Анализ субфракционного спектра липопротеинов высокой плотности в зависимости от наличия атеросклероза бедренных артерий и ожирения

Введение

Атеросклеротическое поражение артерий нижних конечностей представляет собой одно из наиболее распространённых проявлений системного атеросклероза и ассоциировано с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений, поражая >200 млн человек во всем мире [1][2]. Несмотря на доказанную роль повышенного уровня холестерина (ХС) липопротеинов низкой плотности (ЛНП) и сниженной концентрации ХС липопротеинов высокой плотности (ЛВП) в развитии атеросклероза, у значительной части пациентов сохраняется остаточный, или резидуальный, риск сердечно-сосудистых осложнений даже при достижении целевых значений традиционных показателей липидного профиля, что требует более глубокого изучения липид-транспортной системы, в частности, субфракционного спектра липопротеинов [3].

Липопротеины плазмы крови осуществляют направленный транспорт липидов в организме и представляют собой гетерогенную популяцию частиц, различающихся по размеру, плотности, белково-липидному составу и функциональной активности [4]. Установлено, что отдельные субфракции аполипопротеин (апо) В-содержащих ЛНП и апо AI-содержащих ЛВП обладают различным атерогенным, или атеропротективным, потенциалом, который не выявляется при стандартном лабораторном анализе. Ведущая роль в атерогенезе традиционно отводится ЛНП, повышение концентрации которых ассоциировано с развитием и прогрессированием атеросклероза [4][5]. Вместе с тем, современные представления о патогенезе атеросклероза базируются на анализе качественных характеристик субфракционного спектра липопротеинов, в частности гетерогенности ЛВП [6-8].

ЛВП, обеспечивающие обратный транспорт ХС из периферических тканей в печень, считаются потенциально антиатерогенными, благодаря многообразным защитным свойствам: антиокислительным, антитромботическим, противовоспалительным. В субфракционном спектре ЛВП выделяют крупные богатые липидами (субфракции 1-3), промежуточные (субфракции 4-7) и мелкие богатые белком (субфракции 8-10), каждая из которых может иметь специфический вклад в реализацию атеропротективных механизмов [9][10]. Крупные субфракции ЛВП характеризуются более выраженной активностью в обеспечении обратного транспорта ХС и большей противовоспалительной активностью, тогда как мелкие субфракции при определённых условиях могут утрачивать защитные свойства и ассоциироваться с атеросклеротическим поражением сосудов [11]. В связи с этим анализ субфракционного спектра ЛВП рассматривается как более чувствительный метод оценки атерогенного потенциала липопротеинов, чем определение уровня ХС ЛВП [8][12].

В ряде исследований продемонстрировано, что перераспределение субфракционного спектра ЛВП со снижением доли крупных и увеличением мелких частиц ассоциировано с коронарным и каротидным атеросклерозом, а также с неблагоприятным сердечно-сосудистым прогнозом [13-15]. Вместе с тем, субфракционный профиль ЛВП при атеросклеротическом поражении бедренных артерий (БА) изучен недостаточно, что определяет актуальность его детального анализа.

Дополнительный интерес представляет оценка гетерогенности ЛВП у больных с атеросклерозом БА при наличии ожирения — одного из наиболее распространённых и метаболически значимых факторов сердечно-сосудистого риска (ССР). Ожирение ассоциировано с рядом метаболических нарушений: инсулинорезистентностью, хроническим вялотекущим воспалением, дислипидемией, которые характеризуются перераспределением субфракционного спектра липопротеинов [16-18]. Учитывая высокую распространённость ожирения среди пациентов с периферическим атеросклерозом, представляется важным оценить возможные ассоциации при анализе субфракционного спектра ЛВП у пациентов с атеросклерозом БА в зависимости от наличия ожирения [19].

Цель исследования — определить и охарактеризовать особенности субфракционного спектра ЛВП у пациентов с наличием или отсутствием атеросклероза БА, а также в зависимости от наличия ожирения.

Материал и методы

В исследование включено 97 пациентов в возрасте от 34 до 80 лет, проходивших обследование в ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России, которым проводились ультразвуковое дуплексное сканирование (УЗДС) артерий нижних конечностей и анализ субфракционного спектра липопротеинов. Помимо этого, всем пациентам в рамках обследования проводилось УЗДС брахиоцефальных артерий, а также коронароангиография для оценки атеросклеротического поражения других артериальных бассейнов. В настоящем исследовании оценивали БА как модель раннего атеросклероза ввиду клинической значимости поражения данного артериального бассейна, доступности инструментальной оценки и возможности выявления субклинических изменений [20].

Критерии включения: мужчины и женщины в возрасте от 34 до 80 лет, пациенты с подтвержденным атеросклерозом в бедренном артериальном сосудистом бассейне.

Критерии невключения: перенесенное <6 мес. назад острое осложнение атеросклероза, семейная гиперхолестеринемия, острые воспалительные заболевания, сахарный диабет обоих типов в стадии декомпенсации (уровень глюкозы крови натощак >11 ммоль/л), острая почечная и печеночная недостаточность, хроническая почечная недостаточность с гемодиализом, тяжелая и/или декомпенсированная хроническая сердечная недостаточность (ХСН), соответствующая IV функциональному классу по NYHA (New York Heart Association), психические заболевания, зависимость от лекарственных препаратов или алкоголя, онкологические заболевания вне стадии ремиссии, пациенты, принимающие специфическую терапию при хронических аутоиммунных заболеваниях (системные глюкокортикостероиды, противоопухолевая терапия, цитостатическая терапия), заболевания крови и иммунной системы, беременность или период лактации, отказ от участия в исследовании.

Исследование выполнено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом учреждения (№ 09-05/19). Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании, обработку персональных данных, взятие и биобанкирование крови.

Пациенты были разделены на 2 группы, сопоставимые по полу и возрасту: группа 1 включала 47 больных с наличием атеросклероза БА, группа 2 — 50 больных без признаков атеросклероза данного артериального бассейна. Общая характеристика исследуемых пациентов представлена в таблице 1.

Всем пациентам проведено УЗДС БА на аппарате Vivid-7 в В-режиме линейным датчиком с частотой 9-11 МГц в положении лежа на спине с определением толщины комплекса интима-медиа, наличия атеросклеротических бляшек (АСБ), оценкой их количества и максимальной высоты АСБ. Исследовались общая БА на всем протяжении, область бифуркации общая БА, поверхностная БА с обеих сторон. АСБ определяли как фокальное утолщение комплекса интима-медиа ≥1,5 мм, выступающее в просвет сосуда, либо утолщение стенки сосуда ≥0,5 мм или более чем на 50% по сравнению с окружающими участками стенки сосуда. Атеросклероз определялся по наличию любой АСБ в БА. Проводилось три измерения толщины каждой АСБ, вычислялось среднее значение. Критерии визуализации и определения АСБ в БА соответствовали клиническим руководствам по заболеваниям периферических артерий [21].

Все исследуемые пациенты проходили стационарное лечение по основному заболеванию, включая артериальную гипертензию, стабильную ишемическую болезнь сердца, фибрилляцию предсердий и другие виды нарушений ритма сердца, ХСН вне стадии декомпенсации. Все пациенты получали медикаментозную терапию в соответствии с действующими европейскими клиническими рекомендациями по ведению сердечно-сосудистых заболеваний и профилактике сердечно-сосудистых событий [22]. Применялись гиполипидемическая, антигипертензивная и антиангинальная терапия, включая β-адреноблокаторы, блокаторы медленных кальциевых каналов, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, блокаторы рецепторов ангиотензина II, тиазидные и тиазидоподобные диуретики, петлевые диуретики, антагонисты минералокортикоидных рецепторов, а также антиагрегантная и антикоагулянтная терапия. Назначение и коррекция терапии осуществлялись лечащим врачом и не являлись предметом вмешательства в рамках настоящего исследования. Анализ влияния отдельных классов гиполипидемической терапии на особенности субфракционного спектра ЛВП не являлся целью настоящего исследования. Иной терапии, в т.ч. специфической по другим нозологиям (противовоспалительной, гормональной, противоопухолевой), данная группа пациентов не получала.

Наряду с инструментальными исследованиями всем пациентам было выполнено определение биохимических показателей в сыворотке крови, полученной стандартными методами из венозной крови, взятой после 12-ч голодания. Рутинные биохимические показатели: уровни общего ХС, триглицеридов (ТГ), ХС ЛНП и ХС ЛВП определяли на анализаторе Architect c8000 (Abbott, США).

Образцы сыворотки крови после аликвотирования замораживали и хранили в "Банке биологического материала" ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России при температуре -70 ^оС до проведения дальнейших исследований.

Анализ субфракционного спектра ЛВП проведен с помощью электрофореза в 3%-ном полиакриламидном геле с использованием тест-системы Lipoprint HDL Subfractions Testing System (Quantimetrix, США). Результаты представлены как площадь под кривой (AUC — area under curve) каждой субфракции в % (доля субфракции) на электрофореграммах каждой пробы, а также в мг/дл (концентрация ХС в каждой субфракции) из расчета уровня ХС ЛВП в крови каждого пациента.

Статистический анализ полученных результатов проводился с помощью программы R-studio с открытым кодом и SPSS24 (IBM). Количественные переменные описывались медианой (Ме) и интерквартильным размахом [Q25; Q75], для сравнения групп использовался непараметрический критерий Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводился методом ранговой корреляции по Спирмену. Для анализа диагностической эффективности биомаркеров применялся ROC-анализ (Receiver operating characteristic) с расчетом AUC, для расчета пороговых уровней применялся коэффициент Юдена (J). Для многофакторной оценки ассоциаций проводился логистический регрессионный анализ с поправкой на пол и возраст больных. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Сравнительный анализ содержания в сыворотке крови общего ХС, а также ХС в составе ЛВП, определённых рутинными методами, статистически значимых различий между больными с атеросклеротическим поражением БА и без поражения данного бассейна не выявил. В то же время анализ субфракционного спектра ЛВП при сравнении групп с наличием или отсутствием атеросклероза БА позволил обнаружить ряд ассоциаций.

В таблице 2 представлены результаты сравнительного анализа субфракционного спектра ЛВП с выделением 10 субфракций, объединенных в три группы в зависимости от размера: крупные (субфракции 1-3), средние (субфракции 4-7) и мелкие (субфракции 8-10). У пациентов с атеросклерозом БА (группа 1) суммарная доля крупных частиц ЛВП_1-3 была статистически значимо ниже по сравнению с группой 2 (21,0 vs 28,8%, р<0,05), тогда как суммарная доля мелких частиц ЛВП_8-10 оказалось достоверно выше (24,0 vs 18,4%, р<0,05), что свидетельствует о перераспределении субфракционного спектра ЛВП в сторону менее атеропротективного фенотипа.

Анализ субфракционного спектра промежуточных субфракций ЛВП (субфракции 4-7) продемонстрировал неоднородность их распределения. Так, у пациентов с атеросклерозом БА статистически значимо отмечена более высокая доля ЛВП₆ и ЛВП₇. Примечательно, что для одной из промежуточных субфракций, а именно ЛВП₄, выявлена противоположная тенденция: медианные значения ее доли и концентрации были ниже у пациентов с атеросклеротическим поражением БА. По суммарной доле промежуточных субфракций ЛВП существенных различий между группами не выявлено (53,8 vs 52%), что свидетельствует о перераспределении субфракций внутри промежуточных ЛВП без изменения их общего вклада.

Анализ субфракционного спектра ЛВП у больных с атеросклерозом БА с наличием (подгруппа 1.1, n=23) или отсутствием ожирения (подгруппа 1.2, n=24) представлен в таблице 3. Выявлены статистически значимые различия в распределении субфракций ЛВП: суммарная доля крупных субфракций ЛВП_2,3 была ниже у пациентов с ожирением — в подгруппе 1.1 (13,3 vs 18,4%; р<0,05); Аналогичные различия продемонстрированы при расчете концентрации ХС ЛВП в мг/дл сыворотки крови. Вместе с тем, у пациентов с атеросклерозом БА и ожирением (в подгруппе 1.1) было выявлено статистически значимое преобладание мелких субфракций ЛВП_8,9, суммарная доля которых составила 15,7 vs 12,3% в подгруппе 1.2 (р<0,05).

Результаты проведенного сравнительного анализа различий крупных, промежуточных и мелких ЛВП представлены на рисунке 1. Согласно полученным данным, в группе больных с атеросклерозом БА медиана содержания крупных частиц ЛВП была статистически значимо ниже, чем у пациентов без атеросклеротических изменений, тогда как медиана мелких субфракций ЛВП напротив статистически значимо выше в группе больных с атеросклерозом БА, относительно группы сравнения.

Дополнительно было рассчитано соотношение содержания мелких частиц ЛВП к крупным, при этом медиана данного соотношения в группе с поражением БА составила 1,29 [ 0,67-1,60], что в 2 раза превышало медиану данного соотношения в группе больных без поражения БА — 0,64 [ 0,42-0,89] (p=0,003). Результаты ROC-анализа с расчетом площади под кривой (AUC) приведены на рисунке 2. Исходя из представленных результатов для соотношения мелкие/крупные частицы ЛВП у больных с атеросклерозом БА относительно группы больных без атеросклеротического поражения БА AUC составила 0,734. Рассчитанный пороговый уровень соотношения мелкие/крупные частицы ЛВП составил 1,03; его превышение было ассоциировано с наличием атеросклероз БА с диагностической чувствительностью 70,0% при диагностической специфичности 83,0%.

Многофакторный регрессионный анализ показал, что наличие атеросклероза БА статистически значимо ассоциировано с более высоким показателем соотношения мелкие/крупные частицы ЛВП — отношение шансов (odds ratio, OR) =12,55; 95% доверительный интервал (ДИ): 2,58-61,15. При этом коррекция на пол, возраст и наличие ожирения не уменьшала значимость выявленной ассоциации.

Обсуждение

Несмотря на сопоставимые уровни стандартных показателей липидного обмена, результаты анализа субфракционного спектра ЛВП у пациентов с атеросклерозом БА демонстрируют перераспределение субфракций ЛВП, что подчёркивает ограниченную информативность определения уровней общего ХС и ХС ЛВП и значимость данного анализа для выявления функциональной и атерогенной гетерогенности этих липопротеинов. Данный факт согласуется с представлениями о наличии так называемого резидуального (остаточного) ССР у пациентов с целевыми значениями показателей липидного профиля [3][23].

Известно, что крупные частицы ЛВП обладают более высокой способностью к обратному транспорту ХС и более выраженной противовоспалительной активностью [7][8], тогда как мелкие субфракции ЛВП в определенных условиях могут подвергаться структурным и функциональным изменениям, утрачивая свои атеропротективные свойства и приобретая признаки так называемой "дисфункциональности" [10][24].

В ходе исследования установлено, что у пациентов с атеросклеротическим поражением БА распределение субфракционного спектра ЛВП характеризуются сниженной долей крупных частиц (ЛВП_1-3) и более высокой долей мелких (ЛВП_8-10). Аналогичные изменения ранее описаны при коронарном и каротидном атеросклерозе, а также при метаболических нарушениях, ассоциированных с повышенным ССР, включая перераспределение субфракционного спектра ЛВП у пациентов с клинически манифестным атеросклерозом [12][25-27]. Таким образом, полученные в настоящем исследовании данные дополняют существующие представления о перераспределении субфракционного спектра ЛВП при периферическом атеросклерозе, распространяя их на атеросклероз БА.

Особого внимания заслуживает анализ промежуточных субфракций ЛВП. В настоящем исследовании продемонстрировано, что вклад отдельных частиц промежуточного размера в развитие атеросклероза является неоднородным: доля ЛВП₆ и ЛВП₇ была выше у пациентов с атеросклерозом БА, тогда как у пациентов без атеросклеротического поражения преобладала субфракция ЛВП₄. При этом, при подсчете суммарной доли промежуточных субфракций достоверных различий между группами пациентов с наличием и отсутствием атеросклероза БА не наблюдалось. Данный факт позволяет предположить, что именно баланс между содержанием крупных и мелких частиц ЛВП играет ведущую роль в ассоциации с атеросклерозом БА, а обнаруженные изменения доли отдельных промежуточных субфракций ЛВП свидетельствуют о смещении субфракционного спектра ЛВП в сторону частиц с потенциально меньшей атеропротективной активностью.

Практическую значимость полученных данных подчёркивает выявленная ассоциация между соотношением мелких и крупных субфракций ЛВП и наличием атеросклероза БА. Установлено, что превышение найденного порогового значения этого соотношения ассоциировано с наличием атеросклероза данной локализации, а ROC-анализ продемонстрировал его удовлетворительную дискриминационную способность. Эти результаты позволяют рассматривать соотношение мелкие/крупные субфракции ЛВП как интегральный маркер, отражающий особенности субфракционного распределения ЛВП и потенциально применимый для дополнительной оценки ССР, особенно у пациентов с целевыми показателями липидного профиля.

В результате настоящего исследования показано, что у пациентов с атеросклерозом БА наличие ожирения ассоциируется с дополнительным проатерогенным смещением субфракционного спектра ЛВП: преобладают мелкие субфракции ЛВП, тогда как у пациентов без ожирения спектр обогащен крупными субфракциями. Вместе с тем, в многофакторном регрессионном анализе ожирение не продемонстрировало независимой ассоциации с наличием атеросклероза БА, что позволяет рассматривать данное состояние преимущественно как метаболический модификатор субфракционного распределения ЛВП, а не самостоятельный предиктор поражения БА. Полученные результаты согласуются с представлениями о влиянии ожирения на хроническое воспаление и гетерогенность ЛВП [9][28].

Таким образом, результаты настоящего исследования демонстрируют гетерогенность ЛВП по размеру частиц при атеросклерозе БА, которая не отражается при стандартной оценке показателей липидного профиля. Выявленное смещение распределения ЛВП в сторону уменьшения доли крупных и увеличения мелких частиц, а также связь соотношения мелкие/крупные ЛВП с наличием атеросклероза БА подчеркивают значение анализа субфракционного спектра липопротеинов для более точной оценки сосудистого риска у пациентов с периферическим атеросклерозом.

Ограничения исследования. Основным ограничением исследования является относительно небольшая выборка и невозможность на этапе пилотного исследования оценить все взаимосвязи субфракционного спектра ЛВП с имеющимися у исследуемых больных сопутствующими нозологиями, клинико-антропометрическими характеристиками, предшествующей терапией и другими факторами. Кроме того, высокая стоимость анализа субфракционного спектра ЛВП с использованием системы Lipoprint ограничивает возможность широкого и доступного применения данного метода исследования в качестве потенциального диагностического инструмента.

Заключение

В проведенном исследовании выявлены ассоциации между особенностями субфракционного спектра ЛВП и наличием атеросклеротического поражения БА. У пациентов с атеросклерозом БА отмечалось перераспределение субфракций ЛВП в сторону снижения доли крупных частиц и накопления мелких субфракций, что может косвенно отражать изменение функциональных и атеропротективных свойств ЛВП. Аналогичное перераспределение субфракционного профиля ЛВП выявлено у пациентов с ожирением.

Показано, что соотношение мелкие/крупные субфракции ЛВП статистически значимо ассоциировано с наличием атеросклероза БА, что указывает на потенциал использования данного показателя в качестве дополнительного маркера для более детальной оценки ССР у пациентов с подозрением на периферический атеросклероз, а также в качестве интегральной характеристики субфракционного распределения ЛВП в исследовательских и клинических наблюдательных моделях. Полученные данные также подчеркивают клиническую значимость учета ожирения как фактора, ассоциированного с перераспределением субфракционного спектра ЛВП в сторону менее атеропротективных свойств.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.