП, но не влияло на активность СОД (таблица 4). Наличие ожирения у пациентов также сопровождалось усиленной наработкой ТБК-АП, при одинаковой активности СОД в подгруппах пациентов. У пациентов с ХСН, имеющих концентрацию общего ХС >5,2 ммоль/л, также было отмечено повышенное содержание в плазме крови ТБК-АП (р=0,05) в сравнении с пациентами с уровнем ХС ≤5,2 ммоль/л. По активности СОД рассматриваемые подгруппы не различались.

У включенных в исследование пациентов методом массового параллельного секвенирования были определены полиморфные варианты мтДНК А2706G, G3010A, G9055A. Кроме того, в результате секвенирования была определена принадлежность мтДНК пациентов к основным гаплогруппам мтДНК. Для анализа были выбраны наиболее часто встречающиеся гаплогруппы: H, U и T.

Сравнение концентраций ТБК-АП в группах носителей полиморфных вариантов А2706G, G3010A и G9055A показало значимо более низкое содержание конечных продуктов ОС у носителей полиморфизма G9055A относительно носителей полиморфизма А2706G (таблица 5). Различия концентраций ТБК-АП между носителями полиморфных вариантов G3010A и G9055A не было. Между подгруппами не было выявлено различий по активности СОД в плазме крови. Статистический анализ показателей ОС при распределении пациентов на группы по носительству распространенных гаплогрупп Н, U и T не показал значимого различия по концентрации ТБК-АП и активности СОД (таблица 5).

Обсуждение

Активация свободнорадикального окисления липидов, белков и нуклеиновых кислот (ОС) является ключевым звеном патогенеза многих ССЗ. Исследование маркеров ОС в плазме крови пациентов с ХСН и высоким риском ВСС показало значимо более высокое содержание ТБК-АП и активность антиокислительного фермента СОД в сравнении со здоровыми добровольцами. Полученные результаты свидетельствуют о высокой активности свободнорадикального окисления липидов у пациентов с коморбидным течением ХСН и желудочковых тахиаритмий. В ответ на ОС у пациентов с исследуемой патологией наблюдается компенсаторная активация СОД. Стоит отметить, что у пациентов с ХСН и высоким риском ВСС не было выявлено межполовых различий в интенсивности ОС и активности антиоксидантной защиты. Была отмечена лишь тенденция преобладания активности СОД у женщин в сравнении с мужчинами. В отличие от пациентов, в группе здоровых добровольцев для мужчин по сравнению с женщинами было характерно значимо более высокое накопление вторичных продуктов ПОЛ на фоне значимо меньшей активности СОД, что свидетельствует о снижении защиты от действия свободных радикалов на этапе образования АФК и инициации свободно-радикального повреждения. Вероятно, исходно повышенный уровень физиологического течения ОС у здоровых мужчин, наряду с другими факторами, вносит свой вклад в развитие ХСН и аритмии и объясняет преобладание мужчин в исследуемой выборке пациентов.

Сравнение исследуемых маркеров ОС у здоровых мужчин vs мужчин с ХСН и ИКД показало напряжение антиокислительной системы, выразившееся в значимом повышении на 33% активности СОД в плазме крови пациентов. Сравниваемые подгруппы не различались по концентрации ТБК-АП, что может быть объяснено высоким уровнем их образования уже у здоровых мужчин. Половые особенности женщин выразились в том, что коморбидное течение ХСН и желудочковых аритмий происходит на фоне значимого увеличения активности СОД в сравнении со здоровыми женщинами (на 53%; р=0,039). Концентрация в плазме ТБК-АП имела тенденцию к увеличению, что дает возможность предположить достижение различий при увеличении групп наблюдения, либо значимого различия в содержании других маркеров ОС.

Факт срабатывания ИКД не был связан с интенсивностью ОС, о чем свидетельствует отсутствие значимой разницы при сравнении маркеров ОС между группами со срабатыванием и без срабатывания. Вероятно, что отмеченный уровень ОС в наблюдаемой группе пациентов не оказывает негативного влияния на механизмы аритмогенеза миокарда желудочков. Следует учитывать и тот факт, что пациентам с ХСН не только устанавливают ИКД, но и в 100% случаев подбирают фармакологическую терапию, которая также может воздействовать на процессы ОС.

Утяжеление ФК ХСН также не характеризовалось увеличением концентрации ТБК-АП в плазме пациентов. Со стороны активности СОД нами была отмечена значимо низкая (р=0,011) активность СОД у пациентов с ХСН ФК II. При этом у пациентов с ФК III показатель активности СОД занимал промежуточное место между значениями в подгруппах пациентов с ФК I и ФК II.

Наличие у пациентов с ХСН и высоким риском развития ВСС метаболических нарушений таких как СД2, ожирение, гиперхолестеринемия характеризовалось более высокими показателями концентрации ТБК-АП, при отсутствии изменения активности СОД.

Колебания уровня глюкозы и дислипидемия запускают воспалительные реакции посредством повышения продукции митохондриального супероксида и стресса эндоплазматического ретикулума [12]. Отсутствие компенсаторной реакции антиоксидантов при рассматриваемых патологиях может быть обусловлено ингибированием части молекул фермента за счет гликозилирования [13][14], нарушением метаболических процессов и синтеза антиоксидантов в организме [15], их расходованием или ингибированием в результате взаимодействия ТБК-АП с активным центром СОД при ОС [16].

Митохондриальный геном находится в непосредственной близости к месту образования АФК и подвергается окислительному повреждению из-за отсутствия гистонов и недостаточной системы репарации [17][18]. Изменения в мтДНК могут отражаться на ферментативной активности белков переносчиков ЭТЦ МХ, что приводит к утечке электронов, усиленному образованию АФК и активации ОС в различных тканях у пациентов с ССЗ. Протекание свободно-радикальных реакций в липидах мембран МХ способствует дополнительной утечке электронов из ЭТЦ и усилению ПОЛ. В результате замыкается порочный круг, способствующий повышенной наработке АФК и повреждению мтДНК. Активное протекание ОС и мутации мтДНК могут отражаться на функциональной активности МХ. В ранее проведенных исследованиях у пациентов с ХСН и высоким риском ВСС нами был выявлен факт снижения функциональной активности МХ в сравнении с моновариантным течением ХСН [19]. Также было показано, что у носителей замены A2706G в структуре мтДНК ухудшается сопряжение окисления и фосфорилирования при флавинадениндинуклеотид-зависимом типе дыхания. Носительство замены G9055A мтДНК может способствовать ухудшению окисления никотинамидадениндинуклеотид-зависимых (НАД-зависимых) субстратов. Носительство замены G3010A в мтДНК не ассоциировано с изменениями функциональных возможностей МХ и клинической картиной у пациентов с ХСН и высоким риском развития жизнеугрожающих тахиаритмий [20]. Носительство замены A2706G или G9055A в мтДНК сочеталось со снижением скорости окисления флавинадениндинуклеотид-зависимых субстратов у мужчин с ХСН и высоким риском развития жизнеугрожающих тахиаритмий [20].

В литературе показана ассоциация носительства некоторых полиморфных вариантов мтДНК с интенсивностью ОС при старении [21][22]. Несмотря на это, отсутствуют сведения об ассоциации уровней маркеров ОС с распространенными вариантами и/или гаплогруппами мтДНК при ССЗ. Проведенное нами исследование позволило выявить наименьшую концентрацию ТБК-АП в плазме крови носителей полиморфного варианта G9055A мтДНК относительно носителей вариантов А2706G и G3010A. При этом различия активности СОД в группах носителей рассматриваемых полиморфных вариантов не наблюдалось.

Замена G9055A в гене MT-ATP6 белка субъединицы ATP6 из комплекса V согласно базе данных MitoMap присутствует у 4,2% населения мира и это значение увеличивается до 8,1% у 90-летних людей [23]. Замена аминокислоты аланина на треонин (A177T) подразумевает изменение гидрофобной аминокислоты на более крупную полярную незаряженную. Примечательно, что белковая спираль в ATP6 на 60% состоит из гидрофобных аминокислот, что, возможно, позволяет ей перемещаться внутри мембраны. Следовательно, мутация, ведущая к замене аминокислоты с гидрофобной на полярную (гидрофильную), может замедлить взаимодействие ATP6 с другими комплексами, снизить способность продуцировать аденозинтрифосфат и уменьшить выраженность ОС [24]. Кроме того, было показано, что мутация G9055A в гене MT-ATP6 мтДНК является единственным однонуклеотидным полиморфизмом, способствующим долголетию [25], что также может быть связано с уменьшением интенсивности ОС у носителей данного полиморфизма.

Ограничения исследования. К ограничениям проведенного исследования следует отнести одноцентовый характер исследования, преобладание в основной группе мужчин, а также небольшой размер группы контроля. У здоровых добровольцев не было выполнено определение носительства полиморфных вариантов и гаплогрупп.

Заключение

У пациентов с ХСН и высоким риском ВСС отмечается высокая концентрация ТБК-АП и активность СОД в плазме крови, что свидетельствует об интенсивном течении ОС. У здоровых добровольцев уровень ТБК-АП в плазме значимо выше у мужчин и сочетается со сниженной активностью СОД. При развитии ХСН межполовые различия отсутствуют. Течение ХСН с высоким риском ВСС на фоне метаболических нарушений обмена глюкозы и липидов, характеризуется белее интенсивным ОС. Носительство полиморфного варианта G9055A гена MT-ATP6 сопряжено с низким уровнем ТБК-АП.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.