Роль микроРНК в оценке сердечно-сосудистого риска у пациентов с семейной гиперхолестеринемией

Введение

Одно из самых распространённых моногенных заболеваний человека — семейная гиперхолестеринемия (СГХС), гетерозиготная форма (HeFH). Согласно данным исследования ЭССЕ-РФ (Эпидемиология сердечно-сосудистых заболеваний в регионах Российской Федерации), частота заболевания составляет 1 на 173 человека [1]. Гомозиготная форма (HoFH) СГХС встречается значительно реже — предположительно 1 на 200-300 тыс. человек [2]. В большинстве случаев СГХС имеет аутосомно-кодоминантный тип наследования [3]. Причиной заболевания в большинстве случаев является наличие патогенного или вероятно-патогенного варианта в генах LDLR, APOB, PCSK9 [1]. Кроме того, заболевание может быть детерминировано не только редким вариантом, определяющим функцию белка, но и наличием нескольких полиморфизмов в разных генах, каждый из которых оказывает умеренное влияние на функцию белка [4].

Типичный фенотип больного СГХС — это высокий уровень холестерина (ХС) липопротеинов низкой плотности (ЛНП) с рождения и, как следствие, раннее развитие коронарного атеросклероза и ишемической болезни сердца (ИБС). Лица с диагнозом СГХС относятся к категории высокого или очень высокого риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), целевой уровень ХС ЛНП <1,8 или 1,4 ммоль/л, соответственно [5]. Для достижения целевых значений ХС ЛНП необходима гиполипидемическая терапия высокой интенсивности: статины в максимальной дозе, эзетимиб, ингибиторы PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, пропротеиновая конвертаза субтилизин-кексинового типа 9), а также бемпедоевая кислота — при непереносимости статинов или их неэффективности [6]. Кроме того, возможно проведение плазмафереза, плазмосорбции пациентам с HoFH и HeFH — при отсутствии возможности эффективного медикаментозного снижения выраженной гиперхолестеринемии и наличия дополнительных факторов риска ССЗ [5][7]. Без лечения у пациентов с СГХС может развиться тяжелая ИБС. По данным глобального регистра Европейского общества атеросклероза (FHSC, EAS Familial Hypercholesterolaemia Studies Collaboration) распространенность ИБС составила 17,4%, и у мужчин она встречалась приблизительно в 2 раза чаще, чем у женщин [8]. Известно, что СГХС может быть выявлена при дебюте ИБС. Улучшение ранней диагностики СГХС во всем мире позволит существенно снизить смертность от сердечно-сосудистых осложнений. Весьма актуален поиск новых биомаркеров заболевания для повышения качества скрининга новых пациентов. Важной задачей остается точная стратификация риска ССЗ у больных СГХС.

МикроРНК — это малые некодирующие молекулы рибонуклеиновой кислоты (длиной 18-24 нуклеотидов), посттранскрипционно регулирующие экспрессию генов [9]. Внеклеточные микроРНК защищены от деградации в кровотоке за счет включения в микровезикулы или экзосомы, а также за счет связи с липопротеинами высокой плотности (ЛВП) или комплексом AGO2 (Argonaute 2) [10]. МикроРНК можно выделить из различного биологического материала человека, например, цельной крови, сыворотки, плазмы, слюны, мочи или спинномозговой жидкости [11]. В последние годы все чаще проводятся исследования, в которых изучается влияние микроРНК на липидный обмен и атеросклероз [12]. Определенные микроРНК участвуют во всех этапах атерогенеза: от эндотелиальной дисфункции до разрыва бляшки [13].

Цель обзора — проанализировать результаты недавно опубликованных исследований, описывающих потенциальную роль микроРНК в оценке сердечно-сосудистого риска у пациентов с СГХС.

Методология исследования

Поиск литературных источников включал запросы в системах индексирования научных публикаций (Google Scholar, PubMed, eLIBRARY) по заголовкам, аннотациям и ключевым словам: "microRNA+familial hypercholesterolemia"/"microRNA+ FH"/"микроРНК+СГХС". В обзор были включены только оригинальные исследования, в которых представлен анализ экспрессии микроРНК у пациентов с СГХС за последние 10 лет. Критерии включения: оригинальные исследования, проведенные на людях; анализ экспрессии микроРНК у пациентов с подтвержденным диагнозом СГХС; наличие контрольной группы для сравнения. Критерии невключения: исследования с участием пациентов <18 лет; обзоры литературы, метаанализы и методические статьи; исследования in vitro или на животных моделях; работы без полнотекстового доступа; исследования, анализирующие микроРНК в контексте других липидных нарушений без отдельного анализа подгруппы СГХС; дублирующие публикации или исследования с недостаточным описанием методологии.

Результаты

Согласно анализу литературных источников, было отобрано 8 статей, посвященных исследованию экспрессии микроРНК у пациентов с СГХС (таблица 1). Размер выборок варьировался от 12 до 124 участников. В качестве биологического материала плазма использовалась в 4 исследованиях [14-17]. Другие типы биологического материала использовались только в одном из исследований: цельная кровь [18], сыворотка [19], гладкомышечные клетки коронарных артерий, микровезикулы и экзосомы плазмы [16], высвобождаемые гладкомышечными клетками коронарных артерий [14], внеклеточные везикулы плазмы (экзосомы, эктосомы, апоптотические тельца) [20], липопротеины высокой плотности (ЛВП) плазмы крови [21].

Большинство из рассматриваемых работ были проведены с помощью количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) в режиме реального времени с обратной транскрипцией [14-18][21], в двух использовалось секвенирование следующего поколения (NGS) [18][20] и микрочипы [15][19]. Количество изучаемых с помощью кПЦР микроРНК варьировалось от 2 до 30.

В 7 из 8 включенных в анализ исследованиях пациенты с СГХС имели гетерозиготную форму заболевания [14-17][19-21], в двух из них также были пациенты с гомозиготной формой СГХС [17][19]. В одном исследовании было 2 группы сравнения: пациенты с гомозиготной формой СГХС и здоровые участники [18]. В 6 из 8 исследований была включена группа из здоровых участников [14][16][18-20].

Всего суммарно в 8 исследованиях было изучено 73 разных микроРНК, только 14 из них были представлены в более чем одном исследовании (таблица 2). Наиболее часто встречалась miR-122 — в 5 исследованиях, miR-21 и miR-92a — в 3. Из 14 микроРНК по 6 не было получено значимых различий в обоих исследованиях: miR-146a-5p, miR-17-5p, miR-21-5p, miR-33a-5p, miR-143, miR-223. Для 7 микроРНК либо в исследованиях изучалась разная форма микроРНК (miR-143-5p и miR-143-3p), либо в одной из двух работ не указана конкретная форма микроРНК (miR-223, miR-122, miR-200c, miR-223, miR-24, miR-486, miR-92a).

Для 5 из 14 микроРНК (miR-126-3p, miR-133a-3p, miR-155-5p, miR-200c, miR-24), показавших связь с СГХС более чем в одном исследовании, уровень экспрессии оценивался только в двух исследованиях, в то время как значимые различия были получены только в одном из них. В связи с тем, что группы сравнения и биологический материал в этих работах различались, сравнить полученные результаты не представлялось возможным [22]. Согласно результатам различных исследований уровень экспрессии микроРНК, полученной из различных биообразцов, несопоставим даже при использовании образцов от одного и того же человека [23][24].

Только для 3 микроРНК (miR-122, miR-486, miR-92a) были получены значимые различия в уровне экспрессии в группах сравнения более чем в одном из исследований.

МикроРНК miR-122 была изучена в 5 исследованиях, однако в 2-х из них не указана конкретная форма микроРНК [16][21], а в 3-х не было найдено значимых различий между группами сравнений [16][17][21]. МикроРНК miR-122 выполняет различные функции, включая роль в апоптозе, воспалении, фиброзе, патологической гипертрофии и ремоделировании миокарда [25]. Для miR-122-5p показан повышенный уровень экспрессии в сыворотке в группе пациентов с СГХС по сравнению с контрольной группой здоровых участников [19]. Также был обнаружен более высокий уровень экспрессии для miR-122-5p во внеклеточных везикулах плазмы в группе пациентов с HeFH по сравнению с контрольной группой здоровых участников [20]. Однако, несмотря на повышенный уровень экспрессии в обоих исследованиях [19][20], разный биологический материал не позволяет сравнивать их между собой.

Для микроРНК miR-486 значимые различия были получены в двух исследованиях [18][21]. Ранее было показано, что при повышении уровня экспрессии miR-486 развивается гипертрофия мышц [26], а увеличение miR-486 в плазме у пациентов с острым инфарктом миокарда может отражать лежащую в основе гипертрофию сердца [27]. Повышенный уровень экспрессии miR-486 был обнаружен в ЛВП плазмы крови в группе пациентов с вариантом LDLR, приводящим к потере функции белка (LDLR-null) по сравнению с группой пациентов с вариантом гена LDLR, приводящим к частичной потере функции белка (LDLR-defective) [21]. Кроме того, повышенный уровень экспрессии был получен в группе пациентов с вариантом в гене LDLR и с атеросклеротическими ССЗ (АССЗ) (LDLR/АССЗ), а также в группе LDLR-null/без АССЗ по сравнению с группой LDLR-defective/без АССЗ. Повышенный уровень экспрессии miR-486-3p был выявлен в крови пациентов HoFH по сравнению с контрольной группой здоровых участников [18]. Оба исследования различались как по биологическому материалу, так и по группам сравнения пациентов.

Для микроРНК miR-92a значимые результаты были получены в 2-х [17][21] из 3-х исследований [14][17][21]. Согласно ранее опубликованным данным, повышение экспрессии miR-92a под действием окисленных ЛНП сопровождается дисфункцией эндотелия, что определяет ее участие в атерогенезе [28].

Описан повышенный уровень экспрессии miR-92a (без указания конкретной формы микроРНК) в ЛВП плазмы крови в группе пациентов LDLR-null по сравнению с группой LDLR-defective, а также в группе LDLR/АССЗ и в группе LDLR-null/без АССЗ по сравнению с группой LDLR-defective/без АССЗ [21]. Повышенный уровень экспрессии miR-92a-3p в плазме был получен в группе пациентов с HoFH по сравнению с группой HeFH [17]. В то же время, значимых различий в экспрессии miR-92a-3p между группами пациентов HeFH и здоровыми участниками показано не было [14].

Стоит отметить, что также было показано, что ЛВП-miR-486 и ЛВП-miR-92a были независимо связаны со скоростью пульсовой волны (СПВ) — инструментальным методом оценки жесткости артерий [21], которая является независимым фактором риска сердечно-сосудистых событий и смерти у пациентов с подозрением на ИБС [29]. У пациентов из группы LDLR-null СПВ была выше, чем у пациентов из группы LDLR-defective. Однако из-за ограничений исследования авторы не могли установить причинно-следственную связь и временную зависимость между ЛВП-miR-486 и ЛВП-miR-92a, с одной стороны, и возможными изменениями СПВ, с другой [21].

Одним из основных ограничений исследований, включенных в обзор, является отсутствие поправки на множественные сравнения, проведение которой необходимо при статистическом анализе в области количественной генетики [30]. Отсутствие поправки приводит к завышению уровня значимости и нахождению большого числа ложных ассоциаций. Ни в одной из рассмотренных выше работ поправка не была корректно проведена. Таким образом, обсуждаемые в настоящей работе различия в найденных ассоциациях могут объясняться тем, что большинство этих ассоциаций — ложные обнаружения по причине неудовлетворительного статистического анализа.

Так, Escate R, et al. упоминают необходимость поправки на множественные сравнения, однако не применяют её при анализе дифференциальной экспрессии микроРНК между группами [16]. Отсутствие поправки и сложный дизайн анализа ставят под сомнение валидность полученных результатов. В цитируемой работе исследовали две выборки: на первой искали микроРНК, экспрессия которых значимо ассоциирована с СГХС, на второй валидировали полученные ассоциации. Расчёт показывает, что применение стандартной поправки к валидационной выборке привело бы к потере статистической значимости всех заявленных ассоциаций (скорректированные р-значения были бы >0,05). Дополнительные методологические вопросы вызывает процедура отбора микроРНК, ассоциированных с сердечно-сосудистыми конечными точками, которая также проводилась без учёта множественных сравнений. В итоге получилось, что абсолютная концентрация микроРНК miR-133a разделила участников на две подгруппы, в которых при 8-летнем наблюдении было достигнуто 20 и 50% конечных точек, соответственно. Однако столь значимый размер эффекта, не подтверждённый в последующих независимых исследованиях, требует осторожной интерпретации.

Аналогичные методологические ограничения характерны и для Dlouha D, et al.: отсутствие поправки на множественные сравнения при анализе экспрессии микроРНК в различных группах; использование корреляционного анализа Пирсона на малой выборке (n=12) без должного обоснования нормальности распределения; отсутствие непараметрических методов, рекомендованных для анализа данных по экспрессии микроРНК [17]. Эти недостатки существенно снижают достоверность полученных результатов, что лишний раз подтверждает важность следования методологическим стандартам при изучении микроРНК.

Заключение

Использование уровней экспрессии микроРНК в качестве дополнительного критерия для стратификации сердечно-сосудистого риска у больных СГХС представляет собой перспективное направление фундаментальных исследований. Проведенный анализ опубликованных работ выявил существенные методологические ограничения, включая значительную разнородность в дизайне, проявляющуюся в различии сравниваемых групп, использовании различных типов биологического материала и нестандартизированных методов анализа. Серьезной проблемой является недостаточное внимание к статистической обработке данных, в частности отсутствие поправок на множественные сравнения и ограниченный размер выборок. Особую обеспокоенность вызывает низкая воспроизводимость результатов, поскольку большинство исследуемых микроРНК были описаны лишь в единичных работах без последующей независимой репликации. Все вышеперечисленное свидетельствует о необходимости проведения крупных исследований со строгой стандартизацией всех этапов работы — от унифицированных протоколов забора и биобанкирования образцов до централизованного лабораторного анализа с применением корректных статистических методов. Комплексный подход позволит точно оценить диагностическую и прогностическую ценность микроРНК у данной категории пациентов и открыть путь для их внедрения в клиническую практику.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.